羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002株的制備與鑒定

張一幟，任小俠，李 建，王秀麗，劉元杰，李俊平，張 媛

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

羊鏈球菌病是由溶血性鏈球菌引起的一種急性熱性傳染病，多發(fā)于冬春寒冷季節(jié)(11月至次年4月)。羊鏈球菌病主要通過(guò)消化道和呼吸道傳播，自然感染潛伏期通常為2～10 d。病羊主要癥狀是呼吸困難，行動(dòng)不便，臨死時(shí)跪地不起，伴有磨牙、呻吟等癥狀。臨床上特征表現(xiàn)為發(fā)熱，下頜和咽喉部腫脹，膽囊腫大和纖維素性肺炎[1]。在我國(guó)，羊鏈球菌嚴(yán)重危害山羊、綿羊健康，該菌也能夠感染人，引起高熱傷口感染、心內(nèi)膜炎、肺炎及會(huì)厭炎等細(xì)菌感染典型癥狀[2]。

羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002為羊鏈球菌滅活疫苗生產(chǎn)、檢驗(yàn)用強(qiáng)毒菌種，也是羊鏈球菌菌種免疫原性鑒定的攻毒菌種。此二株菌種最初由青海牧醫(yī)所于青海省貴南縣分離所得，現(xiàn)保存于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002均屬于強(qiáng)毒株，血清型為蘭氏C型，屬馬鏈球菌獸疫亞種(S.equisubsp.zooepidimicus)[3]。該菌環(huán)境抵抗力較弱，對(duì)濕熱和干燥均敏感，在60 ℃處理30 min即會(huì)死亡。該菌對(duì)于紅霉素、青霉素、四環(huán)素、金霉素以及磺胺類(lèi)藥物都非常敏感[4]。《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版中規(guī)定這兩株菌種在凍干狀態(tài)下2～8 ℃的保存期為4年，新制備的菌種應(yīng)按照《規(guī)程》進(jìn)行鑒定。本文對(duì)CVCC55001、CVCC55002株羊鏈球菌的制備和鑒定方法進(jìn)行了研究，并對(duì)該菌的適宜生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行比對(duì)，以期為該菌的鑒定和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制修訂提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種 羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002 株，2016年3月22日凍干，F(xiàn)7，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 馬丁瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基、馬丁肉湯培養(yǎng)基、緩沖肉湯培養(yǎng)基、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(TG)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、生理鹽水、5%蔗糖脫脂牛奶均購(gòu)自北京中海生物技術(shù)有限公司; ATB鏈球菌快速鑒定試劑盒、哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自Bio Mérieux公司，革蘭氏染色液購(gòu)自海博生物，莢膜染色液購(gòu)自源葉生物，鏈球菌分型試劑盒購(gòu)自O(shè)xoid公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)兔購(gòu)自北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司; 健康綿羊分別購(gòu)自河北、甘肅某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.4 菌種復(fù)壯 開(kāi)啟2016年3月22日凍干的羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002株各一支，用0.5 mL馬丁肉湯溶解后，分別接種含10%綿羊脫纖血馬丁瓊脂平板(以下簡(jiǎn)稱(chēng)血平板)2付，37 ℃培養(yǎng)18 h。之后挑取該平板上的典型菌落，分別接種含10%綿羊脫纖血瓊脂斜面2支，37 ℃培養(yǎng)24 h，血斜培養(yǎng)物呈灰色、半透明、濕潤(rùn)、粘稠。將血斜培養(yǎng)物劃取少量接種含10%馬血清的馬丁肉湯，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，肉湯培養(yǎng)物一致混濁，無(wú)菌膜。將肉湯培養(yǎng)物20倍稀釋后，2 mL/只頸靜脈注射1～2歲健康綿羊。羊于4～5 d內(nèi)死亡，剖解無(wú)菌取肝臟和心血，用接種環(huán)分別取少量肝臟、心血接種血平板各1付，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.5 菌種的鑒定

1.5.1 真空度測(cè)定、純粹檢驗(yàn)及剩余水分測(cè)定 根據(jù)2015年版《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)[5]。

1.5.2 培養(yǎng)特性鑒定 用接種環(huán)取刮取少量菌體在含10%綿羊脫纖血瓊脂平板或哥倫比亞瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)。

1.5.3 形態(tài)和生化特性鑒定 取新鮮培養(yǎng)的哥倫比亞瓊脂平板上的菌體進(jìn)行革蘭氏染色、莢膜染色，進(jìn)行判定。參照ATB鏈球菌快速鑒定試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行生化特性檢查。

1.5.4 血清學(xué)特性鑒定 按照Oxoid鏈球菌分群試劑盒說(shuō)明書(shū)，挑取新鮮培養(yǎng)物，加至酶溶液中混勻、消化后，分別與革蘭氏A、B、C、D、E、F群典型血清進(jìn)行反應(yīng)，觀察是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。

1.5.5 培養(yǎng)基比對(duì)研究 分別使用含10%新生牛血清改良馬丁瓊脂、改良馬丁瓊脂、含10%新生牛血清TSA、TSA對(duì)于CVCC55001、CVCC55002肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，平板培養(yǎng)18～24 h觀察記錄結(jié)果。

1.5.6 免疫原性鑒定 按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》制備羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002滅活疫苗[6]，2～8 ℃保存。分別免疫1～2歲各綿羊4頭，5 mL/頭。再分別用CVCC55001、CVCC55002新鮮菌液對(duì)同一批羊進(jìn)行測(cè)毒，14 d后確定各株的最小致死量。免疫21 d后使用CVCC55001、CVCC55002最小致死量對(duì)免疫組、對(duì)照組羊進(jìn)行攻毒，觀察各組羊狀態(tài)持續(xù)21 d，記錄結(jié)果。

1.5.7 毒力鑒定 分別采集CVCC55001、CVCC55002株測(cè)毒試驗(yàn)中瀕死羊心血，接種含5%血清緩沖肉湯，培養(yǎng)16 h后用馬丁肉湯1000倍稀釋瀕死羊心血培養(yǎng)物，2 mL/頭靜脈注射綿1～2歲羊2頭，之后對(duì)于菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。再取出 1 支CVCC55001株和CVCC55002株瀕死羊心血，接種含5%血清緩沖肉湯，培養(yǎng)16 h。次日，統(tǒng)計(jì)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果并按該結(jié)果使用馬丁肉湯將兩種菌液分別稀釋至90 CFU/mL(規(guī)程要求70～100 CFU/mL)，同時(shí)復(fù)數(shù)確認(rèn)實(shí)際注射劑量，1 mL/只靜脈注射家兔各5只。要求綿羊注射后21 d內(nèi)全部死亡，家兔注射后10 d內(nèi)全部死亡[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 真空度測(cè)定 對(duì)凍干的2株菌種進(jìn)行真空度測(cè)定，CVCC55001株194/200、CVCC55002株194/200呈現(xiàn)白色或粉色或紫色輝光，符合規(guī)定；將不符合規(guī)定的凍干菌種進(jìn)行無(wú)害化處理。

2.2 純粹檢驗(yàn) 分別各抽取5支真空度測(cè)定良好的CVCC55001、CVCC55002株菌種進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，結(jié)果均為5/5符合規(guī)定。

2.3 剩余水分測(cè)定 分別各抽取8支真空度測(cè)定良好的CVCC55001、CVCC55002株菌種進(jìn)行剩余水分測(cè)定，剩余水分測(cè)定結(jié)果為CVCC55001：0.8%、0.6%、0.9%、1.2%；CVCC55002：0.6%、0.7%、0.9%、1.1%，均符合規(guī)定。

2.4 培養(yǎng)特性鑒定 肉眼觀察培養(yǎng)18 h的CVCC55001、CVCC55002株菌落狀態(tài)為灰色、半透明、濕潤(rùn)、粘稠，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，對(duì)光觀察可見(jiàn)菌落周?chē)幸蝗ν该魅苎h(huán)，為β溶血(圖1)。

圖1 CVCC55001株(左)、CVCC55002株(右)菌落培養(yǎng)形態(tài)

2.5 形態(tài)和生化特性鑒定 挑取新鮮培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性球菌，呈單個(gè)、成對(duì)和短鏈排列。挑取新鮮培養(yǎng)物進(jìn)行莢膜染色，結(jié)果為有透明狀莢膜。符合形態(tài)鑒定規(guī)定。使用自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)讀取CVCC55001、CVCC55002菌種反應(yīng)結(jié)果相同，均為馬鏈球菌獸疫亞種，具體詳見(jiàn)表1，生化特性鑒定結(jié)果符合規(guī)定。

表1 CVCC55001、CVCC55002菌種生化特性鑒定結(jié)果

2.6 血清學(xué)特性鑒定 按照Oxoid鏈球菌分群試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，菌種CVCC55001、CVCC55002株菌落與A、B、D、E、F群典型血清均無(wú)凝集反應(yīng)，與C群典型血清出現(xiàn)凝集反應(yīng)。判定血清學(xué)特性鑒定結(jié)果均符合規(guī)定。

2.7 培養(yǎng)基比對(duì)研究 分別對(duì)CVCC55001、CVCC55002肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，將原菌液稀釋至10-5/3后，吸取0.1 mL滴板培養(yǎng)20 h。結(jié)果可以看到，無(wú)論是改良馬丁瓊脂還是TSA，在不加新生牛血清(NBS)的情況下都無(wú)鏈球菌生長(zhǎng)，說(shuō)明血清是CVCC55001、CVCC55002株菌生長(zhǎng)必須營(yíng)養(yǎng)成分。對(duì)比改良馬丁瓊脂(含血清)和TSA(含血清)的結(jié)果，菌落數(shù)相近，TSA(含血清)平板上的菌落較大，說(shuō)明TSA促進(jìn)該菌生長(zhǎng)速度優(yōu)于改良馬丁瓊脂，二者對(duì)于該菌的促生長(zhǎng)能力相近(表2)。

表2 CVCC55001、CVCC55002菌種不同培養(yǎng)基活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

2.8 免疫原性鑒定 經(jīng)測(cè)毒得到兩株菌對(duì)于綿羊的最小致死劑量為：CVCC55001 1.2×104CFU、CVCC55002 2.6×104CFU。將新鮮培養(yǎng)菌液稀釋至最小致死劑量對(duì)于免疫組和對(duì)照組進(jìn)行攻毒，同時(shí)進(jìn)行復(fù)數(shù)，1 d后計(jì)算確定實(shí)際攻毒劑量。攻毒后14 d內(nèi)，CVCC55001株對(duì)照組2/2死亡，免疫組4/4存活；CVCC55002株對(duì)照組2/2死亡，免疫組3/4存活(表3)，CVCC55001、CVCC55002株免疫原性鑒定符合規(guī)定。

2.9 毒力鑒定 將CVCC55001、CVCC55002死羊心血緩沖肉湯培養(yǎng)物1000倍稀釋?zhuān)o脈注射1～2歲綿羊2頭各2 mL，次日根據(jù)復(fù)數(shù)結(jié)果計(jì)算實(shí)際注射劑量為CVCC55001:1.2×105CFU/頭、CVCC55002:3.4×105CFU/頭，綿羊經(jīng)注射后21 d內(nèi)全部死亡。分別注射家兔CVCC55001 91 CFU/只、CVCC55002 85 CFU/只，在注射后10 d內(nèi)全部死亡(表4)。CVCC55001、CVCC55002株毒力鑒定符合規(guī)定。

表3 CVCC55001、CVCC55002菌種免疫原性鑒定試驗(yàn)結(jié)果

表4 CVCC55001、CVCC55002菌種毒力鑒定試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與小結(jié)

本研究鑒定該批羊鏈球菌CVCC55001及CVCC55002株培養(yǎng)特性、形態(tài)及生化特性、血清學(xué)特性、免疫原性、毒力、純粹、剩余水分及真空度項(xiàng)目均符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。在免疫原性和毒力鑒定中顯示CVCC55001對(duì)于羊的最小致死劑量為1.2×104CFU、對(duì)于兔的致死劑量為91 CFU；CVCC55002對(duì)于羊的最小致死劑量為2.6×104CFU、對(duì)于兔的致死劑量為85 CFU。馬鏈球菌獸疫亞種鏈球菌對(duì)于其他動(dòng)物也有著感染性，孫智遠(yuǎn)等使用鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種C74-63株對(duì)兔最小致死量為250 CFU，豬最小致死量為3000 CFU[7]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于菌種的功能研究也不斷深入，Xu 等對(duì)于鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種抗吞噬作用的研究中，利用轉(zhuǎn)座子誘變定位了若干與抗吞噬作用相關(guān)的基因[8]，這些基因的功能與該菌的致病能力密切相關(guān)，此類(lèi)研究也為今后提升優(yōu)化菌種鑒定的精確性和科學(xué)性提供了思路。

在《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》中規(guī)定該菌種培養(yǎng)時(shí)使用改良馬丁瓊脂和綿羊血馬丁瓊脂平板培養(yǎng)[6]。但在實(shí)際鑒定和研究過(guò)程中，由于馬丁瓊脂和改良馬丁瓊脂在制備中均需求牛肉湯和豬肺湯等天然性成分，導(dǎo)致這兩種培養(yǎng)基不同批次的促生長(zhǎng)能力時(shí)常出現(xiàn)差異。TSA作為國(guó)際上廣泛應(yīng)用的一般細(xì)菌培養(yǎng)基，配制簡(jiǎn)便，標(biāo)準(zhǔn)明確。本研究將TSA與改良馬丁瓊脂對(duì)于CVCC55001和CVCC55002的促生長(zhǎng)情況進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)TSA能夠替代改良馬丁瓊脂，同時(shí)還具有更強(qiáng)的促生長(zhǎng)速度，為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)程對(duì)于該菌的培養(yǎng)基的優(yōu)化和變更提供了參考。