管碟法測(cè)定硫酸安普霉素效價(jià)的不確定度評(píng)定

戴 青，韓寧寧，王 軒，楊秀玉，趙 暉

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

硫酸安普霉素是一種動(dòng)物專用的氨基糖苷類抗菌藥物，《中國(guó)獸藥典》2015年版一部[1]收載了硫酸安普霉素及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中含量測(cè)定項(xiàng)均采用抗菌藥物微生物檢定法進(jìn)行測(cè)定。目前，國(guó)際上通用的抗菌藥物微生物檢定法包括管碟法和濁度法，管碟法是各國(guó)藥典收載的經(jīng)典抗菌藥物微生物檢定通用方法。不確定度評(píng)定是通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)引入的不確定度進(jìn)行評(píng)估，以分析各因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響[2]。檢測(cè)結(jié)果的可靠性很大程度上取決于測(cè)量不確定度大小，測(cè)量不確定度越小，說(shuō)明檢測(cè)水平越高，檢測(cè)結(jié)果的使用價(jià)值越大[3-4]。測(cè)量不確定度對(duì)于實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)、測(cè)量結(jié)果臨界值的判斷、方法的確認(rèn)及檢測(cè)工作國(guó)際化等方面都具有重要意義[5-6]。本文根據(jù)JJF1059-2019《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[7]中有關(guān)規(guī)定，對(duì)管碟法測(cè)定硫酸安普霉素可溶性粉中硫酸安普霉素含量的不確定度進(jìn)行了分析與評(píng)估，以期為準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)測(cè)量結(jié)果與評(píng)價(jià)檢測(cè)報(bào)告提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ZY-300IV抗菌藥物效價(jià)測(cè)量?jī)x(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)；AX-205電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；恒溫培養(yǎng)室；安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，效價(jià)測(cè)定用，517單位/mg，批號(hào)：K0231610)；硫酸安普霉素可溶性粉供試品(山西新世紀(jì)生物制藥有限公司，批號(hào)：190401，規(guī)格：100 g︰10 g(1000萬(wàn)單位))；抗菌藥物Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基(北京中海生物科技有限公司)；枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取硫酸安普霉素可溶性粉供試品250 mg，置25 mL容量瓶中，加滅菌水溶解并稀釋制成每1 mL中約含1000單位的溶液。精密量取該溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中約含100單位的溶液。再分別量取100單位/mL的溶液5 mL，分別置50、100 mL量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)稀釋至刻度，搖勻，得到濃度分別為10單位/mL和5單位/mL的溶液，作為供試品溶液的高、低劑量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品48 mg，置25 mL容量瓶中，加滅菌水溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中約含1000單位的溶液，稀釋步驟同供試品溶液。

1.2.3 雙碟的制備與培養(yǎng) 取平底雙碟約8套(n)，分別加入加熱融化的培養(yǎng)基20 mL，放置水平臺(tái)上使凝固，作為底層。另取加熱融化后的培養(yǎng)基適量，放冷至50 ℃，加入枯草芽孢桿菌的菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5 mL，攤布均勻，作為菌層。冷卻后，在每一雙碟中以等距離安置不銹鋼小管4(k)個(gè)，待用。將上述稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液分別滴加于不銹鋼小管內(nèi)，在35～37 ℃恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)16～18 h。

1.2.4 抑菌圈直徑的測(cè)定與效價(jià)計(jì)算 取出培養(yǎng)好的雙碟，用抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)量各個(gè)抑菌圈的直徑，照《中國(guó)獸藥典》2015年版一部附錄1431生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的2.2法進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)與效價(jià)計(jì)算。當(dāng)可靠性檢驗(yàn)結(jié)果為回歸非常顯著(P<0.01)與偏離平行不顯著(P>0.05)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才成立。

2 結(jié)果與分析

抑菌圈直徑測(cè)定時(shí)，對(duì)供試品溶液進(jìn)行掃描測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 不確定度來(lái)源分析 對(duì)抗菌藥物微生物檢定法的二劑量管碟法測(cè)量不確定度來(lái)源進(jìn)行分析，可將影響硫酸安普霉素效價(jià)測(cè)定的不確定度因素歸為：抑菌圈直徑重復(fù)測(cè)量的不確定度，抑菌圈測(cè)量?jī)x的不確定度，配制溶液(包括稱量、稀釋、定容等操作)的不確定度以及重復(fù)性試驗(yàn)引入的不確定度。

表1 抑菌圈直徑測(cè)量結(jié)果

2.3 各分量的不確定度

2.3.1 抑菌圈直徑重復(fù)測(cè)量的不確定度分量 對(duì)抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)上述公式計(jì)算效價(jià)(y)為102.95單位/mg，同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析得自由度f(wàn)=(k-1)(n-1)=21，其合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差即標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(x1)rel=u(x1)/y=0.080/102.95=0.00078。

u(x2)rel=u(x2)/x=0.012/19=0.00063。

2.3.3 配制溶液的不確定度分量 分為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制與供試品溶液的配制。

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液稀釋過(guò)程中主要使用的是A級(jí)玻璃量器，由單個(gè)玻璃量器體積引入的合成不確定度為

A級(jí)100、50、25 mL單標(biāo)線容量瓶的允許誤差分別為：±0.10、±0.05、±0.03 mL，以B類不確定度計(jì)算，按三角分布估計(jì)，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

uv1=0.10/6=0.04 mL，uv2=0.05/6=0.02 mL，uv3=0.03/6=0.01 mL。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

uv1rel=0.04/100=0.0004，uv2rel=0.02/50=0.0004，uv3rel=0.01/25=0.0004。

配制溶液時(shí)，實(shí)驗(yàn)室溫度接近21 ℃，容量器皿校準(zhǔn)溫度為23.8 ℃，近似于矩形分布。

使用100 mL容量瓶、50 mL容量瓶、25 mL容量瓶，因此，定容體積的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

= 0.0009

2.3.3.2 供試品溶液的不確定度 定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度同標(biāo)準(zhǔn)品溶液定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，移取溶液的不確定度分量同標(biāo)準(zhǔn)品溶液移取溶液的不確定度，供試品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度同標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量的不確定度，供試品質(zhì)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：0.017/250.50=0.00007。

2.3.3.3 配制溶液的不確定度

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)引入的不確定度 結(jié)果如表2所示。重復(fù)性試驗(yàn)取供試品兩份，同時(shí)操作，用極差評(píng)定相對(duì)不確定度：

表2 硫酸安普霉素效價(jià)重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

=0.0085。

2.4 總合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

0.0088。

2.5 擴(kuò)展不確定度Uu(x)/x=0.0088，x=103.65單位/mg，u(x)=0.0088×103.65 =0.91單位/mg。本試驗(yàn)采用置信概率為95%的包含因子，根據(jù)t分布表，取k=2，則擴(kuò)展不確定度為U=2u(x)=2×0.91=1.8單位/mg。硫酸安普霉素效價(jià)測(cè)定的結(jié)果可表示為：(103.6±1.8)單位/mg(k=2)。

3 討論與結(jié)論

參照《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》[8]，二劑量管碟法加樣順序?yàn)椋焊邼舛葮?biāo)準(zhǔn)品溶液→高濃度供試品溶液→低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液→低濃度供試品溶液，每次滴加的溶液應(yīng)為同一濃度。由加樣時(shí)間引入的不確定度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響為系統(tǒng)誤差，在試驗(yàn)中，應(yīng)盡量減少加樣時(shí)間，以將該因素的影響控制在最小，在不確定度評(píng)定中做零項(xiàng)處理[9-10]。

綜上，各因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響依次為：重復(fù)性試驗(yàn)>溶液稀釋>抑菌圈直徑重復(fù)測(cè)量>抑菌圈測(cè)量?jī)x>樣品稱量。由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品與供試品稱量引入的不確定度最小，儀器引入的不確定度次之，而測(cè)量不確定度的主要來(lái)源為重復(fù)性試驗(yàn)，其次為溶液的稀釋過(guò)程，提示試驗(yàn)人員應(yīng)注意效價(jià)測(cè)定過(guò)程中稀釋定容的操作過(guò)程，并注意保持重復(fù)性試驗(yàn)條件的一致性，可采用四分法取樣以保證試驗(yàn)樣品的均勻性。通過(guò)對(duì)硫酸安普霉素效價(jià)的不確定度評(píng)定，有助于準(zhǔn)確衡量檢測(cè)結(jié)果，為提高抗生素效價(jià)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度提供了參考依據(jù)。