利福昔明乳房注入劑(干乳期)對奶牛的安全性研究

王宏磊，陳孝杰，程雪嬌，焦曉軍，王 猛，徐 飛，陳 晨,劉義明*，李秀波*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國家飼料藥物基準(zhǔn)實驗室，北京 100081；2.天津中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司，天津 300380；3.佛山南海東方澳龍制藥有限公司，廣東佛山 528234)

奶牛乳房炎是由于乳房無法完全抵御致病微生物的入侵和增殖而造成的乳房組織及乳頭發(fā)炎的一種常見疾病，其主要特點是乳汁發(fā)生理化性質(zhì)及細(xì)菌學(xué)變化，乳腺組織發(fā)生病理學(xué)變化。在臨床上將乳房炎分為隱性乳房炎和臨床型乳房炎。乳房炎不僅造成奶牛產(chǎn)奶量下降、影響牛奶品質(zhì)，也使奶牛過早淘汰，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，嚴(yán)重困擾著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。盡管對奶牛乳房炎進(jìn)行了大量研究，但目前該疾病仍然是困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè)的一大頑疾，無法根除。據(jù)報道，全球奶牛30%患有乳房炎，隱性乳房炎的患病率更是達(dá)50%以上[4]。病原菌的感染是引起奶牛乳房炎的主要因素，常見致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌，這3 種細(xì)菌引起的乳房炎占總發(fā)病率的90 %以上[5-7]。由于奶牛干乳期乳腺的抵抗力低，病原菌容易乘虛而入，干乳期是奶牛乳房炎的高發(fā)期，尤其是隱性乳房炎，難以發(fā)現(xiàn)，給泌乳期造成嚴(yán)重的隱患。因此,在即將進(jìn)入干乳期時給奶牛用藥，能有效地預(yù)防和治療干乳期乳房炎[8-9]。利福昔明是利福霉素類衍生物，為非氨基糖苷類半合成抗菌藥[10]。其作用機制為抑制細(xì)菌多聚酶，阻斷RNA的轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[11]。其抗菌活性強，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌都有良好的效果[12]。它最初是用來防治人體局部細(xì)菌感染的藥物，并先后在意大利，墨西哥，西班牙和美國上市。利福昔明在體內(nèi)不易吸收，意大利Fatro公司開發(fā)了動物用乳房注入劑、子宮注入劑和噴霧劑，用于治療奶牛干乳期乳房炎、子宮炎癥及皮膚感染。目前，利福昔明乳房注入劑(商品名Fatroximin或Fatrox)已在歐洲得到廣泛的應(yīng)用[13]。國內(nèi)用于干乳期治療乳房炎的藥物相對較少，為提高干乳期奶牛乳房炎的防治效果，降低養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)殖效益，天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司成功研制了利福昔明乳房注入劑(干乳期)，為干乳期奶牛乳房炎的預(yù)防和治療提供一種新的選擇。本研究考察了利福昔明乳房注入劑(干乳期)對奶牛的安全性，以期為該制劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 利福昔明乳房注入劑(干乳期)，包裝規(guī)格:5 mL：0.1 g，批號：120810；由天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司提供；推薦用藥方法：干乳期奶牛每頭牛每個乳區(qū)給藥1支。

1.2 試驗動物 參考FDA相關(guān)指導(dǎo)原則，實驗動物為健康泌乳期奶牛12頭，產(chǎn)奶量在20～35 kg/d之間。

1.3 給藥 12頭泌乳期奶牛四個乳區(qū)分別注入利福昔明乳房注入劑(干乳期)一支，給藥1次。奶牛擠奶后，先用消毒毛巾清潔各乳區(qū)，再用消毒藥液浸泡乳頭約30秒，然后進(jìn)行乳頭內(nèi)灌注給藥。灌注時將含藥推注管頭插入乳頭，輕輕推壓活塞，將藥物緩緩注入乳池內(nèi)，隨后輕輕按摩相應(yīng)乳區(qū)，使藥物均勻分布。

1.4 乳中體細(xì)胞數(shù)檢測 給藥前1 d、給藥當(dāng)天(第0天)和給藥后第12小時、3、5、7、10 天，四個乳區(qū)分別采集奶樣，每次擠奶前棄掉前3把奶，用50 mL滅菌聚丙烯離心管采集奶樣，直接使用體細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行牛奶中體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count，SCC)檢測。

1.5 日產(chǎn)奶量統(tǒng)計 給藥前1 d、給藥當(dāng)天和給藥后第1、3、5、7、10 天統(tǒng)計奶牛的日產(chǎn)奶量。每天早、中、晚分別對每頭奶牛擠奶，每頭奶牛每次擠奶匯入專用收集桶中，稱重并記錄，統(tǒng)計每頭奶牛每天3次擠奶總產(chǎn)奶量(即日產(chǎn)奶量)，計算12頭奶牛的平均日產(chǎn)奶量。

1.6 病原菌分離鑒定 分別在給藥前0日和給藥后第10日各采集奶樣1次進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查。用多種選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)分離病原菌。將奶樣接種至選擇性培養(yǎng)基分離病原菌，主要分離金黃色葡萄球菌、鏈球菌(停乳鏈球菌、乳房鏈球菌)、大腸桿菌。分離菌株經(jīng)純化培養(yǎng)后，依據(jù)菌落形態(tài)、染色特征、生化特點鑒定其種類。

1.7 直腸溫度檢查 給藥前1天、給藥當(dāng)天和給藥后第12 小時、3、5、7、10 天，測量試驗?zāi)膛５闹蹦c溫度，觀察試驗?zāi)膛Ｔ诮o藥前后體溫是否有明顯變化。

1.8 臨床癥狀觀察 整個試驗過程中，每天觀察各試驗?zāi)膛５呐R床癥狀并進(jìn)行記錄。一旦出現(xiàn)臨床癥狀立即采取相應(yīng)措施。

2 結(jié)果與分析

2.1 體細(xì)胞計數(shù) 由表1數(shù)據(jù)可知，12頭奶牛給藥前不同乳區(qū)體細(xì)胞檢測結(jié)果與給藥后各時間點奶樣中體細(xì)胞數(shù)未見顯著性差異(P>0.05)。

2.2 產(chǎn)奶量 由表2可知，12頭奶牛在給予利福昔明乳房注入劑(干乳期)后，與給藥前相比，各時間點產(chǎn)奶量無顯著變化(P>0.05)。

2.3 細(xì)菌分離鑒定 在給藥前0 d采集的奶樣中，分離的大腸桿菌、鏈球菌和葡萄球菌分別為7株、6株和9株，給藥后第10日，未檢測到大腸桿菌和葡萄球菌，僅檢測到1株鏈球菌(表3)。

表1 12頭奶牛不同乳區(qū)給藥前后奶樣中的體細(xì)胞數(shù)(萬/mL)統(tǒng)計

表2 12頭奶牛各時間點的產(chǎn)奶量(kg/d)

2.4 奶牛的直腸溫度 由表4可知，所有奶牛在給藥前和給藥后不同時間點的直腸溫度均在奶牛的正常溫度范圍內(nèi)，說明按推薦劑量單次給藥對奶牛的體溫?zé)o顯著影響。

2.5 臨床癥狀觀察 12頭奶牛四個乳區(qū)分別單劑量給予利福昔明乳房注入劑(干乳期)，在整個試驗期間，給藥乳區(qū)未出現(xiàn)紅、腫、熱、痛等臨床癥狀。

3 討論與結(jié)論

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中非常高發(fā)的一種疾病，能夠造成牛奶質(zhì)量的急劇下降，奶牛過早的被淘汰，及治療費用的增加，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[14-15]。獸醫(yī)臨床上導(dǎo)致奶牛乳房炎的致病菌種類繁多，但主要的致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌[16-18]。利福昔明是半合成利福霉素衍生物，具有組織吸收水平低的特點，且對厭氧菌具有良好的殺滅效果，適合局部用藥，制成乳房注入劑直接注入乳房,能很好的發(fā)揮其殺菌作用[19-20]。關(guān)于利福昔明的安全性，國內(nèi)外均有一些報道，據(jù)Borelli等[21]的報道，用大鼠和小鼠做單劑量口服急性毒性試驗，結(jié)果表明利福昔明對大鼠的LD50大于2000 mg/kg·bw，小鼠的LD50為2000 mg/kg·bw。Bertoli等[22-23]的研究表明，利福昔明以50、100 mg/kg·bw劑量口服無致畸作用。據(jù)美國FDA報道[24]，口服利福昔明100 mg/kg·bw對雄性和雌性大鼠的生育能力、胎兒產(chǎn)后發(fā)育及下一代生殖性能均無不良作用。任淑萍等[25]報道，大鼠每天口服利福昔明25、50、100 mg/kg，連續(xù)180 d，除雌鼠血清膽固醇呈劑量相關(guān)性增加外，無致突變、致畸及其他毒性作用。史同瑞等[26]對利福昔明混懸乳劑在豚鼠、家兔和羊上進(jìn)行了安全性研究，致敏性試驗顯示豚鼠均未出現(xiàn)過敏性反應(yīng)，皮膚刺激性試驗顯示家兔皮膚未見異常變化，黏膜刺激性試驗中僅有1只家兔的陰道黏膜出現(xiàn)輕微的充血現(xiàn)象，羊的乳腺刺激性試驗顯示羊乳房未見異常癥狀, 以上結(jié)果表明利福昔明混懸乳劑是一種安全性良好的制劑。為了評價干乳期利福昔明乳房注入劑在奶牛臨床上應(yīng)用的安全性，王建等[27]對干乳期利福昔明乳房注入劑進(jìn)行了豚鼠主動皮膚過敏性試驗、家兔的皮膚刺激性試驗和陰道刺激性試驗。在豚鼠主動皮膚過敏性試驗中，給藥組動物皮膚未見紅斑與水腫，在家兔的皮膚刺激性試驗和陰道刺激性試驗中，給予利福昔明乳房注入劑的試驗組和生理鹽水的對照組，兩組給藥部位的皮膚都沒有出現(xiàn)紅斑和水腫,在家兔的陰道刺激試驗中，試驗組和對照組的陰道黏膜沒有出現(xiàn)明顯的白細(xì)胞浸潤、充血和水腫現(xiàn)象,以上結(jié)果表明利福昔明乳房注入劑對豚鼠的皮膚不產(chǎn)生明顯的皮膚過敏性反應(yīng)，對家兔的皮膚和陰道無刺激性。徐飛等[28]對利福昔明子宮注入劑在家兔陰道黏膜刺激性研究中也得到了類似的結(jié)論。本實驗中奶牛給藥前后不同乳區(qū)奶中體細(xì)胞數(shù)未見明顯變化，產(chǎn)奶量在給藥前后也未見顯著變化，12頭奶牛在給藥前和給藥后不同時間點的直腸溫度均在奶牛的正常溫度范圍內(nèi)，12頭奶牛四個乳區(qū)在整個試驗期間，給藥乳區(qū)未出現(xiàn)紅、腫、熱、痛等臨床癥狀。結(jié)合前面王建等對干乳期利福昔明乳房注入劑進(jìn)行的豚鼠主動皮膚過敏性試驗、家兔的皮膚刺激性試驗和陰道刺激性試驗結(jié)果，說明利福昔明乳房注入劑(干乳期)對奶牛無任何不良反應(yīng)，安全性高。郭旭[29]對利福昔明乳房注入劑對干奶期奶牛臨床性乳房炎預(yù)防效果的實驗表明：高、中、低劑量的利福昔明乳房注入劑均能顯著的降低乳中金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌的數(shù)量，本試驗在給予利福昔明乳房注入劑(干乳期)后也得到了類似的結(jié)論，說明利福昔明能夠殺死臨床上導(dǎo)致奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌。

表3 實驗?zāi)膛８鲿r間點不同乳區(qū)奶中細(xì)菌分離情況

表4 12頭奶牛不同時間點的直腸溫度(℃)

12頭奶牛四個乳區(qū)分別單次注入利福昔明乳房注入劑(干乳期 5 mL：0.1 g)，不同時間點體溫及奶樣中體細(xì)胞數(shù)與給藥前相比未見明顯變化，奶牛的產(chǎn)奶量也未見顯著變化，奶牛給藥乳區(qū)未出現(xiàn)紅、腫、熱、痛等臨床乳房炎癥狀，與給藥前相比給藥后細(xì)菌檢出數(shù)有所降低。上述結(jié)果表明奶牛按推薦劑量單次給予利福昔明乳房注入劑(干乳期)對奶牛無任何不良反應(yīng)，安全性較高。