CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家畜育種新材料創(chuàng)制中的研究進(jìn)展

王 歡，鄒惠影，朱化彬, 趙善江

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖(家禽)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

基因編輯技術(shù)(gene editing technology)是指可以對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯的技術(shù)[1]，該技術(shù)始于基因打靶技術(shù)，隨后經(jīng)歷了鋅指核酸內(nèi)切酶技術(shù)(zinc-finger nuclease, ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和規(guī)律性成簇間隔的短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白技術(shù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated, CRISPR/Cas)三次革命性的突破，基因定點(diǎn)修飾的效率不斷提高，給基因編輯技術(shù)的應(yīng)用帶來(lái)了全新的發(fā)展方向。第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，科研人員研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)不同Cas蛋白的序列和結(jié)構(gòu)之間的差異,可以將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3種類型，每種類型的CRISPR/Cas系統(tǒng)又可細(xì)分為A、B、C 3種亞型[2]，目前應(yīng)用最為廣泛的CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于Type II類、A型，其余類型的CRISPR/Cas系統(tǒng)由于免疫機(jī)制非常復(fù)雜，并未應(yīng)用于基因組工程中。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)來(lái)自于釀膿鏈球菌(streptococcus pyogenes)，即A群鏈球菌(group A streptococcus, GAS)和嗜熱鏈球菌(streptococcus thermophilus)，是現(xiàn)今應(yīng)用最為廣泛的可以靶向基因組DNA特定位點(diǎn)并進(jìn)行修飾的工具[3]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在不同物種以及多種細(xì)胞類型中進(jìn)行定點(diǎn)、精確的基因編輯。該系統(tǒng)具有應(yīng)用成本低、適用編輯范圍廣、打靶效率高、操作簡(jiǎn)單、可支持多位點(diǎn)操作等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于多種家畜高繁殖性狀、生產(chǎn)性能以及強(qiáng)抗病性狀的培育和改良、試驗(yàn)動(dòng)物疾病模型的構(gòu)建和病毒學(xué)等諸多領(lǐng)域[4]，并取得了許多重要成果。對(duì)于家畜育種而言，遺傳進(jìn)展慢和育種成本高是限制我國(guó)自主化良種家畜培育的“卡脖子”問(wèn)題。而新的基因精準(zhǔn)編輯技術(shù)的產(chǎn)生與應(yīng)用對(duì)家畜育種和疾病防控等產(chǎn)生了巨大和深遠(yuǎn)的影響。目前，家畜基因編輯育種已成為世界各國(guó)進(jìn)行技術(shù)和種質(zhì)資源創(chuàng)新的研究制高點(diǎn)，我國(guó)也先后在豬、牛等家畜品種中創(chuàng)建了基因編輯育種技術(shù)體系，創(chuàng)制了一批基因編輯牛羊育種新材料。本文就最新一代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在提高家畜繁殖性能、生產(chǎn)性能、抗病性能等方面的研究應(yīng)用進(jìn)行綜述，重點(diǎn)介紹該系統(tǒng)在家畜育種學(xué)研究中已取得的最新進(jìn)展，并就CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家畜育種應(yīng)用中現(xiàn)存的問(wèn)題及其應(yīng)用前景進(jìn)行簡(jiǎn)要論述。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程與研究現(xiàn)狀

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的研究始于20世紀(jì)80年代，隨著研究的一步步深入，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)不斷被人們所熟知并廣泛應(yīng)用(圖1)， 在應(yīng)用的過(guò)程中為強(qiáng)化系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)，消除自身存在的一些弊端，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)仍處于不斷被優(yōu)化的過(guò)程中，不斷的創(chuàng)新性研究推動(dòng)其發(fā)展成為一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的微生物學(xué)技術(shù)，在此過(guò)程中該技術(shù)的效率也在不斷提升。

1.1 CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展歷程

1987年，Ishino等[5]在研究K12型大腸桿菌中的堿性磷酸酶同工酶(alkaline phosphatase isozyme，IAP)時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了一種不知其功能的特殊的DNA回文序列。但直到2000年，Mojica等[6]才發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列在細(xì)菌中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，并將其命名為規(guī)律性成簇間隔的短回文重復(fù)序列，簡(jiǎn)稱：CRISPR。并且在這一過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)了一些與CRISPR位于同一基因簇的核酸酶，統(tǒng)稱為CRISPR-associated蛋白，即Cas蛋白。此后隨著科研人員研究的不斷深入，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)菌內(nèi)的作用機(jī)制被揭示，并于2012年成功在體外構(gòu)建了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA的精準(zhǔn)編輯[7-8]。2015年，Ran等[1]將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功應(yīng)用于小鼠體內(nèi)。此后CRISPR/Cas9系統(tǒng)邁入迅猛發(fā)展的時(shí)代，短短幾年時(shí)間便成功應(yīng)用于不同物種的多種領(lǐng)域。CRISPR/Cas9系統(tǒng)還被構(gòu)建成CRISPR/Cas9文庫(kù)，在體內(nèi)和體外實(shí)現(xiàn)功能性基因的篩選[9]。2017年，Xu等[10]將CRISPR文庫(kù)構(gòu)建在piggyBac載體上，在小鼠肝內(nèi)成功篩選到與肝癌相關(guān)的基因。

1.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的改造和優(yōu)化進(jìn)展

人類對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)不斷的研究推動(dòng)其發(fā)展成為一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的微生物學(xué)技術(shù)，為強(qiáng)化系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)和消除其自身存在的弊端，科研人員對(duì)其組成部分Cas9蛋白[11-12]和sgRNA[13]進(jìn)行了一系列的創(chuàng)新性改造(圖1)，以期達(dá)到提高Cas9保真性、效率、使用范圍以及降低脫靶效率等目的，多種多樣的變體正在不斷涌現(xiàn)。此外，為提高Cas9蛋白的效率，人們嘗試將Cas9蛋白的分子量縮小，先后發(fā)現(xiàn)的SpCas9、SaCas9、NmCas9等不同種屬的分子量更小的Cas9變體蛋白均已成功得到應(yīng)用[14-15]。但研究發(fā)現(xiàn)，它們依然存在一定的問(wèn)題，如CRISPR/SaCas9系統(tǒng)的活性不高，且需要復(fù)雜的啟動(dòng)相關(guān)的基因序列，因此，限制了該系統(tǒng)的使用范圍[16]。隨后，人們通過(guò)在Cas9核酸酶結(jié)構(gòu)域(RuvC)引入單堿基突變(D10A或H840A)使該結(jié)構(gòu)域發(fā)生失活進(jìn)而制備出僅能切割一條DNA鏈的Cas9切口酶(Cas9 nickase，Cas9n)。研究發(fā)現(xiàn)，將Cas9n與兩條不同的sgRNA結(jié)合使用，可以增加CRISPR/Cas9n系統(tǒng)的特異性，還可以增加基因編輯的使用范圍，實(shí)現(xiàn)較大基因片段的編輯[17]。當(dāng)Cas9兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(RuvC和HNH)都發(fā)生突變時(shí)，可以得到?jīng)]有切割活性只有結(jié)合活性的dCas9蛋白(nickase-dead Cas9，dCas9)，而CRISPR/dCas9系統(tǒng)可以在不損傷基因組DNA的情況下，在轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平對(duì)基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控[18]。此外，科研人員還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)控Cas9蛋白的活性也可有效提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種辦法可以成功調(diào)控Cas9的活性，包括改變運(yùn)輸方式和引入適體核酸(aptazyme)組件等，均可在一定程度上提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的效率[19-20]。

傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)都是通過(guò)引入DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSBs)從而進(jìn)行基因編輯的，這種方式容易導(dǎo)致過(guò)度的DNA損傷或細(xì)胞死亡[21]。隨著人們探索的不斷深入，2016年，Komor等[22]首次將胞嘧啶脫氨酶APOBEC1與CRISPR/Cas9系統(tǒng)融合，獲得可高效誘導(dǎo)DNA由胞嘧啶(cytosine, C)向胸腺嘧啶(thymine, T)單堿基轉(zhuǎn)換的系統(tǒng)，并將其命名為胞嘧啶單堿基編輯器(cytosine base editor, CBE)，該技術(shù)可在不發(fā)生雙鏈斷裂和沒(méi)有供體模板的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的編輯。2017年，Gaudelli等[23]又成功研發(fā)出可實(shí)現(xiàn)DNA由腺嘌呤(adenine, A)向鳥(niǎo)嘌呤(guanine, G)精確轉(zhuǎn)換的腺嘌呤單堿基編輯器(adenine base editor, ABE)。單堿基編輯器技術(shù)的問(wèn)世，實(shí)現(xiàn)了在不發(fā)生DNA雙鏈斷裂也不引入重組修復(fù)模板的情況下，對(duì)基因組的單個(gè)堿基進(jìn)行編輯的可能，使CRISPR/Cas9技術(shù)更加安全、高效和精準(zhǔn)。然而，Zuo等[24]和Jin等[25]分別在小鼠胚胎基因組和水稻基因組編輯中發(fā)現(xiàn)，CBE存在嚴(yán)重脫靶效應(yīng)。而這可能是因?yàn)槠毡榇嬖诘奈鍓A基對(duì)編輯窗口中存在不止一個(gè)C時(shí)，現(xiàn)有的堿基編輯器會(huì)產(chǎn)生不必要的C→T轉(zhuǎn)換的可能，進(jìn)而導(dǎo)致單堿基編輯有可能產(chǎn)生大量無(wú)法預(yù)測(cè)的脫靶突變，為此，科學(xué)家開(kāi)始嘗試提高單堿基編輯器的精度，從而降低脫靶效率，2018年， Gehrke等[26]設(shè)計(jì)了一種根據(jù)TCR>TCY>VCN層次結(jié)構(gòu)優(yōu)先對(duì)特定基序中胞嘧啶去氨基化的APOBEC3A-Cas9單堿基突變(APOBEC3A-Cas9 base editor)技術(shù)，通過(guò)密碼子優(yōu)化和加入額外的核定位序列，極大地降低了單堿基突變脫靶率和錯(cuò)誤率。2020年，Wang等[27]研發(fā)并驗(yàn)證了利用腺嘌呤堿基編輯介導(dǎo)的起始密碼子突變實(shí)現(xiàn)高效基因沉默(i-Silence)的新方法，該方法通過(guò)單堿基編輯器介導(dǎo)起始密碼子從ATG突變到GTG或ACG，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因沉默。研究表明，該方法可以在不產(chǎn)生不必要編輯的情況下精確地誘導(dǎo)目標(biāo)基因沉默，是更安全、高效的基因敲除方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

在降低脫靶效率方面，2019年，Zuo等[24]首先建立了新型脫靶檢測(cè)技術(shù)GOTI(genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection)，以此來(lái)提升基因編輯技術(shù)脫靶檢測(cè)的敏感性，尤其是在發(fā)現(xiàn)基因編輯完全隨機(jī)的脫靶位點(diǎn)上具有更高的準(zhǔn)確性。2019年，Anzalone等[28]成功研發(fā)了一種超精確的新型基因編輯工具并將其命名為Prime Editor，該工具可將Cas9切口酶和反轉(zhuǎn)錄酶融合在一起，反轉(zhuǎn)錄酶可以依據(jù)提供的模板序列將突變精確寫(xiě)入到靶位點(diǎn)。Prime Editor技術(shù)在不需要依賴供體模板和DNA雙鏈斷裂的情況下，實(shí)現(xiàn)了所有4種 單堿基的自由轉(zhuǎn)換，在該研究中實(shí)現(xiàn)了44個(gè)堿基的插入和80個(gè)堿基的刪除。Prime Editor技術(shù)的問(wèn)世有效解決了單堿基編輯器存在的不能隨意編輯所有堿基以及較為嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)的問(wèn)題，同時(shí)，極大地提高了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的使用范圍、編輯準(zhǔn)確度和效率。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的作用機(jī)理

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因座主要包括以下幾部分： CRISPR相關(guān)蛋白基因座(CRISPR Cas genes)、前導(dǎo)序列(leader)以及由不連續(xù)的重復(fù)序列(repeat)和間隔序列(spacers)間隔排列組合而成的 CRISPR 簇(CRISPR array)[1]，見(jiàn)圖2。

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)理

當(dāng)病毒侵染細(xì)菌時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)主要通過(guò)以下幾個(gè)步驟發(fā)揮作用(圖3)。適應(yīng)階段:宿主捕獲、識(shí)別到病毒的外源DNA中由NGG(N為任意堿基)3～7個(gè)堿基組成的，主要參與Cas蛋白識(shí)別外源基因工作的原間隔序列(protospacer adjacent motif，PAM)，并將病毒DNA整合到CRISPR簇中，形成重復(fù)序列。轉(zhuǎn)錄階段:當(dāng)宿主再次檢測(cè)到入侵者時(shí)，首先，CRISPR簇轉(zhuǎn)錄生成前體RNA轉(zhuǎn)錄物(pre-CRISPR RNA，pre-crRNA)，與此同時(shí)獲得反式激活的CRISPR重復(fù)區(qū)互補(bǔ)的反式編碼RNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)，隨后，pre-crRNA與tracrRNA結(jié)合進(jìn)一步加工為成熟的、較小的、能夠發(fā)揮功能的crRNA。干擾階段：crRNA和tracrRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，Cas蛋白在雙鏈RNA的介導(dǎo)下識(shí)別再次入侵的病毒DNA靶序列，并對(duì)靶序列進(jìn)行切割和降解。研究發(fā)現(xiàn)，盡管不同種CRISPR/Cas系統(tǒng)的Cas蛋白不盡相同，但是當(dāng)病毒入侵細(xì)菌時(shí)所有的CRISPR/Cas系統(tǒng)大多通過(guò)以上3個(gè)步驟來(lái)抵御入侵。

研究發(fā)現(xiàn)，只有成熟的crRNA和tracrRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)后，才能引導(dǎo)Cas9蛋白靶向到基因的特定位點(diǎn)，發(fā)揮內(nèi)切酶活性進(jìn)行切割[8]。為操作方便，科學(xué)家將crRNA和tracrRNA進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑欤铣梢粭l單鏈RNA，即單鏈引導(dǎo)RNA(single guide RNA，sgRNA)，從而將CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡(jiǎn)化為兩部分：sgRNA和Cas9蛋白，其中，作為應(yīng)用最為廣泛的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，它的工作原理(圖4)：1)具有核酸酶活性的Cas9蛋白在sgRNA的引導(dǎo)下，特異性識(shí)別原間隔序列相鄰基序。2)當(dāng)Cas9蛋白靶向到靶DNA指定位點(diǎn)后，發(fā)揮核酸酶作用，完成對(duì)DNA雙鏈的切割，造成雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)。3)當(dāng)靶DNA雙鏈斷裂后，細(xì)胞啟動(dòng)自我修復(fù)機(jī)制，利用非同源末端連接修復(fù)(non-homology end joining，NHEJ)和同源重組修復(fù)(homology dependent repair，HDR)兩種方式對(duì)基因進(jìn)行修復(fù)。在此環(huán)節(jié)，科研人員引入外源基因，通過(guò)同源重組的方式將目的基因整合到靶基因中，隨后，外源基因便可在受體細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯的效果[21]。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家畜育種新材料創(chuàng)制中的研究進(jìn)展

CRISPR/Cas9系統(tǒng)自問(wèn)世以來(lái)，廣泛應(yīng)用于微生物、動(dòng)植物等諸多物種，展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。家畜基因編輯育種已成為世界各國(guó)進(jìn)行技術(shù)和種質(zhì)資源創(chuàng)新的研究制高點(diǎn)，我國(guó)也先后在豬、牛等家畜品種中創(chuàng)建了基因編輯育種技術(shù)體系，創(chuàng)制了一批基因編輯牛、羊、豬等育種新材料(表1)，在培育具有世界競(jìng)爭(zhēng)力的家畜品種，提高我國(guó)畜牧產(chǎn)業(yè)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力等方面具有重大的應(yīng)用前景。

3.1 在高繁殖力育種新材料創(chuàng)制中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的問(wèn)世，為解決家畜諸多方面尤其是繁殖方面的問(wèn)題提供了全新的思路和方法，但是對(duì)于豬、牛、羊等大型家畜來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在育種、繁殖方面的應(yīng)用進(jìn)展緩慢，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)的問(wèn)世，極大程度地改變了這一局面，科研人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在不同家畜的繁殖育種方面均取得了突破性進(jìn)展[29-31]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以高效地操縱特定基因，根據(jù)需求實(shí)現(xiàn)物種內(nèi)品種間的一個(gè)或多個(gè)主效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到高效育種、繁殖的目的，有效提高牧場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。

研究發(fā)現(xiàn)，在雌性動(dòng)物卵泡發(fā)育過(guò)程中BMP15和GDF9基因均扮演重要角色，馮萬(wàn)有[29]利用CRISPR/Cas9靶向基因編輯技術(shù)突變BMP15和GDF9基因，進(jìn)而提高水牛繁殖性能。Xist是一種非編碼RNA，可以使雌性小鼠的兩條X染色體中的一條失活，它在克隆小鼠胚胎中X(Xa)染色體上的異位表達(dá)嚴(yán)重影響了克隆效率。2010年，Inoue等[30]通過(guò)敲除雄性體細(xì)胞Xist成功將克隆效率提高了8～9倍。Matoba等[31]通過(guò)RNAi降低了克隆胚胎中Xist的表達(dá)水平，將克隆效率提高了10倍以上。相信將來(lái)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)Xist的精確編輯將有效提高家畜Xist的敲除效率，進(jìn)一步提高家畜克隆效率。

3.2 在高生產(chǎn)性能育種新材料創(chuàng)制中的應(yīng)用

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除或敲入可極大改良家畜的生產(chǎn)性能，在改善肉品質(zhì)、提高產(chǎn)肉量和提升被毛質(zhì)量等方面都具有顯著成效。

IGF2 是重要的胰島素樣生長(zhǎng)因子，對(duì)家畜胚胎和出生后的生長(zhǎng)及肌肉細(xì)胞增殖均有重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，IGF2經(jīng)由肝產(chǎn)生后作用于靶細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和分化[32]。2018年，Xiang等[33]使用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯IGF2內(nèi)含子3的3 072位點(diǎn)，獲得了在該調(diào)控元件周圍12個(gè)不同等位基因發(fā)生突變的豬，該豬及子代豬在不影響肉質(zhì)的情況下生長(zhǎng)速度顯著提高，通過(guò)該試驗(yàn)可提高巴馬豬的產(chǎn)肉量，且首次證明編輯非編碼區(qū)域可以改善家畜的經(jīng)濟(jì)性狀。2019年，Liu等[34]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在中國(guó)本土豬品種梁光小斑點(diǎn)豬的豬胚胎成纖維細(xì)胞(PEFs)中，對(duì)IGF2內(nèi)含子3中ZBED6結(jié)合位點(diǎn)基序有效破壞，從而有效提高了該品系的瘦肉率，具有重要的商業(yè)價(jià)值。肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)廣泛存在于豬、牛、羊等動(dòng)物體內(nèi)，起到抑制骨骼肌發(fā)育和生長(zhǎng)的作用，可以顯著增加肌纖維的直徑、提高肌纖維數(shù)量[35]，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β superfamily，TGF-β)超家族。研究表明，MSTN的基因功能異常是導(dǎo)致動(dòng)物具有雙肌性狀的遺傳基礎(chǔ)[36]。2014年，Ni等[37]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在山羊原代成纖維細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯，獲得了同時(shí)敲除肌肉生長(zhǎng)抑制素、核孔蛋白 155(NUP)、朊蛋白(PrP)和β-乳球蛋白(BLG)4個(gè)基因的單克隆細(xì)胞系，成功獲得了MSTN敲除羊，為改良羊肉品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。2015年，Wang等[38]成功敲除山羊MSTN使之呈現(xiàn)雙肌表型，從而加速了優(yōu)質(zhì)山羊的培育進(jìn)程。隨后，張駒[39]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)山羊的MSTN基因進(jìn)行敲除，同時(shí)，在一特定位點(diǎn)中插入了Fat-1基因以替代MSTN基因，從而得到了既可以在體內(nèi)高表達(dá)Fat-1基因，又有效提升羊肉中ω-3含量，還能增加羊肉產(chǎn)量的絨山羊。此后，諸多科學(xué)家利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除MSTN，成功培育出高產(chǎn)肉量的豬、牛、羊[40-41]。

毛皮一直是牧場(chǎng)經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源的一個(gè)重要方面，如何有效提高家畜毛皮質(zhì)量一直是牧場(chǎng)及科研工作者探索的方向。隨著控制家畜毛皮基因的不斷發(fā)現(xiàn)，使利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)快速提升家畜毛皮質(zhì)量成為可能。2015年，Wang等[40]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了山羊的FGF5和MSTN基因，獲得了被毛長(zhǎng)度顯著增加、且呈現(xiàn)雙肌表型特點(diǎn)的山羊個(gè)體，該試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了在山羊體內(nèi)同時(shí)敲除多個(gè)基因，為獲得優(yōu)質(zhì)絨山羊提供了新的思路和理論依據(jù)。Zhang 等[42]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯毛色基因ASIP，首次獲得不同毛色的遺傳修飾綿羊。在規(guī)模養(yǎng)殖中，牛角的存在極易造成牛只的意外傷害甚至流產(chǎn)，而傳統(tǒng)的去角方法不僅給牛只帶來(lái)巨大痛苦還會(huì)造成牛只出現(xiàn)嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，不僅不符合動(dòng)物福利還會(huì)給牧場(chǎng)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失[43]。因此，科研人員致力于通過(guò)現(xiàn)代基因編輯技術(shù)進(jìn)行無(wú)角牛的培育。研究發(fā)現(xiàn)，控制無(wú)角性狀的基因位于1號(hào)染色體，為202 bp的重復(fù)，被稱為Pc(polledness of celtic origin)位點(diǎn)。該位點(diǎn)與牛的生產(chǎn)性能等均不相關(guān)，具有較為簡(jiǎn)單的遺傳性，比較適合進(jìn)行基因編輯。2020年，谷明娟等[44]利用CRISPR/Cas9技術(shù),將Pc位點(diǎn)P202ID基因型定點(diǎn)整合到有角蒙古牛(bostaurus)胎兒成纖維細(xì)胞基因組中,得到4株定點(diǎn)整合入細(xì)胞基因組的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。該試驗(yàn)為培育無(wú)角體細(xì)胞克隆牛提供了試驗(yàn)材料和技術(shù)支撐,為研究牛角的發(fā)生發(fā)育機(jī)制提供了基礎(chǔ)材料。

3.3 在抗病育種新材料創(chuàng)制中的應(yīng)用

家畜疾病如瘋牛病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟等一直給養(yǎng)殖人員造成巨大的困擾，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，疾病已然成為制約畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素之一。不僅如此，某些家畜疾病及其不當(dāng)治療在一定程度上還會(huì)對(duì)人類的生命安全造成影響，如人畜共患病的暴發(fā)、食品質(zhì)量安全、藥物殘留等問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，很多家畜疾病依靠防疫和藥物治療等傳統(tǒng)方法無(wú)法得到解決。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，科研人員發(fā)現(xiàn)，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于抗病家畜的制備具備良好的應(yīng)用前景。

2016年，Bevacqua等[45]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在牛胎兒成纖維細(xì)胞和IVF胚胎中誘導(dǎo)引起瘋牛病的PRNP基因的敲除和等位基因的敲入，為治愈瘋牛病奠定了基礎(chǔ)。2017年，Gao等[46]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組技術(shù)證明了單個(gè)Cas9n誘導(dǎo)的單鏈斷裂可以刺激自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白-1 (NRAMP1)基因的插入，顯著降低了脫靶效應(yīng)發(fā)生的機(jī)率，同時(shí)通過(guò)體細(xì)胞核移植，獲得了增加抵抗結(jié)核病能力的轉(zhuǎn)基因牛。豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的接觸性傳染病，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[47]。研究發(fā)現(xiàn)，CD163是PRRSV侵染的主要受體，它很大程度上決定了病毒對(duì)細(xì)胞的敏感性[48]。隨后，人們對(duì)其進(jìn)行研究，以期獲得抗PRRSV的豬。2019年，Chen等[49]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合供體載體，將豬CD163的第7外顯子替換為人CD163-like 1 (hCD163L1)的相應(yīng)外顯子，顯著抑制了PRRSV病毒的復(fù)制，保護(hù)豬免受HP-PRRSV感染，該研究為利用基因編輯技術(shù)培育抗PRRSV豬提供了新的方向。豬瘟(classical swine fever, CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬行業(yè)發(fā)展的疾病之一，具有極大的危害性和普遍性。2018年，Xie等[50]通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的敲入策略將篩選出的能有效抑制豬瘟病毒復(fù)制的shRNA基因精確地整合到了豬內(nèi)源Rosa26位點(diǎn)，從而獲得了抗CSFV豬，試驗(yàn)證明，利用該方法可有效限制CSFV 在豬體內(nèi)的復(fù)制表達(dá)，同時(shí)還減輕了CSF的臨床癥狀，降低了死亡率，并且發(fā)現(xiàn)，抗CSFV豬還可以將抗病性穩(wěn)定地傳給F1代，該試驗(yàn)為防治豬瘟提供了新的思路。

3.4 在基因修飾疾病模型制備中的應(yīng)用

利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可快速建立和模擬基因突變的動(dòng)物或細(xì)胞模型，從而揭示基因突變與生物功能發(fā)生變化的關(guān)系，同時(shí)通過(guò)構(gòu)建動(dòng)物模型也可揭示與疾病相關(guān)基因的具體功能，為治療家畜乃至人類疾病提供理論基礎(chǔ)[51]。2014，Hai等[52]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)vWF進(jìn)行編輯，成功構(gòu)建出血管性血友病動(dòng)物模型，為該病的發(fā)病機(jī)制、遺傳基礎(chǔ)以及治療方法的研究提供了很好的試驗(yàn)動(dòng)物模型。2017年，Huang等[53]將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于美國(guó)巴馬小型豬，同時(shí)靶向敲除載脂蛋白E (apo lipoprotein E,ApoE)和低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLR)基因，成功獲得雙等位基因敲除豬，所構(gòu)建的動(dòng)物模型對(duì)治療人類心血管疾病和相關(guān)轉(zhuǎn)化研究具有重要參考意義。2018年，Yan等[54]利用CRISPR/Cas9基因編輯和體細(xì)胞核移植技術(shù)，成功培育出世界首例人突變亨廷頓基因(HTT)敲入豬，精準(zhǔn)地模擬出人類神經(jīng)退行性疾病，成功建立了神經(jīng)退行性疾病亨廷頓病豬疾病模型。同年，Zhu等[55]結(jié)合 CRISPR/Cas9和體細(xì)胞核移植技術(shù)，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入迷你豬，為研發(fā)治療亨廷頓舞蹈癥新藥提供了穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。

此外，基因修飾豬是解決移植器官短缺的重要途徑，豬的異種器官移植一直是科學(xué)家探索的方向，但是豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERVs)跨物種傳播對(duì)人體來(lái)說(shuō)存在患新型疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)。2017年，Niu等[56]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬原代細(xì)胞系中滅活了所有的PERV，并通過(guò)體細(xì)胞核移植成功獲得了PERV滅活豬，一舉解決臨床異種移植的安全性問(wèn)題。

表1 CRISPR/Cas9基因編輯家畜育種新材料

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的問(wèn)題

隨著基因編輯技術(shù)的日趨成熟，畜牧行業(yè)的發(fā)展將會(huì)更多地應(yīng)用到基因編輯技術(shù)尤其是最新一代的CRISPR/Cas9系統(tǒng)[57-61]。但同時(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還存在一些問(wèn)題正制約著其發(fā)展和應(yīng)用，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)PAM序列有較高的依賴性、存在較為嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)、還容易導(dǎo)致過(guò)度的DNA損傷等一系列的技術(shù)安全性問(wèn)題，這就給基因編輯技術(shù)在家畜應(yīng)用上帶來(lái)了一系列的爭(zhēng)議。如何規(guī)范基因編輯動(dòng)物的制備和生產(chǎn)，如何使大眾對(duì)基因編輯動(dòng)物放心、安心，已逐漸成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。筆者認(rèn)為若想有效解決這一問(wèn)題則需要政府有關(guān)部門(mén)建立一套更加適合基因編輯動(dòng)物的健全的安全監(jiān)管體系，在保障基因編輯動(dòng)物安全生產(chǎn)應(yīng)用的同時(shí)也要確保基因編輯動(dòng)物的安全審批效率，這不僅有利于規(guī)范市場(chǎng)還可以為基因編輯技術(shù)在我國(guó)的發(fā)展提供良好的環(huán)境，進(jìn)而更加高效、便捷、安全地應(yīng)用于家畜生產(chǎn)，促進(jìn)我國(guó)畜牧行業(yè)更好更快的發(fā)展。

5 前景展望

目前，我國(guó)已經(jīng)先后啟動(dòng)了多項(xiàng)種質(zhì)自主培育聯(lián)合攻關(guān)重大專項(xiàng)，力求突破一批關(guān)鍵技術(shù)，培育出具有世界競(jìng)爭(zhēng)力的家畜品種，降低我國(guó)對(duì)家畜核心種質(zhì)的對(duì)外依存度，提高我國(guó)種業(yè)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的產(chǎn)生與應(yīng)用是生命科學(xué)的又一次技術(shù)革命，對(duì)育種和疾病防控等研究產(chǎn)生了巨大和深遠(yuǎn)的影響。相信隨著基因編輯技術(shù)效率的不斷提高，CRISPR/Cas9技術(shù)將會(huì)在家畜育種新材料創(chuàng)制等方面發(fā)揮更重要的作用。