TOP2A基因改變和蛋白表達在浸潤性乳腺癌中的臨床意義

丁文雙，劉國榮，李秀博,常麗君，嚴 青,杜 洪

(廣州市第一人民醫(yī)院暨華南理工大學附屬第二醫(yī)院 病理科，廣東 廣州 510045)

DNA拓撲異構(gòu)酶IIα(Topoisomerase II-alpha，TOP2A)是DNA代謝過程的重要核酶，對應編碼基因為TOP2A，其主要通過降低DNA超螺旋結(jié)構(gòu)參與基因復制、細胞周期調(diào)控等功能。TOP2A蛋白在腫瘤組織中表達明顯高于正常組織，因此TOP2A成為抗癌藥物研發(fā)的重要靶點。TOP2A蛋白抑制劑代表藥物有阿霉素、柔紅霉素等蒽環(huán)類藥[1-2]。蒽環(huán)類藥物是浸潤性乳腺癌術(shù)后輔助化療的基礎(chǔ)藥物之一，然而不是所有乳腺癌患者均對蒽環(huán)類藥物敏感，且該類化療藥物有明顯的心臟毒性和誘發(fā)多種髓系腫瘤和急性白血病的毒副作用[3-5]。如何從乳腺癌患者中篩選出對蒽環(huán)類藥物敏感的群體成為臨床研究的熱點，多個臨床中心藥物試驗顯示伴HER2和TOP2A共擴增的浸潤性乳腺癌患者能從含蒽環(huán)類藥物化療方案中明顯獲益[6-8]。換言之，HER2和TOP2A共擴增是指導臨床選擇蒽環(huán)類化療藥的敏感指標。

目前檢測TOP2A基因擴增主要依靠熒光原位雜交(FISH)，鑒于FISH檢測成本和技術(shù)普及問題，本研究用更普及的免疫組化法(IHC)檢測TOP2A蛋白表達，通過分析TOP2A蛋白表達與TOP2A基因改變的一致性，探討IHC法檢測TOP2A表達在初篩HER2和TOP2A共擴增乳腺癌病人中的價值。同時本實驗還對TOP2A蛋白表達與浸潤性乳腺癌相關(guān)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進行回顧性研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院病理科2018年1月至2020年8月檢測的浸潤性乳腺癌177例，其中導管內(nèi)癌不納入該研究，回顧性分析每例浸潤性乳腺癌相關(guān)臨床病理特征包括年齡、腫瘤分級、病理組織學分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR表達、HER2狀態(tài)及Ki-67增殖指數(shù)。本組病例發(fā)病年齡28～92歲(中位年齡54歲)，按2011 St Gallen改良基于免疫組化的分子分型：Luminal A型59例(33%，59/177)，Luminal B型77例(44%，77/177)，HRE2陽性型22例(12%，22/177)，三陰型19例(11%，19/177)。HRE2擴增38例(21.5%，38/177)，HRE2無擴增139例(78.5%，139/177)。

1.2TOP2A熒光原位雜交及判讀標準 標本經(jīng)4%中性甲醛液固定，石蠟包埋切片(厚度=3 μm)經(jīng)脫蠟、水化后滴加80 μL胃蛋白酶(廣州安必平)，37 ℃孵育消化20 min；70%、95%及100%梯度酒精脫水；加探針(TOP2A，廣州安必平)50 μL，加蓋玻片入雜交儀變性5 min，37 ℃雜交過夜；洗脫蓋片，干燥后滴加10μL DAPI，熒光顯微鏡下觀察計數(shù)。TOP2A判讀標準：TOP2A/GEP17信號比>2為擴增，TOP2A/GEP17信號比<0.8為缺失[9]。

1.3 TOP2A免疫組織化學染色及判讀標準 標本經(jīng)4%中性甲醛液固定，石蠟包埋切片(厚度=3 μm)常規(guī)脫蠟水化，免疫組織化學染色均采用Leica全自動免疫組化染色機(設(shè)備型號：BenchMark ULTRA型)，TOP2A抗體(廣州安必平，即用型，克隆號：MyR1)。由于TOP2A蛋白表達半定量分析無統(tǒng)一參考標準，本研究從著色強度和陽性細胞比例兩方面共同評價TOP2A蛋白表達：依著色強度弱-強分別標記為+-+++，對應分值分別為1、2、3分；隨機選取10個浸潤性癌高倍鏡視野(400倍)，記錄陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)比例，0%～25%、26%～50%、51%～75%，76%～100%對應分值分別為1、2、3、4；總分值=著色強度×陽性細胞比例，其中1～6分為TOP2A蛋白低表達，7～12分為TOP2A蛋白高表達。

1.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，TOP2A基因與TOP2A蛋白表達一致性檢驗采用Kappa檢驗，TOP2A蛋白表達在浸潤性乳腺癌各臨床病理參數(shù)中的表達差異采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1TOP2A熒光原位雜交結(jié)果TOP2A基因改變共28例(14.1%，28/177)，其中TOP2A基因擴增22例(10.7%)，TOP2A基因缺失6例(3.4%)。TOP2A基因改變(包括擴增或缺失)主要發(fā)生于HRE2擴增組(63.2%，24/38)，差異有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表1)。其中HER2和TOP2A共擴增19例(50%，19/38，見圖1A、B)。

表1 TOP2A基因改變與HER2基因改變關(guān)系

2.2 TOP2A免疫組織化學染色結(jié)果 80例可繼續(xù)研究組織行TOP2A免疫組化檢測，TOP2A蛋白陽性信號定位于細胞核，著色為棕黃色。按著色強度分為“+-+++”三級，其中“+”著色共21例(26.3%，21/80)，“++”著色共38例(47.5%，38/80)，“+++”著色共21例(26.3%，21/80)；TOP2A陽性細胞表達比例5%～100%不等，其中表達比例0%～25%共31例(38.8%，31/80)，26%～50%共17例(21.3%，17/80)，51%～75%共15例(18.8%，15/80)，76%～100%共17例(21.3%，17/80)；TOP2A蛋白高表達25例(31.3%，25/80)，TOP2A蛋白低表達55例(68.7%，55/80)，見圖1C、D。

A：HER2擴增，HER2探針紅色，GEP17青色，紅色信號成簇狀擴增(FISH × 1000)；B：TOP2A擴增，TOP2A探針綠色，GEP17青色，TOP2A/GEP>2(FISH × 1000)；C：TOP2A蛋白高表達，棕黃色強信號定位于細胞核，陽性細胞比例80%(IHC × 200)；D：TOP2A蛋白低表達，棕黃色中等信號定位細胞核，陽性細胞比例20%(IHC × 200)。

2.3 TOP2A蛋白表達與TOP2A基因改變一致性結(jié)果 免疫組化顯示共25例TOP2A蛋白高表達，其中16例FISH結(jié)果為擴增。兩種不同實驗方法的一致性Kappa值為0.536(見表2 ,P<0.05)。

表2 TOP2A蛋白表達與TOP2A基因改變一致性結(jié)果

2.4 TOP2A蛋白表達與浸潤性乳腺癌相關(guān)臨床病理特征關(guān)系 TOP2A蛋白高表達率在HRE2擴增組為56.3%(P<0.01)，在HRE2和TOP2A共擴增組為84.2%(P<0.01)，TOP2A蛋白表達在不同年齡、腫瘤T分期、組織學分級、淋巴結(jié)狀態(tài)、分子分型、ER、PR組間差異無明顯統(tǒng)計學意義(見表3)。

表3 TOP2A蛋白表達與臨床病理特征相關(guān)性

3 討論

乳腺癌是危及全球女性健康最常見腫瘤之一。2011年St Gallen國際乳腺癌會議時專家組提出了基于免疫組化檢測ER、PR、HER2及Ki-67表達的乳腺癌分子改良分型系統(tǒng)，各分子亞型對應不同的臨床治療策略[10]。蒽環(huán)類藥物是TOP2A蛋白的活性抑制劑，TOP2A與HER2毗鄰位于17號染色體長臂，兩者的基因改變具有一定協(xié)同性，學者們推測伴HER2擴增的乳腺癌患者能從蒽環(huán)類化療方案中獲益與HER2和TOP2A基因共擴增有關(guān)，該結(jié)論在后續(xù)的多個臨床藥物試驗或臨床數(shù)據(jù)薈萃分析中得到證實[6,11-12]。病理診斷工作中篩選HER2和TOP2A基因共擴增乳腺癌亞群具有重要的臨床意義，依據(jù)此分子改變可優(yōu)化乳腺癌患者的化療方案，對不必應用蒽環(huán)類化療藥物的患者，可避免應用蒽環(huán)類藥物而產(chǎn)生嚴重的細胞毒性反應。

FISH是檢測HER2和TOP2A基因擴增的可靠手段之一。本研究中利用該方法檢測HER2和TOP2A基因共擴增比例為50%，文獻報道HER2和TOP2A基因共擴增比例約30%～50%，本研究數(shù)據(jù)與文獻報道一致。同時本研究中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)HER2正常組中3例伴TOP2A擴增，文獻報道HER2正常組通常不伴有TOP2A擴增[6-7]，該差異可能因TOP2A擴增判讀標準差異或不同廠家探針引起。Varga等報道不同生產(chǎn)廠商探針檢測同一批病例TOP2A擴增結(jié)果不一致(36% vs 26%)，HER2基因與TOP2A基因位置毗鄰，TOP2A基因探針覆蓋目標基因片段過長可同時覆蓋到HER2基因，對HER2基因擴增而TOP2A基因無擴增病例造成假陽性判斷[9]。針對TOP2A擴增而HER2正常的病例，建議更換不同廠家探針進行驗證。

鑒于FISH檢測成本和技術(shù)普及問題，本實驗利用更為普及的免疫組化法檢測TOP2A蛋白表達，探討TOP2A蛋白表達在初篩HER2和TOP2A共擴增病人中的價值。結(jié)果顯示兩種不同檢測手段檢測TOP2A表達有中度相關(guān)性(Kappa值0.536)，由于本研究中TOP2A蛋白高表達病例較少，兩者一致性評價需積累更多病例進一步證實。本研究的結(jié)論與部分文獻報道數(shù)據(jù)有一定差異，如Varga等研究發(fā)現(xiàn)TOP2A蛋白表達與TOP2A基因擴增無明顯一致性，作者用免疫組化方法檢測TOP2A蛋白表達發(fā)現(xiàn)9.5%(4/42)樣本陽性信號<10%，而90.5%(38/42)樣本信號>10%(平均50%～80%)，該差異與判定TOP2A蛋白表達的標準不同有關(guān)[9]。

本研究首次從著色強度和陽性細胞占比兩方面半定量分析TOP2A蛋白表達，TOP2A蛋白高表達在HER2和TOP2A共擴增組中比例為84.2%，該結(jié)果提示從著色強度和陽性細胞占比兩方面半定量評價TOP2A蛋白表達可一定程度預測TOP2A和HER2共擴增狀態(tài)。本實驗另發(fā)現(xiàn)TOP2A基因無擴增組也存在部分TOP2A蛋白高表達病例(17%)，這表明TOP2A蛋白表達除了受TOP2A基因調(diào)控外，還會受其他轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[13]。國內(nèi)外學者對TOP2A蛋白表達在浸潤性乳腺癌中的意義進行探討，O'Malley等對一組伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的浸潤性乳腺癌患者(n=477)TOP2A蛋白研究發(fā)現(xiàn)，TOP2A高表達組(陽性細胞比例>13%)可從含蒽環(huán)類化療藥物方案(環(huán)磷酰胺+表柔比星+五氟尿嘧啶，CEF)中明顯獲益，無病進展期和總體生存率均明顯高于CMF化療方案組，這提示TOP2A蛋白高表達可作為臨床篩選含蒽環(huán)類化療方案的標記物。國內(nèi)劉麗娟等報道TOP2A蛋白表達與Ki-67增殖指數(shù)相關(guān)，且TOP2A蛋白高表達病人預后較差[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67高增殖指數(shù)組TOP2A蛋白高表達率高于Ki-67低增殖指數(shù)組，但差異無明顯統(tǒng)計學意義，TOP2A蛋白表達與其他相關(guān)臨床病理特征無明顯相關(guān)性。

綜合所述，TOP2A蛋白可一定程度初篩TOP2A和HER2共擴增狀態(tài)。建議診斷工作中常規(guī)開展TOP2A蛋白免疫組化檢測，通過著色強度、比例兩方面半定量評價TOP2A蛋白表達，對TOP2A高表達病例建議行TOP2A基因檢測，以更好指導后續(xù)臨床用藥。