鹽膚木葉藥用成分影響因素的研究

胡克特，張 萍，陳榮祥,3，顧 丁

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563099；2遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院,貴州 遵義 563000；3遵義市理化分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心，貴州 遵義 563000)

鹽膚木(RhuschinensisMills)為漆樹(shù)科鹽膚木屬(Rhus)落葉小喬木，是我國(guó)重要的林業(yè)經(jīng)濟(jì)植物[1]，其莖和根常用于制作中藥[2-3]，鹽膚木葉具有化痰止咳，收斂，刺激血液循環(huán)等功效[4-6]；我國(guó)重要的中藥材五倍子是由癭綿蚜科某些昆蟲(chóng)寄生于幾種鹽膚木屬植物復(fù)葉上而形成的癭瘤[7]。五倍子所含酚類(lèi)化合物是一種具有諸多用途的天然產(chǎn)物，常被用作醫(yī)療與化工原料[8-10]，具有抗炎、抗輻射、抗腫瘤等生物活性[11-13]，例如，其中的沒(méi)食子酸具有改善腦缺血再灌注損傷，改善心衰的心功能障礙和纖維化的功能[14-15]。目前，五倍子多酚獲取途徑比較單一，即主要依賴(lài)五倍子進(jìn)行提??；然而，近年來(lái)，由于生態(tài)環(huán)境遭到破壞，導(dǎo)致自然生長(zhǎng)的蟲(chóng)癭越來(lái)越少，從而使五倍子的產(chǎn)量逐年降低，進(jìn)而無(wú)法滿(mǎn)足相應(yīng)的市場(chǎng)需求[16]。較五倍子而言，鹽膚木葉片的資源相對(duì)豐富且易于獲得，并且研究發(fā)現(xiàn)其中含有一定量的五倍子多酚類(lèi)物質(zhì)，但其含量遠(yuǎn)小于五倍子[17-19]。盡管如此，若能充分利用鹽膚木葉片提取酚類(lèi)物質(zhì)，或?yàn)榻鉀Q五倍子短缺的問(wèn)題提供了一種可能的途徑。因此，為了解鹽膚木葉片藥用成分的積累特征，本研究測(cè)定了自然條件下生長(zhǎng)的鹽膚木葉片的總酚含量及其它藥用成分的含量，以期確定其最佳采摘時(shí)節(jié)和葉齡。同時(shí)，本研究還對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Lambda265 紫外可見(jiàn)分光光度儀(鉑金埃爾默儀器有限公司)；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；UltiMate 3000 Bio—RS型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；ME104/2萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多)；Chorus純水及超純水系統(tǒng)(英國(guó)埃爾格)；5B—5200DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

福林酚(Folin，CAS:12111-13-6，飛凈生物科技有限公司)；甲醇、乙腈、檸檬酸(色譜純，阿拉丁生化科技股份有限公司)；沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子酸乙酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 植物材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料及其處理 供試植物，選取位于貴州省遵義市(北緯N27°43′24.19″，東經(jīng)E107°04′24.08)的野生鹽膚木。

于2019年5月中旬到9月中旬，測(cè)定3株鹽膚木的葉片的總酚變化情況；3株樹(shù)齡在3年以上，每月每株樹(shù)上隨機(jī)選擇3根樹(shù)枝采摘3組葉片，每組采20片葉片；共測(cè)定45次總酚含量。采摘葉片時(shí)，選取完整的和無(wú)病蟲(chóng)害的葉片。

于2020年6月8日采摘12株樹(shù)葉片，其中9株，樹(shù)齡為3年期，另3株為1年期。每株樹(shù)取1整條枝的葉，枝條末端1/3為新生嫩葉片，中部1/3為中等嫩葉片，下部1/3為較老葉片；每組10片葉片，測(cè)量多酚、類(lèi)黃酮、總酚含量，共測(cè)量36次。所采摘的葉片均先放入120℃烘箱內(nèi)進(jìn)行殺青15～20 min，然后于60℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎，過(guò)80目篩，備用。

1.2.2 多酚提取 精確稱(chēng)取0.1 g鹽膚木葉片粉末，采用80%甲醇溶液超聲提取多酚。提取條件：料液比1∶100(g/mL)，在16 ℃水中，超聲提取50 min，冷卻，取1 mL于EP管中在12 000 r/min離心10 min，取上清，然后0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.2.3 條件優(yōu)化 在不同提取條件下，對(duì)同一份鹽膚木葉的總酚進(jìn)行提取，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定；提取時(shí)，超聲溫度均為16 ℃，其余試驗(yàn)因素設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)表

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 取沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子酸乙酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品并配成濃度為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再將其梯度稀釋成濃度為10、20、50、80、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.5 總酚測(cè)定 提取方法采用1.2.2的方法，稀釋10倍，采用福林法[20]，取樣品液0.5 mL，加入0.25 mol/L 福林酚試劑0.5 mL，混合，靜置3 min，再加入15% Na2CO31 mL混合，靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，以未加樣品的對(duì)照組為空白，測(cè)定760 nm吸光度。

1.2.6 多酚及類(lèi)黃酮測(cè)定 采用色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm ,1.8 μm)；流動(dòng)相條件：50 mmol/L檸檬酸鹽溶液(pH 2.9)與甲醇，按以下梯度洗脫：0～14.5 min，10%～35%檸檬酸鹽溶液; 之后采用40% 檸檬酸鹽沖洗2 min后回到初始梯度并平衡4 min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積1 μL。DAD檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm。

2 結(jié)果

2.1 總酚提取條件的優(yōu)化

2.1.1 料液比優(yōu)化 由圖1可知，鹽膚木葉總酚的獲取率隨著料液比的增加而提高，但當(dāng)料液比超過(guò)1∶50(g/mL)時(shí)，總酚提取率趨于穩(wěn)定，這可能是因?yàn)闃悠匪偡尤咳苡诩状既芤汉?，總酚提取率便不再隨甲醇溶劑量的增加而提高。由于1∶100(g/mL)獲取率最高，在之后測(cè)定中僅用稀釋一次，故選取1∶100(g/mL)為最佳料液比。

圖1 不同料液比下鹽膚木樣品中總酚的獲取率變化趨勢(shì)

2.1.2 超聲時(shí)間優(yōu)化 由圖2可見(jiàn)，總酚提取率隨超聲時(shí)間的增加而升高，當(dāng)單次超聲時(shí)間為50 min時(shí)，總酚提取率達(dá)到峰值；之后，總酚提取率便不再隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)而升高，可能因?yàn)槭怯捎诔暡ǖ膿羲楹蜔嵝?yīng)導(dǎo)致某些多酚成分分解[21]。因此，超聲提取時(shí)間可定為50 min。

圖2 不同超聲時(shí)間下鹽膚木樣品中酚類(lèi)化合物的變化趨勢(shì)

2.1.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化 由圖3可見(jiàn)，總酚提取率隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，總酚的提取率可達(dá)到最大；但當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)，總酚獲取率反而下降。因此，甲醇體積分?jǐn)?shù)可選為80%。

圖3 不同甲醇的體積分?jǐn)?shù)下鹽膚木樣品中酚類(lèi)化合物的變化趨勢(shì)

綜上所述，料液比1∶100(g/mL)，超聲時(shí)間為50 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，可得到最高的多酚獲取率。

2.2 鹽膚木葉片總酚含量隨季節(jié)變化 由圖4可見(jiàn)，3株3年期鹽膚木葉片的總酚含量大致在3%～12%；從5月中旬至7月中旬鹽膚木葉片的總酚含量呈上升趨勢(shì)，并在7月達(dá)到峰值，之后，則呈下降趨勢(shì)；鹽膚木葉片的總酚含量在相同月份內(nèi)無(wú)顯著差異(P>0.05)，而不同月份間有顯著差異(P<0.05)；這表明鹽膚木葉片的總酚含量具有季節(jié)性變化。

圖4 3年期鹽膚木葉片總酚含量的變化

2.3 不同老嫩葉片化學(xué)成分的含量測(cè)定和分析 采用上述優(yōu)化的提取條件對(duì)12株鹽膚木的不同老嫩程度葉片的成分進(jìn)行提取，并采用液相色譜對(duì)提取物進(jìn)行檢測(cè)，探究老嫩影響時(shí)3年期，1年期均在一起統(tǒng)計(jì)，探究樹(shù)齡影響時(shí)，將不同樹(shù)齡的鹽膚木葉進(jìn)行分開(kāi)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 12株鹽膚木樣品中化合物含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

由表2可見(jiàn)，鹽膚木嫩葉與老葉的總酚無(wú)顯著差異(LSD檢驗(yàn)，P>0.05)；由圖5可知，鹽膚木葉共鑒定出6種化合物，其中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯在鹽膚木嫩葉片分別與中等嫩葉片和老葉片具有顯著差異(P<0.05)，表兒茶素沒(méi)食子酸酯在鹽膚木嫩葉片和老葉片具有顯著差異(P<0.05)，根皮苷在鹽膚木嫩葉片和老葉片，中等嫩葉片和老葉片具有顯著差異(P<0.05)，其余成分均無(wú)顯著差異(P>0.05)。此外，在本研究中，總酚在3年以上的鹽膚木樹(shù)的葉片與1年左右的樹(shù)的葉片之間不存在顯著差異(t檢驗(yàn)，P>0.05)，而沒(méi)食子乙酯、根皮苷存在顯著差異(P<0.05)，表明鹽膚木葉片總酚受樹(shù)齡影響較小，沒(méi)食子乙酯，根皮苷受樹(shù)齡影響較大，3年期以上鹽膚木葉較1年期鹽膚木葉根皮苷含量較多，而沒(méi)食子乙酯含量較少。

A：標(biāo)準(zhǔn)品；B：樣品；1：沒(méi)食子酸；2：沒(méi)食子酸甲酯；3：表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；4：沒(méi)食子酸乙酯；5：表兒茶素沒(méi)食子酸酯；6:根皮苷。

3 討論

鹽膚木葉總酚的提取工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取溶液為80%甲醇時(shí)，料液比1∶100(g/mL)提取時(shí)間為50 min時(shí)，可獲得的多酚最多；相較前人研究[17-19]，在鹽膚木酚類(lèi)提取時(shí)多采用乙醇提取，筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲醇對(duì)酚類(lèi)化合物的提取能力要高于乙醇，但甲醇作為溶劑的不足之處是其毒性較乙醇大；前人多采用1∶40的料液比，通常情況下料液比中的“液”越多，提取效果越好，但常需考慮試劑的成本收益率和污染等因素，并且由于測(cè)量總酚試劑有效量程基本固定，過(guò)多過(guò)少的提取液都會(huì)使溶液濃度超出試劑有效量程，如果再度稀釋或濃縮會(huì)增加試驗(yàn)操作難度，導(dǎo)致試驗(yàn)誤差增大，所以在選擇考慮料液比時(shí)應(yīng)綜合考慮各種因素。

在本研究中，所采摘的自然生長(zhǎng)的鹽膚木葉片總酚含量均低于13%，7月和8月的含量較高；從5月中旬至7月中旬鹽膚木葉片的總酚含量不斷增加，并在7月達(dá)到峰值，之后呈下降趨勢(shì)；這表明，鹽膚木葉片的總酚含量隨著氣溫升高和光照增強(qiáng)而增加，這可能是因?yàn)閱螌幩岬确宇?lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的吸水性和紫外光吸收能力，從而有利于提高植物的抗旱能力和抗紫外線能力[22]。從已有研究來(lái)看[23-24]，植物次生代謝物的累積多呈拋物線形，即從發(fā)芽起逐漸累積，達(dá)到一定峰值后便呈下降趨勢(shì)。然而，在本研究中，與老葉相比，幼嫩葉片在某些成分(如，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和根皮苷)的積累上更具優(yōu)勢(shì)。而3年期對(duì)比1年期期鹽膚木所產(chǎn)葉片其根皮苷含量更高，因而更具有潛在的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，而沒(méi)食子乙酯卻在1年期鹽膚木葉中含量更多，其原因值得進(jìn)一步研究?？傊?，本研究表明鹽膚木葉主要藥用成分的含量受其采集時(shí)間、樹(shù)齡、葉齡以及提取條件的影響，這可為鹽膚木葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。