中耳膽脂瘤中P-Akt和Foxo3的表達及其和凋亡的關(guān)系

劉東亮 馬秀嵐

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科耳科病房（沈陽 110004）

中耳膽脂瘤(middle ear cholesteatoma)是耳科常見疾病，它是一種位于鼓室乳突的囊性結(jié)構(gòu)，隨著囊袋中角化上皮不斷脫落堆積而逐漸擴大，累及破壞相鄰組織結(jié)構(gòu)。膽脂瘤可分為先天性和后天性，后天性進一步分為后天原發(fā)性和后天繼發(fā)性。后天性膽脂瘤形成機制還未明確，主要有四種假說[1,2]：①鱗狀上皮化生學說；②基底細胞增生學說；③上皮遷移學說；④內(nèi)陷袋學說。雖然存在多種假說，但研究方向比較一致，都集中在細胞增殖和凋亡。叉頭框蛋白O（Forkhead boxO,Foxo）是最近比較受關(guān)注的一個蛋白家族，它與細胞的增殖和凋亡密切相關(guān)[3,4]。Foxo家族主要有四個成員組成，分別是Foxo1、Foxo3、Foxo4 和 Foxo6[5,6]，其中Foxo3作為無脊椎動物、小鼠和人類中重要的調(diào)節(jié)壽命的因子，研究最為廣泛。它參與重要生命過程的調(diào)控，如細胞的增殖、分化、凋亡以及衰老等[7]。相關(guān)研究[8]發(fā)現(xiàn)Foxo3可以被多種方式調(diào)控，包括磷酸化、乙?；⒎核鼗?。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)Pten/Akt通路對中耳膽脂瘤形成發(fā)揮作用[9]，而Foxo蛋白是PAkt磷酸化的直接下游信號分子[10]。

本研究將通過免疫熒光及Western blot檢測中耳膽脂瘤組織和正常皮膚中Foxo3和DAPI的熒光染色情況、Foxo3與P-Akt(ser473)蛋白表達和相關(guān)性，來明確Foxo3可以通過被Akt通路磷酸化，抑制中耳膽脂瘤細胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年8月-11月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院中耳膽脂瘤手術(shù)標本30例，術(shù)中廢棄或不能使用的耳后正常皮膚、皮膚碎塊15例作對照組（術(shù)前已告知患者同意并簽署知情同意書）。膽脂瘤標本分為原發(fā)性和繼發(fā)性2組，分類標準為術(shù)前查體為松弛部或緊張部后上形成內(nèi)陷袋的病例為原發(fā)性膽脂瘤組，術(shù)前查體為緊張部大穿孔或邊緣性穿孔的病例歸為繼發(fā)性膽脂瘤組。同時結(jié)合術(shù)中觀察驗證。其中原發(fā)組23人，男13人，女10人。年齡35.34±21.67歲。病程8.13±7.58年。繼發(fā)組7人，男4人，女3人。年齡34.39±19.23歲。病程10.47±6.87年。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫熒光實驗

冰凍切片復溫，晾干，多聚甲醛固定15min，待甲醛完全干后于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中在微波爐中進行抗原修復。低火10min，切勿干片。待完全冷卻后將玻片置于PBS中在搖床上晃動洗滌4次，每次5min。甩干后用組化筆在組織周圍圈出輪廓以防止抗體流走，甩干PBS，滴加BSA，封閉30min。在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育12h。取出玻片置于PBS（PH7.4）中，在脫色搖床上晃動洗滌4次，每次5min。甩干后在圈內(nèi)滴加二抗覆蓋組織，避光室溫孵育1h。PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。再次洗滌甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察保存圖像（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光）并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行半定量分析。切片免疫熒光實驗結(jié)果判讀:DAPI染出來的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色，F(xiàn)oxo3陽性表達為綠光。

1.2.2 Western blot免疫印跡實驗

⑴細胞總蛋白提?。航M織塊用冷PBS洗滌2-3次，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑冰上徹底勻漿冰浴30min，期間用移液器反復吹打，確保細胞完全裂解。12000 rpm離心10min，收集上清，即為總蛋白溶液。⑵蛋白濃度測定：BCA法測蛋白濃度。⑶SDS-PAGE電泳：玻璃板對齊后放入夾中卡緊，操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。配制分離膠加入TEMED后立即搖勻灌膠。大約45min后吸水紙將上層水吸干。按前面方法配5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。加足夠的電泳液后上樣電泳。將樣品加入電泳孔中，電泳。濃縮膠電壓75V，分離膠用120V。電泳至溴酚藍剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。⑷轉(zhuǎn)膜：準備6張7×9cm的濾紙和一張大小適中的PVDF膜，PVDF膜在使用前要甲醇活化。在加有轉(zhuǎn)移液的盆里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子，兩塊海綿墊，一支玻棒，濾紙和PVDF膜。在墊子上墊海綿、濾紙和剝下的分離膠，將膜蓋于膠上，并除氣泡。在膜上蓋三張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊。25 V恒壓轉(zhuǎn)膜過夜。⑸免疫反應：將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5% TBST配)，封閉1h。稀釋一抗（TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5% BSA），4℃孵育抗體3小時。TBST洗三次，每次5min。將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。⑹化學發(fā)光：將ECLA和ECLB兩種試劑在離心管中等體積混合，將PVDF膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸，1-2 min后，去盡殘液，包好，放入暗匣中曝光。最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件。⑺凝膠圖像分析：將膠片進行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學處理

應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計量資料比較用兩樣本t檢驗，運用Pearson檢驗進行兩兩的相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Foxo3和DAPI免疫熒光實驗結(jié)果（圖1）

Foxo3在膽脂瘤和正常皮膚的細胞核和細胞質(zhì)都有染色，DAPI則染色于細胞核，兩者在膽脂瘤的染色亮度明顯弱于正常皮膚（圖1A）；用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行半定量分析熒光值（圖1B），發(fā)現(xiàn)Foxo3在中耳膽脂瘤的平均熒光值（27.47±2.35）明顯低于正常皮膚（112.89±10.76），兩者差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.78,P=0.007,P＜0.01)，但原發(fā)性膽脂瘤組和繼發(fā)性膽脂瘤組的Foxo3平均熒光值分別為27.11±2.51和28.73±2.22，兩者無統(tǒng)計學差異；DAPI在中耳膽脂瘤的平均熒光值（13.29±1.57）也低于正常皮膚（79.62±7.67），兩者差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.08,P=0.03,P＜0.05)，但原發(fā)性膽脂瘤組和繼發(fā)性膽脂瘤組的DAPI平均熒光值分別為12.91±1.64和14.63±1.52，兩者無統(tǒng)計學差異。

圖1 Foxo3與DAPI免疫熒光染色情況：（A1）為Foxo3在膽脂瘤標本染色情況（綠色），著色于細胞核和細胞質(zhì)，（A2）為DAPI在膽脂瘤標本染色情況，染色于細胞核（藍色）,（A4）為Foxo3在正常皮膚染色情況（綠色），著色于細胞核和細胞質(zhì)，（A5）為DAPI在正常皮膚的染色情況（藍色）染色于細胞核，（A3）為(A1)(A2)的融合圖，（A6）為(A4)(A5)的融合圖。（B）為Foxo3和DAPI在正常皮膚和膽脂瘤中的熒光值分析圖，F(xiàn)oxo3在原發(fā)性膽脂瘤的平均熒光值27.11±2.51，n=23;Foxo3在繼發(fā)性膽脂瘤的平均熒光值28.73±2.22，n=7；Foxo3在正常皮膚的平均熒光值112.89±10.76，n=15。Foxo3在膽脂瘤的染色明顯弱于正常皮膚(t=2.78,P=0.007)，原發(fā)組和繼發(fā)組無統(tǒng)計學差異；DAPI在原發(fā)性膽脂瘤的平均熒光值12.91±1.64，n=23;DAPI在繼發(fā)性膽脂瘤的平均熒光值14.63±1.52，n=7；DAPI在正常皮膚的平均熒光值79.62±7.67，n=15。DAPI在膽脂瘤的染色明顯弱于正常皮膚(t=2.08,P=0.03)，原發(fā)組和繼發(fā)組無統(tǒng)計學差異。*P＜0.05,**P＜0.01Fig.1 Foxo3 with DAPI immunofluorescence staining situation:(A1)in cholesteatoma specimens for Foxo3 dyeing conditions(green),coloring in the nucleus and cytoplasm,(A2)for the DAPI in cholesteatoma specimens of dyeing,dyeing in the nucleus(blue),(A4)for Foxo3 in normal skin color(green),coloring in the nucleus and cytoplasm,(A5)as the DAPI in normal skin of dyeing conditions(blue)in the nucleus,(A3)for the integration of(A1)(A2),(A6)figure for the integration of(A4)(A5).(B)was the fluorescence analysis of Foxo3 and DAPI in normal skin and cholesteatoma.The average fluorescence value of Foxo3 in primary cholesteatoma was 27.11±2.51,n=23.The mean fluorescence value of Foxo3 in secondary cholesteatoma was 28.73±2.22,n=7.The average fluorescence value of Foxo3 in normal skin was 112.89±10.76,n=15.Foxo3 staining in cholesteatoma was significantly weaker than that in normal skin(t=2.78,P=0.007).The average fluorescence value of DAPI in primary cholesteatoma was 12.91±1.64,n=23.The mean fluorescence value of DAPI in secondary cholesteatoma was 14.63±1.52,n=7.The average fluorescence value of DAPI in normal skin was 79.62±7.67,n=15.DAPI staining in cholesteatoma was significantly weaker than that in normal skin(t=2.08,P=0.03),and there was no statistical difference between the primary and secondary groups.*P＜0.05,**P＜0.01

2.2 P-Akt(ser473)和Foxo3免疫印跡western bolt檢測結(jié)果（圖2）

P-Akt(ser473)在中耳膽脂瘤表達明顯高于正常皮膚(圖2A)，兩者相對灰度值分別為0.82±0.07和0.32±0.02，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.05,P=0.02,P＜0.05)（圖2B），但原發(fā)性膽脂瘤組和繼發(fā)性膽脂瘤組的P-Akt(ser473)相對灰度值分別為0.81±0.04和0.83±0.06，兩者無統(tǒng)計學差異；Foxo3在膽脂瘤中表達明顯低于正常皮膚(圖2A)，兩者相對灰度值分別為0.41±0.04和0.96±0.08，差異具有統(tǒng)計學意義(t=1.94,P=0.04,P＜0.05)（圖2B），但原發(fā)性膽脂瘤組和繼發(fā)性膽脂瘤組的Foxo3相對灰度值分別為0.41±0.03和0.43±0.05，兩者無統(tǒng)計學差異。本實驗重復3次。

圖2 P-Akt(ser473)和Foxo3在膽脂瘤和正常上皮的表達:（A）為Western blot檢測P-Akt(ser473)和Foxo3的表達。（B）為P-Akt(ser473)和Foxo3在膽脂瘤和正常皮膚灰度值比較。P-Akt(ser473)在原發(fā)性膽脂瘤的相對灰度值為0.81±0.04，n=23；P-Akt(ser473)在繼發(fā)性膽脂瘤的相對灰度值為0.83±0.06，n=7；P-Akt(ser473)在正常皮膚相對灰度值為 0.32±0.02，n=15。P-Akt(ser473)在中耳膽脂瘤表達明顯高于正常皮膚(t=2.05,P=0.02)，原發(fā)組和繼發(fā)組無統(tǒng)計學差異；Foxo3在原發(fā)性膽脂瘤的相對灰度值為0.41±0.03，n=23；Foxo3在繼發(fā)性膽脂瘤的相對灰度值為0.43±0.05，n=7；Foxo3在正常皮膚相對灰度值為0.96±0.08，n=15。Foxo3在中耳膽脂瘤表達明顯低于正常皮膚(t=1.94,P=0.04)，原發(fā)組和繼發(fā)組無統(tǒng)計學差異。*P＜0.05,**P＜0.01Fig.2 Expression of P-Akt(ser473)and Foxo3 in cholesteatoma and normal epithelium:(A)Western blot detection of PAkt(ser473)and Foxo3.(B)the gray values of P-Akt(ser473)and Foxo3 in cholesteatoma and normal skin were compared.The relative gray value of P-Akt(ser473)in primary cholesteatoma was 0.81±0.04,n=23.The relative gray value of P-Akt(ser473)in secondary holesteatoma was 0.83±0.06,n=7.The relative gray value of p-Akt(ser473)in normal skin was 0.32±0.02,n=15.The expression of P-Akt(ser473)in middle ear cholesteatoma was significantly higher than that in normal skin(t=2.05,P=0.02).The relative gray value of Foxo3 in primary cholesteatoma was 0.41±0.03,n=23.The relative gray value of Foxo3 in secondary cholesteatoma was 0.43±0.05,n=7.The relative gray value of Foxo3 in normal skin is 0.96±0.08,n=15.The expression of Foxo3 in middle ear cholesteatoma was significantly lower than that of normal skin(t=1.94,P=0.04),and there was no statistical difference between the primary and secondary groups.*P＜0.05,**P＜0.01

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1 Foxo3和DAPI的相關(guān)性分析

通過Pearson檢驗對Foxo3和DAPI在中耳膽脂瘤中熒光值的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著正相關(guān)r=0.451,P＜0.01，見表1。

表1 Foxo3和DAPI在中耳膽脂瘤中表達的Pearson相關(guān)性分析Table 1 Pearson correlation analysis of Foxo3 and DAPI expression in middle ear cholesteatoma

2.3.2 P-Akt(ser473)和Foxo3的相關(guān)性分析

中耳膽脂瘤中P-Akt(ser473)和Foxo3的相關(guān)性分析見表2，兩者呈顯著負相關(guān)，r=-0.466,P＜0.01。

表2 P-Akt(ser473)和Foxo3在中耳膽脂瘤中表達的Pearson相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation analysis of p-Akt(ser473)and Foxo3 expression in middle ear cholesteatoma

3 討論

3.1 Foxo3與凋亡的關(guān)系

眾多研究表明Foxo3通過其靶基因包括抗氧化基因、細胞凋亡和細胞周期阻滯基因等達到抑制增殖促進凋亡的作用。比如，F(xiàn)oxo3能增加凋亡基因的表達，包括 Bim、FasL、TRAIL、PUMA 等[11-13]。Savkovi C等[14]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌祖/干細胞中有活性的Foxo3a促進TRAIL的表達，從而誘導細胞凋亡；Lv S等[15]發(fā)現(xiàn)KMT2D的減少使Foxo3的表達上調(diào)，使前列腺癌細胞發(fā)生細胞周期阻滯，同時可激活Bim和FasL降低腫瘤活性。本實驗結(jié)果顯示膽脂瘤中Foxo3熒光染色明顯弱于正常皮膚。DAPI目前被廣泛用于判定細胞凋亡情況[16]，DAPI染色于細胞核呈藍色熒光。正常細胞凋亡核濃縮，熒光顯微鏡下可見藍光，大量凋亡表現(xiàn)為核碎裂成大小不等的凋亡小體，熒光顯微鏡下可見藍白強光。本實驗顯示中耳膽脂瘤中DAPI為弱藍光，所以凋亡明顯被抑制，而且與Foxo3的減弱呈顯著的正相關(guān)，所以說明在中耳膽脂瘤中Foxo3活性降低和細胞凋亡抑制有關(guān)。

3.2 Foxo3的亞細胞定位

研究表明Foxo3的促凋亡作用不僅與其含量高低有關(guān)，也和它的亞細胞定位密切相關(guān)。Corno C等[17]報道，在卵巢癌中FoxomRNA低表達或不表達而在正常卵巢高表達，核質(zhì)均著色減弱；Hesp K等[18]發(fā)現(xiàn)IGF-1通過Foxo蛋白從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，誘導激活氧化應激、熱休克反應等影響許多物種的壽命。正常情況下，F(xiàn)oxo3在細胞核、質(zhì)均有表達，定位受到多種翻譯后修飾的調(diào)控，F(xiàn)oxo3被修飾后從細胞核移出進入細胞質(zhì)，使其不能作用于其靶向基因，喪失了轉(zhuǎn)錄因子活性[19]，所以定位于細胞核的Foxo3對凋亡起重要作用。結(jié)合本試驗結(jié)果Foxo3定位于膽脂瘤和正常皮膚的細胞核和細胞質(zhì)，膽脂瘤Foxo3熒光值無論在細胞核或細胞質(zhì)都明顯弱于正常皮膚。所以在中耳膽脂瘤中細胞核Foxo3的減少使其促進凋亡的作用減弱。

3.3 Akt與Foxo3

在此強調(diào)，F(xiàn)oxo3不用修飾本身就有生物學活性，而經(jīng)過修飾的Foxo3則失去了活性。可以對Foxo3進行修飾的方式有磷酸化、乙?；?、泛素化等，具體包括PI3K-Akt信號通路、p38 MAPK(p38 mitogen-activated kinase)、ERK(extracellular-signalregulated kinase)、SGK(serum/glucocorticoid regulatedkinase 1)、IKKβ (IkB kinase β)、AMPK、JNK(c-JunN-terminal kinase)、MST1 等[20]。在這些通路中，PI3K/Akt通路與Foxo3關(guān)系最為密切，PI3K/Akt信號傳導通路與人類的多種疾病關(guān)系密切[21]，主要調(diào)控方式是通過促進細胞增殖來抗凋亡或者抑制下游的抑癌基因來促進增殖[22]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3 K)是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，它被激活（Pten最為常見）后會催化PIP2生成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3通過與Akt的PH域結(jié)合，使Akt從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜，并改變了它的結(jié)構(gòu)使其磷酸化，具體是在絲氨酸473(Serine 473,Ser473)和蘇氨酸308(Threonine 308,Thr308)這兩個關(guān)鍵點發(fā)生磷酸化激活[23]。其中P-Akt絲氨酸473位點是Foxo3磷酸化的特異性位點[24]，磷酸化的Foxo3結(jié)合細胞核內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白14-3-3[10]，從細胞核移位到細胞質(zhì)，而細胞質(zhì)中的磷酸化Foxo非常容易被泛素化降解[25]；相反當Akt途徑受到抑制時，大量未被磷酸化的Foxo3留在細胞核并加速細胞凋亡[26]。結(jié)合本實驗，western blot顯示膽脂瘤中P-Akt(ser473)的表達量明顯高于正常皮膚，F(xiàn)oxo3的表達量明顯低于正常皮膚，且兩者的表達呈顯著負相關(guān)。說明在中耳膽脂瘤中，大量ser473-P-Akt被激活，從而磷酸化Foxo3，導致其進入細胞質(zhì)而降解，核Foxo3相應減少失去促凋亡作用。

綜上所述，本實驗表明在中耳膽脂瘤（無論原發(fā)性膽脂瘤還是繼發(fā)性膽脂瘤），ser473-P-Akt表達增多（結(jié)合前期的研究[9,27]，可能與Pten的減少有關(guān)），473位點的激活對于Foxo3的激活是必須，所以增多的ser473-P-Akt去特異性磷酸化Foxo3，磷酸化的Foxo3從細胞核轉(zhuǎn)移到進入細胞質(zhì)，導致核Foxo3明顯減少，而到細胞質(zhì)的Foxo3又進一步被降解，這與本實驗的結(jié)果一致，即細胞核與細胞質(zhì)中Foxo3均減少，這樣Foxo3促凋亡的作用明顯減弱，與本實驗DAPI核染色減弱相一致。所以得出結(jié)論，在中耳膽脂瘤的發(fā)展過程中，Akt/Foxo3通路起到了抑制凋亡的作用。