基于真空冷凍干燥的響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取青楊梅中抗氧化物質(zhì)及活性分析

石峰，李思敏，高定烽，丁崗芯，崔恩浩，熊華斌，高云濤，楊志

(云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650500)

云南野生青楊梅(MyricaadenophoraHance)為楊梅屬植物，分布于廣東、廣西和云南等地，生命力強(qiáng)，生長于酸性土壤中，pH值在5.5～6最為適宜。青楊梅是一種富含葡萄糖、檸檬酸、蘋果酸、果糖等營養(yǎng)物質(zhì)的植物，具有很高的營養(yǎng)價值，還含有多種維生素和花色苷等抗氧化物質(zhì)[1]。隨著人民生活水平的日益提高，人們在營養(yǎng)膳食方面更加注重綠色和健康。米雪等[2]通過對柿子果皮中類胡蘿卜素的研究發(fā)現(xiàn)，超聲提取的類胡蘿卜素含量高、抗氧化作用效果好。戴喜末等[3]對野艾蒿多糖的提取發(fā)現(xiàn)，超聲提取的野艾蒿多糖提取率達(dá)6.44%，對DPPH·的清除能力強(qiáng)。但是，鮮見采用真空冷凍干燥輔助超聲提取云南野生青楊梅抗氧化物質(zhì)的報道。本實(shí)驗(yàn)以云南野生青楊梅為實(shí)驗(yàn)研究對象，通過真空冷凍干燥處理后，以單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果為基礎(chǔ)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳超聲提取工藝，并對青楊梅提取物對DPPH·的清除效果進(jìn)行抗氧化活性分析，為進(jìn)一步開發(fā)、利用野生植物資源青楊梅提供了技術(shù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本文用材云南野生青楊梅采于云南省曲靖市，且實(shí)驗(yàn)所研究的果實(shí)均采摘自同一株野生青楊梅樹。

色譜純乙醇、分析純乙醇、DPPH標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SJIA-2012超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 杰瑞安儀器設(shè)備有限公司；JM-L140膠體磨 上海貝工泵業(yè)制造有限公司；8453型紫外可見分光光度計(jì)、7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent Technologies Inc.；FA2004電子分析天平 上海上平儀器公司；水浴鍋 力辰科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 寧波雙嘉儀器有限公司；離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 真空冷凍干燥提取云南野生青楊梅中抗氧化物質(zhì)的工藝流程

青楊梅→去核→膠體磨研細(xì)→凍干12 h→青楊梅粉→水浴浸提2 h→超聲破碎→離心→提取液。

1.3.2 原料預(yù)處理

真空冷凍干燥技術(shù)是一種將樣品冷凍至凝固點(diǎn)以下，再通過程序設(shè)定溫度升溫，使樣品中的水分直接升華，再通過抽真空后使水分離開原有體系的干燥方法[4]。 樣品在真空烘干、烘干、熱風(fēng)干燥和凍干4種技術(shù)下進(jìn)行干燥，結(jié)果顯示在凍干技術(shù)中樣品的總酚、總黃酮和總花色苷等活性物質(zhì)的含量顯著高于其他3種干燥技術(shù)[5]。其中，凍干條件下樣品的維生素C含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于熱風(fēng)干燥的含量[6]，所以本實(shí)驗(yàn)采用真空冷凍干燥技術(shù)，在最佳的干燥技術(shù)下保證青楊梅中的抗氧化物質(zhì)成分以最大程度保存，工藝參數(shù)見表1。

表1 青楊梅的真空冷凍干燥工藝參數(shù)Table 1 The vacuum freeze-drying process parameters of Myrica adenophora Hance

1.3.3 云南野生青楊梅提取物最大吸收峰的測定

準(zhǔn)確稱取(0.2±0.01) g楊梅粉于200 mL燒杯中，以固液比1∶25 (g/mL)加入乙醇，置于50 ℃恒溫水浴2 h后，在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液備測。取1 mL上清液于比色管中加入乙醇定容至50 mL，在190～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，得上清液最大吸收波長，平行測定3組。

1.3.4 最佳固液比的確定及其提取液對DPPH·的清除效果

準(zhǔn)確稱取6份(0.2±0.01) g楊梅粉于6個200 mL燒杯中，分別加入5，10，15，20，25，30 mL乙醇，與1.3.3相同的水浴和離心條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取0.5 mL上清液于比色管中，再加入已配制的DPPH·(A=0.7±0.1)溶液10 mL，搖勻靜置30 s后，于517 nm處測定吸光度，并計(jì)算提取液對DPPH·的清除率，平行測定3組。

1.3.5 最佳提取溫度的確定及其提取液對DPPH·的清除效果

準(zhǔn)確稱取6份(0.2±0.01) g 楊梅粉于6個200 mL燒杯中，以固液比1∶25 (g/mL)加入乙醇，分別于40，45，50，55，60 ℃恒溫水浴2 h，與1.3.3相同的離心條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與1.3.4相同的測定條件測定待測液的吸光度，平行測定3組。

1.3.6 最佳乙醇濃度的確定及其提取液對DPPH·的清除效果

分別配制體積分?jǐn)?shù)為0%、20%、40%、60%、80%和95%的乙醇溶液，準(zhǔn)確稱取6份(0.2±0.01) g 楊梅粉于6個燒杯中，分別加入已配制好的乙醇溶液，與1.3.3相同的水浴和離心條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與1.3.4相同的測定條件測定待測液的吸光度，平行測定3組。

1.3.7 最佳超聲功率的確定及其提取液對DPPH·的清除效果

準(zhǔn)確稱取6份(0.2±0.01) g 楊梅粉于6個200 mL燒杯中，以固液比1∶25 (g/mL)加入乙醇，然后于50 ℃恒溫水浴2 h，設(shè)定超聲時間為30 min，再分別以150，300，450，600，750，900 W的功率超聲提取，與1.3.3相同的離心條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與1.3.4相同的測定條件測定待測液的吸光度，平行測定3組。

1.3.8 最佳超聲時間的確定及其提取液對DPPH·的清除效果

準(zhǔn)確稱取6份(0.2±0.01) g楊梅粉于6個200 mL燒杯中，以固液比1∶25 (g/mL)加入乙醇，然后于50 ℃恒溫水浴2 h，設(shè)定超聲功率為600 W，再分別以10，20，30，40，50，60 min的時間超聲提取，與1.3.3相同的離心條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與1.3.4相同的測定條件測定待測液的吸光度，平行測定3組。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南野生青楊梅提取物的最大吸收波長

由圖1的UV-Vis吸收光譜掃描結(jié)果可知，云南野生青楊梅提取物溶液的光譜掃描在190～800 nm之間沒有吸收峰，DPPH·表現(xiàn)出在328 nm與517 nm波長處有兩個特征吸收峰，而云南野生青楊梅提取物溶液在205 nm波長處出現(xiàn)最大吸收峰。所以，本實(shí)驗(yàn)選定205 nm為云南野生青楊梅提取物的最大吸收波長。

圖1 野生青楊梅提取物的最大吸收峰Fig.1 The maximum absorption peak of wild Myrica adenophora Hance extracts

2.2 不同固液比對DPPH·的清除效果

由圖2可知，在固液比為1∶25～1∶125 (g/mL)時，固液比的減小對DPPH·的清除率表現(xiàn)出下降的趨勢，在固液比為1∶25 (g/mL)時對DPPH·的清除率最大，當(dāng)固液比成倍數(shù)減小時，清除率隨固液比的減小而減小，這是由于隨著固液比的逐漸減小，楊梅提取液中抗氧化成分也逐漸被稀釋，所以對DPPH·的清除率下降；還可能是固液比的增大導(dǎo)致楊梅中其他物質(zhì)溶出，使得抗氧化物質(zhì)溶出較少[7]。由于青楊梅為粉末狀，且為疏松多孔狀，當(dāng)固液比小于1∶25 (g/mL)時，難以使樣品與提取劑充分混合，所以本實(shí)驗(yàn)的最佳固液比為1∶25 (g/mL)。

圖2 不同固液比對DPPH·的清除率Fig.2 The scavenging rates of different solid-liquid ratios on DPPH free radicals

2.3 不同提取溫度對DPPH·的清除效果

由圖3可知，當(dāng)溫度在40～50 ℃區(qū)間時，提取液對DPPH·的清除率隨著溫度的升高而逐漸升高；但50 ℃之后，溫度在50～60 ℃區(qū)間時，提取液對DPPH·的清除率隨著溫度的升高而逐漸減小。如對茶多糖提取及其抗氧化活性的研究表明，由于在升溫條件下，茶多糖結(jié)構(gòu)受到破壞，影響了多糖的提取率[8]。在高溫下抗氧化物質(zhì)容易被破壞和分解，所以本實(shí)驗(yàn)的最佳提取溫度為50 ℃。

圖3 不同提取溫度對DPPH·的清除率Fig.3 The scavenging rates of different extraction temperatures on DPPH free radicals

2.4 不同乙醇濃度對DPPH·的清除效果

由圖4可知，乙醇濃度(體積濃度)在0%～60%區(qū)間時，提取液對DPPH·的清除率隨著乙醇濃度的增大而逐漸升高，但乙醇濃度在60%～95%區(qū)間時，提取液對DPPH·的清除率隨乙醇濃度的升高而逐漸降低，這是由于青楊梅中抗氧化物質(zhì)既有水溶性也有醇溶性，當(dāng)達(dá)到最佳乙醇濃度時，提取的抗氧化物質(zhì)也最多，隨著乙醇占比在最佳濃度的基礎(chǔ)上升高或降低，提取液對DPPH·的清除率都會降低，所以本實(shí)驗(yàn)采取體積濃度為60%的乙醇溶液。

圖4 不同乙醇濃度對DPPH·的清除率Fig.4 The scavenging rates of different ethanol concentration on DPPH free radicals

2.5 不同超聲功率對DPPH·的清除效果

由圖5可知，在超聲功率區(qū)間為150～600 W時，提取液對DPPH·的清除率隨著超聲功率的升高而升高，直至功率達(dá)到600 W時，提取液對DPPH·的清除率達(dá)到最大值，隨后隨著功率的升高提取液對DPPH·的清除率大幅下降。這是由于超聲功率過大，超聲探頭溫度過高，引起抗氧化物質(zhì)降解[9]。當(dāng)超聲功率為600 W時，青楊梅細(xì)胞壁已完全破裂，楊梅中的抗氧化物質(zhì)已基本溶出，再增加超聲功率，無法再增加抗氧化物質(zhì)的含量，反而破壞已溶出的抗氧化物質(zhì)[10]。所以，本實(shí)驗(yàn)選用最佳超聲功率為600 W。

圖5 不同超聲功率對DPPH·的清除率Fig.5 The scavenging rates of different ultrasonic power on DPPH free radicals

2.6 不同超聲時間對DPPH·的清除效果

由圖6可知，在超聲時間為10～30 min時，提取液對DPPH·的清除率隨著超聲時間的延長而增大，直至超聲時間為30 min時，提取液對DPPH·的清除率達(dá)到最大值。隨后隨著超聲時間的延長，提取液對DPPH·的清除率逐漸下降，這是由于超聲時間過長破壞了抗氧化物質(zhì)。還存在超聲空化作用的增強(qiáng)，導(dǎo)致在提取液中的抗氧化物質(zhì)被超聲降解，所以本實(shí)驗(yàn)選用最佳超聲時間為30 min。

圖6 不同超聲時間對DPPH·的清除率Fig.6 The scavenging rates of different ultrasound time on DPPH free radicals

2.7 CCD設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)分析可知，提取溫度、超聲功率和超聲時間對DPPH·清除的影響較為顯著，所以本實(shí)驗(yàn)以提取溫度、超聲功率和超聲時間3個因素作為響應(yīng)因素A，B，C，以青楊梅提取物對DPPH·的清除率作為響應(yīng)值R，設(shè)置3個水平，見表2，從中選出最優(yōu)工藝[11]。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素和水平值Table 2 The factors and levels of response surface test

表3 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 CCD experimental design and results

2.8 回歸和方差分析

以青楊梅提取物對DPPH·的清除率為響應(yīng)值，并由表3可得出清除率和各響應(yīng)因素間的回歸方程:

R清除率=+51.97-0.21A-0.19B+0.19C+0.35AB+7.500E-003AC-0.23BC-0.83A2-0.54B2-0.66C2。

該方程相關(guān)系數(shù) R2=0.9689，相關(guān)性良好。該方程的方差分析結(jié)果見表4。

表4 云南野生青楊梅提取物對DPPH·清除率的影響回歸方差分析結(jié)果Table 4 The regression variance analysis results of effects of Yunnan wild Myrica adenophora Hance extracts on the scavenging rates of DPPH free radicals

續(xù) 表

通過分析軟件Expert 8.1.6建立模型，當(dāng)P<0.001時，表明具有極顯著性，P>0.1表明無顯著性，該模型的整體P值為0.0002，<0.001，具有極顯著性，可得出該實(shí)驗(yàn)所建立的模型可用于青楊梅抗氧化成分提取的響應(yīng)面分析。此外，A、B、C、AB、BC、A2、B2和C2項(xiàng)的P值都小于0.05，表現(xiàn)出顯著性，表明超聲功率、超聲時間和提取溫度均為青楊梅抗氧化成分提取物對DPPH·清除率影響的主要因素，其中，A2、B2和C2項(xiàng)的P<0.001，說明超聲功率、超聲時間和提取溫度對DPPH·清除率的影響表現(xiàn)出極為顯著；AB項(xiàng)的P<0.01，表明超聲功率與超聲時間的交互作用要強(qiáng)于超聲功率與提取溫度、超聲時間與提取溫度的交互作用；A、B、C、BC的P<0.05，表明超聲功率、超聲時間和提取溫度對DPPH·清除率的影響顯著，而AC的P值明顯大于0.05，說明超聲功率和提取溫度對DPPH·清除率的影響沒有交互作用。

2.9 響應(yīng)面分析

A(超聲功率)、B(超聲時間)和C(提取溫度)3個因素對DPPH·清除的3D響應(yīng)面圖(a1、b1、c1)和等高線圖(a2、b2、c2)見圖7。

圖7 各因素及其交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 The response surface diagrams of various factors and their interactions

由圖7中a1和a2可以看出A因素和B因素對DPPH·清除率的影響趨勢近似，沿B方向響應(yīng)面的曲線較陡、切峰值較高，沿A方向響應(yīng)面的曲線較平緩、切峰值較低，說明超聲時間對DPPH·清除率的影響大于超聲功率對DPPH·清除率的影響。由圖7中a2也可以看出沿B方向的等高線密度要高于沿A方向的等高線密度，由此可得出超聲時間對DPPH·清除率的影響大于超聲功率的影響。

由圖7中b1可以看出A因素和C因素對DPPH·清除率的影響，沿C方向響應(yīng)面的曲線較陡、切峰值較高，沿A方向響應(yīng)面的曲線較平緩、切峰值較低，說明提取溫度對DPPH·清除率的影響大于超聲功率。由圖7中a2也可以看出沿C方向的等高線密度要高于沿A方向的等高線密度，由此可得出提取溫度對DPPH·清除率的影響大于超聲功率的影響。

由圖7中c1可以看出B因素和C因素對DPPH·清除率的影響，沿C方向響應(yīng)面的曲線較陡、切峰值較高，沿B方向響應(yīng)面的曲線較平緩、切峰值較低，說明提取溫度對DPPH·清除率的影響大于超聲時間。由圖7中c2也可以看出沿C方向的等高線密度要高于沿B方向的等高線密度，由此可得出提取溫度對DPPH·清除率的影響大于超聲時間的影響。通過響應(yīng)面分析，可直觀反映出各因素對DPPH·清除率的影響情況，其分析效果比單因素實(shí)驗(yàn)更具有說服力，通過響應(yīng)面綜合分析可以得出，3個因素對DPPH·清除率的影響程度不同，其程度大小為提取溫度>超聲時間>超聲功率。

此外，通過模型分析優(yōu)化，預(yù)測的最優(yōu)條件是超聲功率573.29 W、超聲時間27.63 min、提取溫度50 ℃，預(yù)測的最優(yōu)清除率為52.02%。通過實(shí)驗(yàn)測得的清除率為52.14%，與預(yù)測值相差僅0.12%，說明該方案是可行的[12]。通過超聲技術(shù)和對單因素參數(shù)的優(yōu)化，云南野生青楊梅提取物對DPPH·的清除率得到了有效的優(yōu)化，這與核桃青皮萘醌類[13]和辣椒油樹脂[14]研究的結(jié)果相一致。

2.10 云南野生青楊梅的GC-MS分析

本實(shí)驗(yàn)對楊梅提取液及其與DPPH·的混合液進(jìn)行氣質(zhì)分析，結(jié)果見表5和表6。

表5 云南野生青楊梅溶液成分分析Table 5 The analysis of components in Yunnan wild Myrica adenophora Hance solution

表6 加入云南野生青楊梅后的DPPH·成分分析Table 6 The analysis of components in DPPH free radicals after adding Yunnan wild Myrica adenophora Hance

由圖8和表5可知，云南野生青楊梅提取物中可分離出10種物質(zhì)；由圖9和表6可知，提取液與DPPH·的混合溶液中能分離出7種物質(zhì)。經(jīng)對照分析可看出，青楊梅提取液與DPPH·的混合溶液中相對青楊梅提取液有5種物質(zhì)的峰消失，分別為2-蒎烯、2-環(huán)己烯-1-酮、4H-Pyran-4-one,2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-、5-羥甲基糠醛和β-D-阿洛糖，這5種物質(zhì)對DPPH·均具有清除作用；同時也伴隨著新物質(zhì)N-乙酰-DL-丙氨酸和4-芐基吡啶兩種物質(zhì)峰的產(chǎn)生。

圖8 青楊梅氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of Myrica adenophora Hance

圖9 加入青楊梅后的DPPH·氣相色譜圖Fig.9 DPPH free radical gas chromatogram of Myrica adenophora Hance

3 結(jié)論

云南野生青楊梅抗氧化物質(zhì)提取的最優(yōu)條件是固液比為1∶25 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲功率為573.29 W，超聲時間為27.63 min，提取溫度為50 ℃。

響應(yīng)面優(yōu)化的最優(yōu)DPPH·清除率為52.02%，通過實(shí)驗(yàn)測得的清除率為52.14%，與預(yù)測值相差僅0.12%，證明真空冷凍干燥下的響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取云南野生青楊梅中抗氧化物質(zhì)工藝是可行的。

云南野生青楊梅中含有較高的抗氧化活性成分，可為進(jìn)一步開發(fā)、利用野生植物資源青楊梅提供技術(shù)和理論參考。