拮抗馬鈴薯干腐病病原菌活性菌株的篩選及鑒定

賈鵬莉，沈 碩

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省馬鈴薯育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

馬鈴薯是全球第四大重要糧食作物，但在貯藏過程中，容易被馬鈴薯晚疫病、馬鈴薯黑痣病、馬鈴薯枯萎病、馬鈴薯干腐病、馬鈴薯早疫病、馬鈴薯癌腫病、馬鈴薯銀腐病、馬鈴薯黃萎病、馬鈴薯粉痂病等多種病害侵襲[1]。其中，馬鈴薯干腐病是馬鈴薯貯藏期主要的真菌性病害之一，其由多種鐮刀菌(Fusariumspp.)引起[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年由馬鈴薯干腐病造成的產(chǎn)量損失為6%～25%，最高可達(dá)60%[3-5]。生產(chǎn)中對這種病害的防治以化學(xué)防治手段為主，常用的藥劑有苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯、霜脲·錳鋅、戊唑醇等，但長期使用化學(xué)藥劑防治，容易造成菌株抗藥性、環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等嚴(yán)重問題[6-7]。生物防治是利用有益生物及其代謝產(chǎn)物來控制植物病蟲害的方法，具有不易產(chǎn)生抗藥性、不污染環(huán)境和安全無毒等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。因此，利用微生物等天然資源及其代謝產(chǎn)物對馬鈴薯干腐病進(jìn)行生物防治具有重要意義。目前，已報(bào)道可用于防治馬鈴薯干腐病的生防菌有芽孢桿菌(Bacillusspp.)[10]、放線菌(Actinomycesspp.)[11]、木霉菌(Trichodermaspp.)[12]、伯克霍爾德菌(Burkholderiaspp.)[13]、假單胞菌(Pseudomonasspp.)[14]等。白酒糟醅是以谷物為原材料經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、提取酒精等加工后所殘余的廢渣物料。近年來，白酒糟醅多應(yīng)用于食品[15]、飼料[16]、以及抗癌[17]等方面的研究。已有研究顯示青稞白酒糟醅在抑草、抑菌和抗病毒等方面具有生物活性[18]。有關(guān)生物防治細(xì)菌抑制植物病原真菌的報(bào)道較多，但用其抑制馬鈴薯干腐病病原菌的報(bào)道較少。前期發(fā)現(xiàn)一株分離自青稞白酒糟醅的菌株JZ2-1-12對馬鈴薯干腐病病原菌具有抑菌活性[19]。本研究對18株分離自青稞白酒糟醅的菌株進(jìn)行抑菌活性篩選，采用生理生化特征及分子生物學(xué)方法對活性菌株進(jìn)行鑒定，并測定活性菌株發(fā)酵液萃取物的抑菌活性和穩(wěn)定性，以期為微生物來源的馬鈴薯干腐病生物防治菌劑及保鮮制劑的開發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

18株待測菌株均分離自青稞白酒糟醅。馬鈴薯干腐病病原真菌青9A-2-6、青9A-5-7、青9A-5-10、青9A-4-13分離自馬鈴薯青薯9號薯塊病樣，為鐮刀菌(Fusariumspp.)，均純化保存至青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g,葡萄糖15 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2)。

1.1.3 主要儀器

電子天平(梅特勒—托利多儀器有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司)；電熱恒溫干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；全溫?fù)u瓶柜(常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司)。

1.2 菌株活化

將保存的分離自青稞白酒糟醅的菌株從4 ℃冰箱取出，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，備用。

1.3 活性菌株的篩選及穩(wěn)定性評價(jià)

采用平板對峙法[20]，在距直徑9 cm的培養(yǎng)皿邊緣2 cm處接種分離自青稞白酒糟醅的菌株，相對的另一側(cè)接種直徑5 mm的病原真菌，每個(gè)處理重復(fù)3次，以只接種病原真菌的處理作為對照。置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察分離自青稞白酒糟醅的菌株與病原真菌之間有無抑菌帶出現(xiàn)，測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。計(jì)算公式如下：

抑制率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100

為了確定活性菌株的穩(wěn)定性，將篩選得到的有抑菌活性的菌株進(jìn)行穩(wěn)定性評價(jià)，方法同上。分別將供試拮抗菌和病原真菌對峙培養(yǎng)7 d和14 d后，測量抑菌帶寬度，計(jì)算14 d時(shí)抑菌帶寬度縮小率(VF)，比較各活性菌株的抑菌穩(wěn)定性。穩(wěn)定評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[21]：“--”,VF≥70%為不穩(wěn)定；“-”,50%≤VF<70%為較不穩(wěn)定；“+”,20%≤VF<50%為較穩(wěn)定；“++”,VF<20%為穩(wěn)定。計(jì)算公式如下：

VF(%)=[(7 d抑菌帶寬度值-14 d抑菌帶寬度值)/7 d抑菌寬帶值]×100

1.4 活性菌株的鑒定

1.4.1 活性菌株的生理生化特征

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第九版)[22]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[23]對活性菌株分別進(jìn)行葡萄糖氧化發(fā)酵，檸檬酸鹽利用，接觸酶，糖、醇類發(fā)酵，石蕊牛奶測試，明膠液化，甲基紅(M.R)，硝酸鹽還原，V-P測定以及O-硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷酶(ONPG)測定等試驗(yàn)。

1.4.2 活性菌株的分子生物學(xué)鑒定

活性菌株DNA提取根據(jù)上海生工生物工程股份有限公司的柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒的程序操作。選擇通用的細(xì)菌16S rDNA引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA GG-3′)和P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCG CA-3′)。PCR 擴(kuò)增體系10×Buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol /L)2 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，Taq DNA聚合酶 0.2 μL，水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 40 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 80 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。將得到的16S rDNA序列在網(wǎng)站https：//www.ezbio cloud.net/上進(jìn)行序列對比，用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-Joining方法(Bootstrap值為1 000次)，繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[24]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 24.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制馬鈴薯干腐病病原真菌活性菌株的篩選

2.1.1 分離自青稞白酒糟醅的菌株對病原菌青9A-2-6的抑菌活性

對18株分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-2-6的活性進(jìn)行了測定，由表1可知，菌株JZ1-4-10對病原菌青9A-2-6有較強(qiáng)抑菌活性，抑制率為74.12%。菌株JZ1-1-9病原菌青9A-2-6有中等強(qiáng)度抑菌活性，抑制率為69.22%。其他菌株對病原菌青9A-2-6沒有抑菌活性，且與菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9抑菌作用差異顯著(P<0.05)。

表1 分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制病原菌青9A-2-6的活性

2.1.2 分離自青稞白酒糟醅的菌株對病原菌青9A-5-10的抑菌活性

對18株分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-5-10的活性進(jìn)行了測定，由表2可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9對病原菌青9A-5-10有抑菌活性，抑制率分別為47.16%、41.97%。其他菌株對病原菌青9A-5-10沒有抑菌活性，且與菌株JZ1-4-10、 JZ1-1-9抑菌活性差異顯著(P<0.05)。

2.1.3 分離自青稞白酒糟醅的菌株對病原菌青9A-5-7的抑菌活性

對18株分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-5-7的活性進(jìn)行了測定，由表3可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9對病原菌青9A-5-7有中等抑菌活性，抑制率分別為68.25%、60.44%。其他菌株對病原菌青9A-5-7沒有抑菌活性，且與菌株JZ1-4-10、JZ1-1-9抑菌活性差異顯著(P<0.05)。

表3 分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制病原菌青9A-5-7的活性

2.1.4 分離自青稞白酒糟醅的菌株對病原菌青9A-4-13的抑菌活性

對18株分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制青9A-4-13的活性進(jìn)行了測定，由表4可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9對病原菌青9A-4-13有中等抑菌活性，抑制率分別為62.95%、59.67%。其他菌株對病原菌青9A-4-13沒有抑菌活性，且與菌株JZ1-4-10、JZ1-1-9抑菌活性差異顯著(P<0.05)。

表4 分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制病原菌青9A-4-13的活性

表5 分離自青稞白酒糟醅的菌株對病原菌抑菌活性的穩(wěn)定性

2.2 活性菌株的穩(wěn)定性評價(jià)

通過初篩，共篩選出2株對馬鈴薯病原真菌有抑菌作用的活性菌株，分別為菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9。為了確定它們抑菌活性的穩(wěn)定性，進(jìn)行抑菌活性的穩(wěn)定性評價(jià)。如表5所示，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9對馬鈴薯病原真菌青9A-2-6、青9A-5-7和青9A-5-10的抑菌活性穩(wěn)定性較強(qiáng)，穩(wěn)定性為“++”；對青9A-4-13的抑菌活性穩(wěn)定性較弱，穩(wěn)定性為“+”；青9A-2-6、青9A-5-7和青9A-5-10與青9A-4-13穩(wěn)定性差異顯著(P<0.05)。可見，菌株JZ3-1-15和JZ1-1-9對病原菌青9A-2-6、青9A-5-7和青9A-5-10的抑菌活性穩(wěn)定。

2.3 活性菌株的鑒定

2.3.1 生理生化鑒定

由表3可知，菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9均可使明膠液化，石蕊牛乳凝固，可利用蔗糖、麥芽糖及檸檬酸，有氧或無氧分子均參與分解葡萄糖，可以產(chǎn)生ONPG，而接觸酶試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)均呈陰性。菌株JZ1-4-10不能利用甘露醇，甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陰性，硝酸鹽還原呈陽性。菌株JZ1-1-9還可利用甘露醇，甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陽性，硝酸鹽還原呈陰性。

表6 菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9的生理生化特征

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

將菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9測序得到的16S rDNA序列提交至https：//www.ezbiocloud.net/，與數(shù)據(jù)庫中已知的16S rDNA序列進(jìn)行比對，并下載與菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9的16S rDNA序列同源性大于95%的序列，使用MEGA 7.0軟件，根據(jù)Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果表明，菌株JZ1-4-10與暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)聚類同一分支，親緣關(guān)系最近，相似度高達(dá)99.58%；菌株JZ1-1-9與菌株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)聚類同一分支，親緣關(guān)系最近，相似度高達(dá)100%。結(jié)合菌株JZ1-4-10和JZ1-1-9的生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，最終將菌株JZ1-4-10鑒定為暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)，菌株JZ1-1-9鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。

3 討論與結(jié)論

目前，馬鈴薯干腐病貯藏病害的防治以化學(xué)藥劑為主，但是長期施用化學(xué)藥劑已造成一系列嚴(yán)重問題，生物防治手段對環(huán)境無污染，安全性高，成為解決這一問題的有效途徑。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離自青稞白酒糟醅的18株菌中有2株對馬鈴薯干腐病病原菌有較好的抑菌活性，說明來源自青稞白酒糟醅中的2株芽孢桿菌具有被開發(fā)為生物防治藥劑的潛力。

經(jīng)鑒定，菌株JZ1-1-9為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，菌株JZ1-4-10為暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)，均屬于芽孢桿菌屬。張德峰等[25]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌對馬鈴薯干腐病具有較好的防治效果。據(jù)報(bào)道，貝萊斯芽孢桿菌對煙草黑脛病菌、水稻條斑病菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓炭疽病菌、小麥赤霉病菌等植物病原菌有顯著的抑菌活性[26-29]。近十年來新發(fā)現(xiàn)的暹羅芽孢桿菌，具有廣譜的抑菌活性，其對火龍果炭疽病菌、棉花立枯病菌、花生白絹病菌、梨黑斑病菌等均有顯著的抑菌作用[30-31]。關(guān)于分離自青稞白酒糟醅貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)和暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)對馬鈴薯干腐病的防治未見報(bào)道，本研究為馬鈴薯干腐病的生物防治提供一種新來源。

貯藏馬鈴薯容易腐爛，這種情況在農(nóng)戶窖藏中非常普遍，是制約馬鈴薯貯藏質(zhì)量和影響窖藏收益的主要瓶頸。本研究從生物防治研究出發(fā)，對來源青稞白酒糟醅的18株菌通過平板對峙法篩選出有抑制馬鈴薯干腐病病原菌的活性菌株，證明分離自青稞白酒糟醅的菌株確實(shí)對馬鈴薯干腐病的防治有一定的作用。該研究結(jié)果有望將青稞白酒酒糟開發(fā)成一種新型、高效、低毒的微生物能源，可以為植物病害的生物防治奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。下一步將進(jìn)行抑菌作用機(jī)理、靶標(biāo)位點(diǎn)、生防抑菌劑、以及代謝產(chǎn)物等方面的研究。