獲得性中耳膽脂瘤基礎研究進展

吳華東 熊園平 江紅群

南昌大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南昌330006)

獲得性中耳膽脂瘤是耳鼻咽喉科較為常見的一種慢性中耳疾病，非真性腫瘤，其角質(zhì)形成細胞的異常增殖和遷移可導致鄰近組織結(jié)構的侵蝕，輕者可造成外耳、中耳結(jié)構破壞、聽力下降、面癱等并發(fā)癥；嚴重者病變可侵及內(nèi)耳甚至顱內(nèi)，造成如眩暈、硬膜外膿腫、腦膿腫等嚴重并發(fā)癥，甚至死亡。中耳膽脂瘤在組織學上表現(xiàn)為角蛋白碎片和復層鱗狀上皮的混合體,主要由3種成分構成：基質(zhì)旁組織、上皮基質(zhì)和含大量角蛋白碎片的囊性內(nèi)容物。手術是目前獲得性膽脂瘤的唯一有效治療方法，但膽脂瘤手術后仍有復發(fā)的可能性。目前膽脂瘤的發(fā)病機制暫不明確，主流的發(fā)病機制學說有：袋狀內(nèi)陷理論、上皮遷移理論、鱗狀化生理論和基底細胞增生理論。但這些理論學說尚無法完全解釋膽脂瘤的過度增殖、遷移、分化改變、侵襲性和復發(fā)性的臨床特性，因此深入了解膽脂瘤發(fā)病的分子機制和危險因素，以降低甚至解除疾病的發(fā)生、發(fā)展及復發(fā)，甚至尋找可行的非手術治療方案，成為了目前研究熱點。本文就獲得性中耳膽脂瘤相關基礎研究進展進行綜述。

1 細胞因子與獲得性膽脂瘤

獲得性膽脂瘤幾乎都存在于感染和炎癥環(huán)境中，復雜環(huán)境下產(chǎn)生的細胞因子對膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，研究表明膽脂瘤組織中高表達的磷酸化表皮生長因子受體（Phosphorylated epidermal growth factor receptor，pEGFR）參與了膽脂瘤的形成和發(fā)展[1，2]。Liu等人的研究發(fā)現(xiàn)pEGFR，磷酸化蛋白激酶B（protein kinase B，p-Akt）、細胞周期蛋白D1（cyclinD1）和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在膽脂瘤組織中都呈現(xiàn)為高表達，且p-EGFR、p-Akt、cyclinD1的表達與PCNA的表達呈顯著正相關。隨后他們建立了人外耳道角質(zhì)形成細胞（External auditory canal keratinocytes，EACKs）模型，發(fā)現(xiàn)表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）可顯著促進EACKs的增殖，且可引起CyclinD1表達的上調(diào)。而EGFR抑制劑AG1478和磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抑制劑 Wortmannin對EGF誘導的EACKs增殖有明顯的抑制作用。由此他們推斷EGF通過激活EGFR/PI3K/Akt/CyclinD1信號通路，參與了膽脂瘤上皮的過度增殖[2]。另一項研究發(fā)現(xiàn)肝素結(jié)合型表皮生長因子樣生長因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF）相比外耳道正常皮膚組織在膽脂瘤中也呈高表達，且與膽脂瘤骨破壞程度呈正相關，提示HB-EGF可能參與了膽脂瘤上皮角質(zhì)形成細胞的增殖和膽脂瘤骨破壞機制[3]，但其中的確切通路與機制仍需進一步實驗探討。

中耳膽脂瘤上皮細胞的過度增殖還與角質(zhì)細胞生長因子（Keratinocyte growth factor，KGF）有關，Yamamoto-Fukuda等人通過在動物模型中耳內(nèi)長期重復轉(zhuǎn)染KGF cDNA，成功誘導了中耳膽脂瘤的發(fā)生[4]。KGF還可能通過誘導pp63的表達，促進膽脂瘤干細胞和/或祖細胞的增殖活性、抑制膽脂瘤基底層祖細胞的分化，從而引起膽脂瘤上皮的增生[5]。膽脂瘤組織中的角質(zhì)形成細胞還可分泌甲狀旁腺激素相關蛋白(Parathyroid hormone associated protein，PTHrP)，并通過核因子-κB受體活化因子配體（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL）信號通路參與中耳膽脂瘤的骨吸收過程[6]。血管生成生長因子，如成纖維細胞生長因子α（Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、轉(zhuǎn)化生長因子-α（Transforming growth factor-α，TGF-α）和血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），則與膽脂瘤基質(zhì)周圍血管生成密切相關，這些細胞因子在支持角質(zhì)形成細胞持續(xù)遷移到鼓室的過程中起著至關重要作用，參與膽脂瘤的擴張[7]。

此外，Mzczepanski等人發(fā)現(xiàn)膽脂瘤組織中胞內(nèi)高表達的高遷移率族蛋白B1（high-mobility box 1，HMGB1）在應激或壞死時可從胞內(nèi)釋放出來，與角質(zhì)形成細胞中過度表達的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（Receptor for Advanced Glycation Endproduct，RAGE）結(jié)合，導致角質(zhì)形成細胞增殖、遷移和白細胞介素（Interleukin,IL）-8的分泌，參與膽脂瘤的形成和骨破壞[8]。隨后Chi等人在膽脂瘤上皮細胞外檢測到了HMGB1和凋亡膽脂瘤角質(zhì)細胞釋放的DNA片段，發(fā)現(xiàn)當它們同時存在時可顯著誘導膽脂瘤角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）和IL-1b，導致膽脂瘤的骨吸收和破壞[9]。這些研究表明，細胞因子在膽脂瘤的生物學行為中有著重要作用，與膽脂瘤進展和骨破壞密切相關。

2 感染和獲得性膽脂瘤

獲得性膽脂瘤常常與病原體的感染相生相伴，當感染發(fā)生時與人非特異性免疫有關的病原體識別受體(Pathogen recognition receptor，PRR)可通過識別病原體表達的病原體相關分子模式,誘導一系列免疫反應的發(fā)生，從而參與膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)PRR家族中Toll樣受體4（Toll-like receptors 4,TLR4）在獲得性膽脂瘤中表達增加且與疾病嚴重程度呈正相關。構建的小鼠動物模型發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠對比，缺乏TLR4表達基因的小鼠IL-1β、TNF-α、NF-κB和RANKL和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）mRNA表達水平降低，從而減少了體內(nèi)破骨細胞的形成，減輕了對實驗性獲得性膽脂瘤所致的骨破壞和聽力損失[10]。與TLRs類似，髓系細胞觸發(fā)受體(triggering receptors expressed on myeloid cells，TREM)是與炎癥反應相關的受體家族，研究發(fā)現(xiàn)TREM-2在獲得性膽脂瘤組織中表達明顯升高，其表達水平與膽脂瘤的骨破壞程度呈正相關。而敲除小鼠的TREM-2基因可減輕實驗獲得性膽脂瘤的成熟以及膽脂瘤引起的骨破壞。這項研究認為，TREM-2可能是通過激活TLR-4信號通路放大炎癥反應、促進金屬基質(zhì)蛋白酶（Matrix metallo proteinases,MMPs）的分泌以及激活膽脂瘤組織中的破骨細胞三個方面參與膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展。然而這項研究對TREM-2激活TRL-4信號通路的證據(jù)不夠充分，仍需要更有說服力的實驗證明[11]。MMP-2和MMP-9是一組能降解細胞外基質(zhì)的蛋白水解酶,研究表明MMP-2和MMP-9在膽脂瘤組織中表達明顯高于正常皮膚組織，與膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展及骨質(zhì)破壞有關[12]。另外一項研究提示Rho激酶可能在細胞分化中起重要作用,其活性降低和表達減弱可能導致了角質(zhì)形成細胞過度增殖和低分化[13]。

膽脂瘤的持續(xù)性和復發(fā)性臨床特點與膽脂瘤標本中廣泛存在細菌生物膜有關。因局部或全身應用的抗生素難以清除中耳生物膜內(nèi)的固著的細菌，在某種情況下，這些生物膜內(nèi)的固著細菌可重新游離，引起疾病的遷延不愈和復發(fā)。目前越來越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)生物膜廣泛存在于膽脂瘤標本中，支持了生物膜與膽脂瘤之間的聯(lián)系[14]。對膽脂瘤感染中的微生物種類研究發(fā)現(xiàn)，最常見的病原菌為銅綠假單胞菌[15]，Si等人將小鼠自體皮片移植入中耳腔再向中耳腔內(nèi)注入銅綠假單胞菌，6周后92%的實驗動物發(fā)生了膽脂瘤[16]。誘導性膽脂瘤沙土鼠模型中，伴隨銅綠假單胞菌感染的動物與未感染組相比，前者膽脂瘤的大小和侵襲性增加[17]，這些研究都表明膽脂瘤與銅綠假單胞菌感染存在密切聯(lián)系。最近一項對膽脂瘤和正常中耳微生物區(qū)系的基因測序技術研究顯示，膽脂瘤基質(zhì)和膽脂瘤附近未累及的粘膜中存在著多種微生物的感染[18]，因此獲得性膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展可能是多種微生物感染共同導致的結(jié)果，但目前通過微生物感染種類對獲得性膽脂瘤發(fā)病機制的研究較少，仍需進一步探尋。

3 基因組學改變與獲得性膽脂瘤

與正常皮膚相比，膽脂瘤組織中有多種細胞增殖標記物表達上調(diào)，如細胞角蛋（Cytokeratin，CK）16、Ki67、PCNA等，證明了膽脂瘤上皮具有高增殖活性。Lin等人報道了中耳膽脂瘤細胞中β-鏈蛋白(β-catenin)的表達顯著增加，激活Wnt/β-catenin通路，可誘導CK16、CK18、Ki67和增殖細胞核抗原的表達，促進膽脂瘤上皮細胞增殖[19]。全基因微陣列分析發(fā)現(xiàn)，和正常外耳道皮膚對比，膽脂瘤中有811個基因上調(diào)，334個基因下調(diào)。多種在腫瘤中下 調(diào) 的 抑 癌 基 因 ，如 ：CDH18.19、ID4、PAX3、LAMC2、TRAF2B等在膽脂瘤中也下調(diào)。在炎癥中起重要作用的KRT6B、SPP1和S100A7A顯著上調(diào)。CK5/6、CK14以及MMPs、PAX3、SP5、TFAP2B等轉(zhuǎn)錄因子在膽脂瘤中下調(diào)[20]。另一項對膽脂瘤組織DNA差異表達分析發(fā)現(xiàn)，其中有104個基因表達上調(diào)，178個基因表達下調(diào)，其囊括了受體結(jié)合、細胞通訊與運動、維生素代謝、細胞因子介導炎癥等各個方面，實時PCR技術證實了其中部分關鍵基因：TCN1、PI3、IL-8、IGF-2、KLKI3、HSP90B、ARGE基因上調(diào)，而DCD、CCL27基因下調(diào)[21]。這些上調(diào)或下調(diào)的基因都可作為未來研究的重要方向。細胞型Fas相關死亡域蛋白樣白介素-1B轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（c-FLIP）是一種凋亡抑制蛋白，可使細胞凋亡受抑制，常常在人類惡性腫瘤和良性增生性上皮疾病中高表達，Chung等人在膽脂瘤中也發(fā)現(xiàn)了c-FLIP的高表達，且與細胞增殖標記物KI-67的高表達具有顯著正相關性，提示細胞凋亡和抗凋亡間的平衡性的改變在膽脂瘤的發(fā)病機制中起一定作用[22]。

總而言之，對獲得性膽脂瘤基因組的研究表明有許多分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡參與了疾病的發(fā)生，這些調(diào)節(jié)節(jié)點在未來可能成為藥物治療的靶點。

4 micro-RNA與獲得性膽脂瘤

micro-RNA是一種長度約20-24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在控制細胞功能，包括細胞分化、增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用。Zang等人發(fā)現(xiàn)miR-203a在膽脂瘤組織中表達下調(diào)，其下調(diào)導致了其直接靶基因轉(zhuǎn)錄因子Bmil的上調(diào)，Bmi1可促進角質(zhì)形成細胞的增殖，防止膽脂瘤細胞過早衰老和死亡，此外，Bmi1還可增強p-Akt的表達，通過這兩種作用機制從而促進了膽脂瘤上皮細胞的生長、增殖[23]。MiR-21因在多種癌癥組織中高表達而廣為人知，其可通過抑制抑癌基因的表達而導致細胞的異常增殖，常被認為是一種致癌miRNA；let-7miRNA在許多實體器官腫瘤中表達下調(diào)，并通過靶向癌基因發(fā)揮腫瘤抑制作用。Chen和Qin等人發(fā)現(xiàn)膽脂瘤組織中的miR-21和let-7amiRNA的表達水平明顯高于正常皮膚，且這種現(xiàn)象在兒童膽脂瘤中尤為明顯，他們的研究認為膽脂瘤中高表達的let-7miRNA可能通過抑制HMGA2的表達，導致角質(zhì)形成細胞凋亡增加和膽脂瘤細胞增殖減少，miR-21的上調(diào)則導致了膽脂瘤的高增殖和侵襲性特點，因此膽脂瘤的高增值但卻表現(xiàn)為良性的性質(zhì)是由于let-7a microRNA和miR-21之間的動態(tài)平衡所致，但這一點仍有待完全確定[24]。隨后Zhang等人發(fā)現(xiàn)let-7a模擬物的過表達抑制了miR-21的表達。相反，抑制let-7a可促進miR-21的表達。證實了microRNA let-7a可通過使角質(zhì)形成細胞周期阻滯于G0/G1期從而抑制其增殖和誘導其凋亡兩種機制抑制膽脂瘤的生長，且let-7a還可抑制膽脂瘤角質(zhì)形成細胞的遷移和侵襲[25]。在隨后的研究中他們進一步發(fā)現(xiàn)抑制miR-21也可促進let-7a miRNAs的表達，表明miR-21和let-7a miRNAs之間還存在除下游靶點以外的相互調(diào)節(jié)機制[26]。最近Xie等人利用miRNA微陣列技術比較了獲得性中耳膽脂瘤和正常皮膚的miRNA表達譜[27]，發(fā)現(xiàn)膽脂瘤組織中共有44個上調(diào)的miRNA(miRNA-21-3p、miRNA-584-5p、miRNA-16-1-3p等)和175個下調(diào)的 miRNA(miRNA-10a-5p、miRNA-152-5p、miRNA-203b-5p等)。血管生成在膽脂瘤的擴張中作用也必不可少[6]，在人膽脂瘤周圍成纖維細胞分泌的外泌體中，miR-106b-5p表達的下調(diào)，對鄰近內(nèi)皮細胞中血管緊張素II的抑制作用減弱，以此促進膽脂瘤新生血管形成，從而調(diào)節(jié)膽脂瘤的發(fā)展[28]。

5 獲得性膽脂瘤中的干細胞

Nagel等人首次報道了在膽脂瘤組織中發(fā)現(xiàn)干細胞群體：中耳膽脂瘤干細胞（Middle Ear Cholesteatoma derived Stem Cells,ME-CSC）。它們具有自我更新、形成神經(jīng)球和分化為中胚層和外胚層細胞型的能力。相比健康外耳道皮膚來源的干細胞，ME-CSC具有更高的TLR4表達和對炎癥刺激的敏感性。將其置于模擬膽脂瘤的微環(huán)境中還能夠分化為角質(zhì)形成細胞樣細胞。隨后，進一步對比MECSC和外耳道皮膚干細胞，發(fā)現(xiàn)ME-CSC的TLR4的表達顯著增加的同時，伴隨著TNF-α，IL-1α，IL-1?，IL-6和IL-8的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）依賴性促炎基因表達顯著增強。與TNFα處理的外耳道皮膚干細胞相比，用TNFα刺激ME-CSC導致IL-6，IL-8以及TNFα本身的表達水平顯著提高。他們認為這是由于ME-CSCs中存在一個由TNF-α驅(qū)動NF-κB從而激活的放大炎癥的正反饋循環(huán)[29]。進一步實驗中發(fā)現(xiàn)TLR4拮抗劑LPS-RS可使MECSC的IL-1?，IL-6和TNFα表達幾乎完全喪失，從而阻斷ME-CSCs對炎癥的放大反應[30]。這些發(fā)現(xiàn)表明了膽脂瘤干細胞的存在及在膽脂瘤中的作用，為膽脂瘤的臨床治療提供了可能的干預方向。

6 結(jié)論與展望

本文對獲得性膽脂瘤的基礎研究進行了較為全面的總結(jié)和綜述，但其具體發(fā)病機制仍需進一步研究和闡明，目前對膽脂瘤的基礎研究更進一步提示了炎癥介質(zhì)、局部感染、基因組學改變和膽脂瘤干細胞與膽脂瘤的生物學行為密切相關。這些研究結(jié)果，為我們后續(xù)膽脂瘤的干預和治療提供了理論基礎。