石韋質(zhì)量評價的研究進展

徐 碩，徐文峰，姜文清，金鵬飛

(北京醫(yī)院藥學(xué)部，國家老年醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，藥物臨床風(fēng)險與個體化應(yīng)用評價北京市重點實驗室，北京 100730)

石韋為水龍骨科植物廬山石韋Pyrrosiasheareri(Bak.) Ching、石韋Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell或有柄石韋Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching的干燥葉，具有利尿通淋、清肺止咳和涼血止血的功效，主治熱淋、血淋、石淋、小便不通、淋瀝澀痛、肺熱喘咳、吐血、衄血、尿血和崩漏[1]，收載于《中國藥典》2015年版一部。同屬不同種植物矩圓石韋P.martini(Christ) Ching在四川地區(qū)作石韋入藥；西南石韋P.gralla(Gies.) Ching在云南地區(qū)作石韋入藥；光石韋P.calvata(Bak.) Ching在廣西地區(qū)作石韋入藥[2]。石韋藥材中的化學(xué)成分主要包括黃酮類、三萜類、酚酸類、甾體和揮發(fā)油等，藥理研究表明，其具有抗菌、抗炎、降血糖、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和抗氧化等多種藥理作用[3-8]，《中國藥典》2015年版一部中以綠原酸作為石韋的指標(biāo)成分，規(guī)定其含量不得少于0.20%[1]。本文對近年來石韋質(zhì)量評價方面的研究結(jié)果進行綜述，以期為更好地開發(fā)和利用該藥材提供參考。

1 性狀和顯微鑒定

文瑞良等[9]對相異石韋的性狀特征以及葉柄基部和根莖橫切面、葉和根莖粉末的顯微特征進行觀察，研究結(jié)果可為其鑒別提供參考。穆二廷等[10]利用中藥微性狀鑒定法對石韋、廬山石韋和有柄石韋的干燥葉進行鑒別，結(jié)果顯示，3種石韋在干燥葉的星狀毛、斑點凹陷、體部細胞數(shù)和孢子囊群等方面具有明顯區(qū)別，可用于3種石韋的鑒別。

2 指紋圖譜研究

張莉莉等[2]利用粉末X射線衍射Fourier指紋圖譜鑒定法對3個石韋對照品和 17個石韋藥材樣品進行計算分析，得到石韋的標(biāo)準(zhǔn)X射線衍射Fourier指紋圖譜和特征標(biāo)記峰值，結(jié)果表明，通過標(biāo)準(zhǔn)X射線衍射Fourier指紋圖譜的幾何拓撲圖形與衍射特征標(biāo)記峰值，能夠?qū)崿F(xiàn)對石韋、有柄石韋、廬山石韋、矩圓石韋、西南石韋和光石韋等不同品種石韋藥材的鑒定。

張藝軒等[11]建立了石韋藥材的HPLC指紋圖譜。樣品加入甲醇超聲提取，采用 Diamonsil C18柱，流動相為乙腈-8 mL·L-1乙酸，梯度洗脫，檢測波長為260 nm，對收集自各地區(qū)的44批石韋樣品(包括15批石韋、15批有柄石韋、10批廬山石韋、3批光石韋、1批相似石韋)進行測定，建立了石韋與有柄石韋指紋圖譜共有模式以及廬山石韋的共有模式，經(jīng)與對照品比對，指認(rèn)了其中4個特征色譜峰，分別為綠原酸、芒果苷、異芒果苷和圣草酚7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷。通過相似度分析、聚類分析和主成分分析對其進行評價，結(jié)果表明，《中國藥典》收載的石韋與有柄石韋指紋圖譜相似，但與廬山石韋存在較大差異，相似石韋和光石韋與《中國藥典》收載品種具有明顯區(qū)別，該方法能為石韋藥材的選購與品種鑒別提供參考。

黃艷等[12]利用高效液相色譜(HPLC)法建立了光石韋藥材的指紋圖譜。樣品加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇回流提取，采用SinoChrom ODS-BP柱，流動相為乙腈-2 mL·L-1磷酸，梯度洗脫，檢測波長為205 nm。對產(chǎn)自廣西不同地區(qū)的10批藥材進行測定，結(jié)果顯示，指紋圖譜相似度為0.985～0.999，確定出12個共有峰，指認(rèn)其中1個共有峰為芒果苷，10批藥材12個共有指紋峰占總峰面積的90%以上，具有代表性。所建立的指紋圖譜精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好，可作為光石韋藥材質(zhì)量的控制標(biāo)準(zhǔn)。高貝等[13]分別制備了有柄石韋的水、甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇以及丙酮浸提物，通過HPLC法分析，結(jié)果顯示，有柄石韋不同浸提物中的成分及相對含量存在很大差異。

中藥的化學(xué)成分非常復(fù)雜，其紅外譜圖中的峰位、峰形和峰強表示體系中所含化學(xué)成分對應(yīng)的特征吸收峰的特點，混合物組成的改變使整體光譜圖會發(fā)生變化，由此構(gòu)成了紅外譜圖的宏觀指紋性[14]。李娜等[15]利用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)技術(shù)對石韋、廬山石韋和氈毛石韋不同浸提物中的化學(xué)成分進行分析，明確了其主要化學(xué)成分在不同浸出物中的分布。結(jié)果顯示，3種石韋的甲醇提取物中化學(xué)成分相似，廬山石韋和石韋在3 300 cm-1處存在強吸收峰，且比氈毛石韋在此處的溶解度高，3種石韋均在1 200 cm-1處有強吸收峰，吸收強度依次下降。石油醚提取物中的吸收峰基本一致，廬山石韋和石韋的溶解度基本相同，但顯著低于氈毛石韋。3種石韋的水提物均在3 400、3 350、1 666、1 050 cm-1處出現(xiàn)較強吸收峰。體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇提取物中，均在3 330、1 600、1 440、1 050 cm-1處有較強吸收峰，氈毛石韋具有最高的吸收強度。通過比對不同石韋不同浸提物的紅外光譜，對其主要化學(xué)成分差異進行了定性解析。

Cui L L等[16]通過建立石韋藥材的HPLC指紋圖譜并結(jié)合相似度評價、聚類分析和主成分分析，用于石韋屬藥材的鑒別和質(zhì)量評價，并建立了石韋中多成分含量測定的一測多評法(QAMS)。指紋圖譜共標(biāo)定了20個共有峰，對42份石韋屬藥材進行分析，結(jié)果顯示，樣品可以被分為3類，其中大部分成分相似的樣品主要集中在產(chǎn)地為山西、廣西和四川等省。QAMS法是以綠原酸為參照物，建立與芒果苷、蘆丁和山柰酚的相對校正因子，并計算其含量，同時采用外標(biāo)法測定4個成分的含量，結(jié)果表明QAMS法可行。

3 含量測定研究

3.1有效部位的含量測定 楊魯紅等[17]對光石韋葉中總黃酮的超聲波提取工藝進行優(yōu)化，以蘆丁為對照品，通過紫外可見分光光度法在510 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)，以各影響因素設(shè)計正交實驗，確定光石韋葉片中總黃酮超聲提取的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶40，超聲時間為40 min，萃取溫度為70 ℃，在此條件下總黃酮的平均提取率為16.16%。劉燕芳等[18]通過紫外可見分光光度法測定石韋藥材中總黃酮的含量，樣品加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇超聲提取，以蘆丁為對照品，在510 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)，結(jié)果顯示，不同種類、不同產(chǎn)地和不同部位的石韋中總黃酮含量差異較明顯。產(chǎn)地為安徽的石韋中總黃酮含量最高，其次為湖北的廬山石韋，有柄石韋中總黃酮含量相對較低，產(chǎn)地為四川成都的有柄石韋中總黃酮含量最低，小于10%。在同種石韋中，一般葉中總黃酮含量較高，葉柄和根莖中含量較低，但產(chǎn)地為湖北的廬山石韋以及產(chǎn)地為安徽的石韋根莖中總黃酮含量明顯高于其他藥用部位，表明石韋在藥用時應(yīng)考慮到不同藥材中有效成分的含量，以期達到最佳藥用效果。

多糖作為一類重要的生物活性成分，對其進行定量也很有必要[19]。李春磊等[20]采用紫外可見分光光度法對不同產(chǎn)地與不同部位有柄石韋的總多糖含量進行分析。樣品經(jīng)脫脂、堿水提取、除蛋白、沉淀等處理后得到總多糖，以葡萄糖為對照品，在490 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)。結(jié)果顯示，產(chǎn)地為山東膠東的有柄石韋葉中總多糖含量最高，為5.194%，其次是產(chǎn)地為山東濟南、云南昆明、山東蒙山的樣品，而市售石韋中總多糖含量最低。有柄石韋總多糖含量在葉中最高，其次是在全草中，在根莖中含量最低。高麗麗等[21]通過紫外可見分光光度法測定了不同品種石韋中的總多糖含量，結(jié)果顯示，廬山石韋中總多糖含量最高，為3.526%，有柄石韋和石韋中總多糖含量次之，中越石韋、華北石韋和紙質(zhì)石韋中總多糖含量差異不大，約為2%，西南石韋中總多糖含量最低，為1.382%。

3.2藥材中單體成分的含量測定

3.2.1HPLC法 馬辰等[22]通過HPLC法建立了石韋中綠原酸和圣草酚7-O-β-D-吡喃葡糖醛酸苷的含量測定方法。樣品加入丙酮-水(7∶3)加熱回流提取，采用Kromasil C18柱，以甲醇-水-磷酸(50∶200∶0.2)為流動相，檢測波長為284 nm。結(jié)果顯示，綠原酸和圣草酚7-O-β-D-吡喃葡糖醛酸苷的含量分別在0.01～5、0.004～5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為97.9%、99.1%。對不同品種、不同產(chǎn)地的21批石韋樣品進行測定，結(jié)果表明，含量差異較大，2批樣品未檢出圣草酚7-O-β-D-吡喃葡糖醛酸苷，其余樣品中該成分含量為0.26～27.43 mg·g-1，測定樣品中均含有綠原酸，含量為0.48～14.6 mg·g-1。

崔嵐等[23]建立了測定石韋中綠原酸含量的HPLC法。樣品加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇超聲提取，采用Hypersil BDS C18色譜柱，流動相為乙腈-0.5 mL·L-1磷酸溶液(11.5∶88.5)，檢測波長為327 nm，結(jié)果顯示，綠原酸質(zhì)量濃度在4.42～53.04 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為104.60%，測得4批藥材中綠原酸含量在0.111 2～0.142 1 mg·g-1范圍內(nèi)。

張亞寧等[24]通過HPLC法測定石韋中木犀草素的含量。樣品加入甲醇超聲提取，采用Shimadzu C18柱，以甲醇-2 mL·L-1磷酸(50∶50)為流動相，檢測波長為254 nm，結(jié)果顯示，木犀草素的線性范圍為0.032 5～0.390 0 μg，回收率為95.85%。

韋志疆[25]采用HPLC法建立了光石韋中芒果苷的含量測定方法。樣品加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇超聲提取，采用Agilent TC-C18柱，流動相為乙腈-1 mL·L-1磷酸(13∶87)，檢測波長為318 nm。結(jié)果顯示，芒果苷在0～2.136 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為104.24%，測得10批光石韋中芒果苷的含量在46.02～88.53 mg·g-1范圍內(nèi)。

李文琪等[26]建立了測定光石韋中芒果苷含量的HPLC法，樣品用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇提取，采用大連依力特C18柱，以乙腈-2 mL·L-1磷酸(13∶87)為流動相，檢測波長為318 nm，結(jié)果顯示，芒果苷在0.060 5～0.363 2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為101.3%，測得產(chǎn)自廣西不同地區(qū)的16批光石韋樣品中芒果苷的含量在2.58%～7.32%范圍內(nèi)。

黃海婷等[27]采用HPLC法測定石韋藥材中綠原酸的含量。樣品加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇超聲提取，采用C18柱，流動相為乙腈-0.5 mL·L-1磷酸(11.5∶88.5)，檢測波長為326 nm，結(jié)果綠原酸在0.036 8～0.809 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為100.08%，廣西不同產(chǎn)地石韋藥材中綠原酸的含量差異較大，以采自金秀縣羅香鄉(xiāng)的石韋藥材中綠原酸含量最高，為3.696 7 mg·g-1；其次是采自資源縣寶鼎瀑布景區(qū)和資源縣龍洞峽景區(qū)的石韋，綠原酸含量分別為3.467 8、3.167 6 mg·g-1；產(chǎn)地為靖西縣的柔軟石韋中綠原酸含量最低，為1.132 6 mg·g-1。

高貝等[13]建立了測定有柄石韋及華北石韋中綠原酸和木犀草素含量的方法，樣品加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇超聲提取，采用Shim-pack VP-ODS柱，流動相為乙腈-5 mL·L-1磷酸(9∶91)，檢測波長為326 nm，結(jié)果顯示，2種石韋中綠原酸的含量分別為1.51%、0.76%，木犀草素的含量分別為0.021%、0.047%。

龍毅等[28]建立了能同時測定石韋中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和亮氨酸含量的HPLC法。采用Welchrom C18柱，流動相A為0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液(以醋酸鈉調(diào)節(jié)pH值至6.5)-乙腈(93∶7)，流動相B為乙腈-水(4∶1)，梯度洗脫，檢測波長為254 nm。結(jié)果顯示，4種氨基酸的質(zhì)量濃度分別在4.92～49.2、3.168～31.68、2.6～26、2.88～28.8 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率在98.3%～100.1%范圍內(nèi)，測得石韋中4種氨基酸的含量分別為1.189、0.700、0.360、0.343 mg·g-1。

邵尉等[29]建立了能同時測定有柄石韋中原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷和蘆丁6個成分含量的HPLC法。藥材經(jīng)石油醚脫脂處理后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇超聲提取，采用SinoChrom ODS-BP C18柱，以乙腈-1 mL·L-1磷酸為流動相，梯度洗脫，檢測波長為320 nm。結(jié)果顯示，6個成分線性關(guān)系良好，平均加樣回收率在97.32%～102.16%范圍內(nèi)，測得3批不同產(chǎn)地藥材中6個成分的含量分別在0.862～1.916、3.364～9.055、0.847～2.929、0.183～0.688、0.192～0.769、0.467～1.593 μg·mg-1范圍內(nèi)。

徐紅等[30]通過HPLC技術(shù)建立了測定黔產(chǎn)廬山石韋中綠原酸和芒果苷含量的方法。樣品用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇超聲提取，采用Phenomenex C18柱，以乙腈-5 mL·L-1磷酸為流動相，梯度洗脫，檢測波長為320 nm，結(jié)果顯示，綠原酸和芒果苷分別在0.097 9～0.951 5、0.097 6～0.979 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.33%、98.89%。分布于凱里市的廬山石韋中綠原酸含量較高，而芒果苷含量較低，分布于遵義道真的廬山石韋中芒果苷含量較高，而綠原酸含量較低。

3.2.2超快速液相色譜(UFLC)法 任彪等[31]建立了能同時測定有柄石韋中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1-咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡酰奎寧酸、紫云英苷、圣草酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷和山柰酚-3,7-雙-O-葡萄糖苷10個成分含量的UFLC法。采用Kromasil 100-2.5 C18柱，以1 mL·L-1甲酸-1 mL·L-1甲酸甲醇溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為326 nm。結(jié)果顯示，10個成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率在99.1%～104.5%范圍內(nèi)。

3.3微量元素的含量測定 季曉輝[32]應(yīng)用火焰原子吸收光譜法測定了漢中石韋中鐵(Fe)、銅(Cu)、鋅(Zn)和錳(Mn)4種微量元素的含量。藥材樣品加入濃硝酸消解，結(jié)果顯示，4種元素在0～5 μg·mg-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率在93.5%～106.2%范圍內(nèi)，測得漢中石韋中4種元素的含量分別為12.91、32.12、22.45、72.84 μg·g-1。

4 藥材中的揮發(fā)性成分研究

康文藝等[33]通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)對石韋葉的揮發(fā)性成分進行分析，采用HP-5MS石英彈性毛細管柱，載氣為高純氦氣，進樣口溫度為250 ℃，程序升溫，不分流進樣，電離方式為電子轟擊電離源(EI)，電離能量為70 eV，離子源溫度為250 ℃。結(jié)果顯示，從石韋葉揮發(fā)性成分中鑒定了40個化合物，占葉揮發(fā)性成分總量的90.03%，其中正壬醛(11.82%)、1-辛烯-3-醇(4.88%)和甲酸辛酯(1.92%)是石韋葉中主要的香氣成分，可作為食用香料、香精來源。

康文藝等[34]利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)結(jié)合保留指數(shù)法，分析絨毛石韋和石韋根中的揮發(fā)性成分。從石韋根的揮發(fā)性成分中鑒定了33個化合物，占根揮發(fā)性成分總量的92.15%，1-己醇(21.28%)、己醛(11.71%)、鄰苯二甲酸二乙酯(7.61%)、正壬醛(5.99%)、甲氧基-苯基-肟(5.53%)、十六酸(5.32%)和(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸(3.07%)為石韋根中的主要揮發(fā)性成分。從絨毛石韋根揮發(fā)性成分中鑒定了36個化合物，占揮發(fā)性成分總量的95.01%，己醛(44.63%)、1-己醇(8.63%)以及二環(huán)[2.2.1]庚烷-3-亞甲基-2，2-二甲基-5-醇-乙酸酯(7.05%)是絨毛石韋根中的主要揮發(fā)性成分。

5 結(jié)語

石韋質(zhì)量評價的研究內(nèi)容主要包括性狀和顯微鑒定、指紋圖譜、含量測定以及藥材中的揮發(fā)性成分分析，均取得了一定進展，但也存在一些問題。在指紋圖譜研究方面，僅鑒定了少部分共有峰，需要加強通過利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)總結(jié)已有對照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律，在此基礎(chǔ)上對更多的同類化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。在含量測定研究方面，大部分是對其中的黃酮和酚酸類成分進行定量分析，而對于其他類型活性成分如三萜類化合物的含量測定研究極為有限。對于無機元素的定量分析，僅對藥材中Fe、Cu、Zn和Mn 4種元素進行測定，可以嘗試測定更多種無機元素的含量，并建立無機元素指紋圖譜，從而能夠更加全面地控制石韋藥材的質(zhì)量?！吨袊幍洹?015年版一部收載的石韋為水龍骨科植物廬山石韋、石韋或有柄石韋的干燥葉，作為多基源藥材，有必要通過指紋圖譜和定量分析對這3種石韋進行化學(xué)成分、有效成分含量的一致性研究，找出其異同點，從而更好地指導(dǎo)該藥材的臨床應(yīng)用。