一枝蒿提取物對(duì)GERD大鼠肺順應(yīng)性及食管炎癥因子的影響

李治建，韓夢婷，羅福祥，霍仕霞，竇 勤，買買提·艾力，斯拉甫·艾白

(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049)

胃食管反流病(GERD)系指胃內(nèi)容物反流入食管，引起不適癥狀和(或)并發(fā)癥的一種疾病。GERD氣道高反應(yīng)如咳嗽、哮喘和支氣管炎等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，胃食管反流病咳嗽(GERC)是GERD的唯一表現(xiàn)[1-2]。GERC采用常規(guī)抑酸治療效果并不理想，質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)的過度使用會(huì)造成一系列安全問題[3-4]，因此尋找有效的治療藥物非常必要。一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.)是新疆中醫(yī)民族醫(yī)常用藥，具有清熱解毒、消食健胃、利膽和解蛇毒等功能[5]，具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、抗病毒、保肝降酶、調(diào)節(jié)免疫及健胃促消化等多種作用[6-7]，對(duì)急、慢性炎癥及炎性滲出均有明顯的抑制作用，對(duì)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)有明顯的抑制作用[8]；一枝蒿還具有調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)的藥理作用[9]，當(dāng)?shù)孛褡遽t(yī)常用其防治各種胃腸道及呼吸道疾病[10]。本研究利用GERD大鼠模型，觀察一枝蒿提取物對(duì)GERD所致氣道高反應(yīng)的改善作用及食管炎癥因子表達(dá)的影響，為其開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 FM肺功能檢測系統(tǒng)，上海玉研科學(xué)儀器有限公司；Nefuqe 15R型高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；GL-88B型漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；K5500型核酸蛋白定量儀，北京凱奧科技發(fā)展有限公司；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-21型電泳槽，均購自北京市六一儀器廠；2500型凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；Bio-Rad MyCycler Thermal Cycler PCR儀，美國伯樂公司；ABI 7500 Real Time PCR 設(shè)備，美國ABI公司。

1.2試藥 一枝蒿提取物：一枝蒿藥材(ArtemisiaRupestrisL.)產(chǎn)自新疆阜康，新疆本草堂大藥房提供(批號(hào)20160729)，由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所藥劑室提取。注射用頭孢呋辛鈉(批號(hào)K171211)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶(CAS號(hào)：9001-75-6)和瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1(TRPV1)拮抗劑(CAS號(hào)：138977-28-3)，均購自美國Sigma公司；葡萄糖粉針劑(批號(hào)180426)，重慶和平制藥有限公司；5-HT4拮抗劑(CAS號(hào)：144625-51-4，批號(hào)GR113808)，Abcam公司；瓊脂糖(批號(hào)A811BA0014)，生工生物工程(上海)股份有限公司；乙酰甲膽堿(Mch,批號(hào)9072217)，北京偉康世紀(jì)醫(yī)療科技有限公司；Trans2K DNA Marker(批號(hào)BM101)，TransZol Up(批號(hào)ET111)和AT311逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶2(LPCAT2)熒光定量試劑盒(批號(hào)208054)，均購自Qiagen凱杰公司；熒光定量引物，烏魯木齊歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.3動(dòng)物 雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量為180～220 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0003。飼養(yǎng)條件為新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所SPF級(jí)動(dòng)物房，每籠大鼠塑料籠盒中飼養(yǎng)動(dòng)物少于5只，自由飲水?dāng)z食。室溫為20～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，光照黑暗各12 h；實(shí)驗(yàn)前適用性飼養(yǎng)5 d，經(jīng)過一般行為學(xué)觀察，選用健康并符合要求的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中全部操作均遵循新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

2 方法

2.1GERD模型的建立及藥物干預(yù) 將一枝蒿藥材粉碎，采用10倍量體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇提取3次，每次1 h，合并3次提取液濃縮成質(zhì)量濃度為0.6 g·mL-1的一枝蒿提取液。將60只健康SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及一枝蒿提取物低、中和高劑量組(1、2、4 g·kg-1)和陽性對(duì)照組(TRPV1拮抗劑0.5 μmol·kg-1)。自由飲水飲食7 d后進(jìn)行造模。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均取上腹正中切口，用外徑為4 mm的玻璃棒從胃體部位穿刺入胃，通過幽門至十二指腸，避開腸部各處血管，縫扎玻璃棒外包裹的幽門及十二指腸部分，將玻璃棒穿過賁門處，在內(nèi)部擴(kuò)張賁門，使賁門括約肌加劇松弛，縫合胃部后于食管胃交界處縱行切開食管下括約肌，分離至黏膜暴露于視野中。假手術(shù)組腹部正中切口在胃部開孔后縫合，暴露腹腔臟器15 min后關(guān)腹，關(guān)腹前翻動(dòng)腹腔相關(guān)臟器數(shù)次，各組均給予頭孢呋辛鈉和葡萄糖0.05 g·mL-1術(shù)后支持[11-13]。

2.2大鼠肺順應(yīng)性檢測 末次給藥后，次日進(jìn)行肺功能激發(fā)實(shí)驗(yàn)。將大鼠麻醉后固定，行氣管插管：切開頸部皮膚，鈍性分離出氣管，暴露氣管后用縫合線穿過氣管，在氣管開倒T形進(jìn)口，插入氣管插管后行結(jié)扎固定。采用密閉的體積描記系統(tǒng)對(duì)各組大鼠的氣道反應(yīng)性進(jìn)行測定。將大鼠密封于體描箱內(nèi)，待基線穩(wěn)定后，使用不同濃度的Mch溶液進(jìn)行支氣管激發(fā)。每次激發(fā)結(jié)束，待基線恢復(fù)穩(wěn)定再進(jìn)行第二次激發(fā)并檢測。觀察并計(jì)算不同Mch濃度激發(fā)下其氣道阻力參數(shù)的變化情況。肺順應(yīng)性減少百分比=(激發(fā)前肺順應(yīng)性值-激發(fā)后肺順應(yīng)性值)÷激發(fā)前肺順應(yīng)性值×100%[14]。

2.3大鼠食管組織中TNF-α、IL-1β、IL-6及LPCAT2 mRNA表達(dá)量的分析 RNA提?。?1)組織樣本用液氮充分研磨，取樣本50 mg置于離心管中，加入Trizol 1 mL，混勻，室溫放置10 min至組織完全裂解。(2)加入氯仿200 μL，混勻，室溫放置5 min。(3)在4 ℃條件下，以12 000 r·min-1離心15 min。(4)吸取上清液，置于離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，-20 ℃放置30 min。(5)重復(fù)步驟(3)，倒掉上清液，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，使沉淀漂浮，洗滌。(6)重復(fù)步驟(3)，倒掉上清液。(7)重復(fù)步驟(6)。空管離心，吸盡液體，晾干。用RNase free Water溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。剩余RNA于-80 ℃保存或直接反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第一鏈cDNA合成配置體系由Total RNA定量至800 ng，加入Random Primer (0.1 μg·μL-1) 1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScript@RT/RI Enzyme Mix 1 μL和gDNA Remover 1 μL，最后加入RNase-free Water稀釋至 20 μL。混勻后25 ℃反應(yīng)10 min，42 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃反應(yīng)5 s，取出，結(jié)束反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA于-80 ℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。引物信息見表1。熒光定量PCR體系：2×SYBR Green Select Mix 5 μL、Forward Primer 0.7 μL、Reverse Primer 0.7 μL、ROX 0.05 μL、cDNA 1 μL、RNase-free Water至10 μL；熒光定量PCR程序：預(yù)變性95 ℃、2 min，1個(gè)循環(huán)；變性95 ℃、5 s，40個(gè)循環(huán)；退火/延伸60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)[10]。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

3 結(jié)果

3.1一枝蒿提取物對(duì)GERD大鼠肺順應(yīng)性減少百分比的影響 見表2。由表2可知，各組隨著Mch濃度的增加，肺順應(yīng)性減少百分比逐漸增加。與假手術(shù)組比較，當(dāng)Mch濃度為0.5 mmol·L-1時(shí)，各組順應(yīng)性減少百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)Mch濃度為1、2、4、8 mmol·L-1時(shí)，模型組肺順應(yīng)性減少百分比明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，一枝蒿提取物高、中、低劑量組以及陽性對(duì)照組肺順應(yīng)性減少百分比均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 一枝蒿對(duì)GERD大鼠肺順應(yīng)性減少百分比的影響Tab.2 Effect of Artemisia rupestris extract on the percentage of lung compliance reduction in GERD rats

3.2一枝蒿提取物對(duì)大鼠食管組織中各基因mRNA表達(dá)的影響 見圖1和表3。由圖1可知，PCR產(chǎn)物大小符合檢測基因的片段長度，產(chǎn)物條帶單一。由表3可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠食管組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和LPCAT2表達(dá)均顯著升高；與模型組相比，陽性對(duì)照組TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05)，一枝蒿提取物高劑量組TNF-α、IL-6和LPCAT2表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

表3 一枝蒿提取物對(duì)GERD大鼠食管組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和LPCAT2 mRNA表達(dá)的影響Tab.3 Effect of Artemisia rupestris extract on expression of TNF-α，IL-1β，IL-6 and LPCAT2 mRNA in esophageal tissue of GERD rats

圖1 PCR產(chǎn)物鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR product identification

4 討論

神經(jīng)生理學(xué)研究表明，絕大多數(shù)食管內(nèi)的迷走神經(jīng)感受器激活后可誘發(fā)C纖維動(dòng)作電位[15]。TRPV1在迷走神經(jīng)C纖維上表達(dá)，對(duì)辣椒素、酸、溫度或炎癥介質(zhì)非常敏感，也稱辣椒素敏感受體。TRPV1激活后，可開放離子通道，C纖維興奮后末梢釋放神經(jīng)肽，可直接刺激咳嗽感受器引發(fā)呼吸道癥狀，或通過介導(dǎo)NK1受體表達(dá)促使神經(jīng)生長因子(NGF)、TNF-α等炎癥介質(zhì)生成增多引起炎癥，從而影響氣道敏感性，間接引發(fā)呼吸道癥狀，造成肺順應(yīng)性降低。對(duì)GERC患者進(jìn)行食管內(nèi)酸灌注或辣椒素刺激，氣道對(duì)刺激的敏感性明顯增高[16-17]。一枝蒿提取物可明顯改善GERD大鼠肺順應(yīng)性降低的癥狀與改善搭配，緩解氣道敏感性引發(fā)呼吸道癥狀。另外，GERD患者體內(nèi)相關(guān)炎癥介質(zhì)發(fā)生變化，特別是促炎因子，現(xiàn)已證明其與GERD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。GERD食管黏膜中 IL-1β、IL-6、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、血小板活化因子(PAF)和活性氧自由基(ROS)等促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平增加。胃十二指腸內(nèi)容物包括酸、膽鹽、胰蛋白酶等侵蝕食管和氣管上皮，促炎介質(zhì)持續(xù)高表達(dá)便可引起食道、氣管病變，出現(xiàn)GERD相關(guān)癥狀及并發(fā)癥。白細(xì)胞介素-1(IL-1)為促炎細(xì)胞因子，構(gòu)成免疫系統(tǒng)重要組成部分，存在白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)2個(gè)亞型，IL-1是多種細(xì)胞激活劑，其表達(dá)水平的升高可增加腸道、皮膚和其他器官炎性疾病[18]。動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中，回流引起的食管黏膜炎癥中IL-1β有所增加。IL-6是來源于單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞發(fā)揮多種生物效應(yīng)的細(xì)胞因子，它與炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，組織損傷或感染可引起IL-6的釋放，后者誘導(dǎo)急性炎癥的蛋白質(zhì)合成。TNF-α可刺激并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS，與酸反流時(shí)食道黏膜發(fā)生過氧化反應(yīng)相關(guān)。研究顯示，在反流性食管炎演化為Barret′s食管過程中，TNF-α可能起到了一定作用[19]。TNF-α可激活核因子κB (NF-κB)，后者是炎癥和癌癥發(fā)生過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)信號(hào)分子。GERD患者的TNF-α表達(dá)和NF-κB顯著增加[20]。LPCAT2是一種有效的磷脂類促炎介質(zhì)和趨化因子，特別是對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞有明顯的趨化作用，能增強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可激活多種免疫細(xì)胞，促使自身分泌及其他炎癥介質(zhì)的釋放，包括ROS。在GERD發(fā)病機(jī)制的研究中，ROS發(fā)揮關(guān)鍵作用，研究認(rèn)為GERD是由于胃內(nèi)容物反流使黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)ROS并發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致黏膜損害[21]。在食管炎模型和慢性食管炎患者中，酸接觸后的食管黏膜產(chǎn)生并釋放的LPCAT2增加。前期研究表明，一枝蒿提取物具有改善胃腸動(dòng)力、調(diào)節(jié)胃酸分泌、促進(jìn)胃動(dòng)力的作用[10]。另外，一枝蒿具有明顯的抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)作用，對(duì)急、慢性炎癥及炎性滲出均有明顯的抑制作用，這與GERD“病在脾胃，胃失和降”引起的胃酸過多、消化不良，以及“濁氣上逆，痰濁”引起的氣道高反應(yīng)和呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥表現(xiàn)的炎癥、變態(tài)反應(yīng)癥狀相適應(yīng)[10]。綜上所述，一枝蒿提取物可改善大鼠GERD所致的氣道高反應(yīng)，降低GERD大鼠的炎癥因子表達(dá)，起到治療GERD的作用。