柱后衍生陽離子交換色譜法測定醬油中38種游離氨基酸含量

李巧琪，許志彬，黃偉乾，李秀英

(廣州檢驗檢測認證集團有限公司 國家加工食品質量檢驗中心(廣東)，廣州 511447)

醬油是中國傳統家庭最常見的調味品之一，有獨特的醬香味，含有甜、苦、咸、酸、鮮5種滋味，醬油的甜、苦、鮮味主要來源于醬油中的游離氨基酸[1]，其與共存于醬油中的多肽構成了醬油獨特的風味[2-3]，它們含量的高低也成為判定醬油等級的重要指標[4]。目前，國標中對醬油多肽含量的檢測一般是通過檢測醬油中酸溶蛋白的含量及游離氨基酸的含量計算得出[5-6]，其中考察游離氨基酸的含量為關鍵步驟，但目前只對16種游離氨基酸進行了檢測，為了更全面地考察更多種類型的游離氨基酸對醬油中多肽含量的檢測以及對醬油風味的影響，建立一種同時測定醬油中38種游離氨基酸含量的檢測方法是十分必要的。

高效液相色譜-質譜法[7-8]檢測游離氨基酸無需衍生，前處理簡單，具有高選擇性和高精度，但儀器成本昂貴。液相色譜法[9-11]得到最廣泛運用，但其前處理復雜，部分衍生產物穩(wěn)定性較差。氣相色譜法[12]、氣質聯用法[13]衍生條件苛刻，不同氨基酸衍生反應速度不同或衍生試劑不同。離子色譜法[14]細菌干擾性強，基質影響大。其他方法如毛細管電泳法[15]、電位法[16]重現性較差。本文建立了一種可以快速除雜，并有效分離38種游離氨基酸的柱后衍生陽離子交換色譜法，該方法穩(wěn)定，可用于日常醬油游離氨基酸的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油：市售。

鹽酸、無水檸檬酸、一水氫氧化鋰、無水乙醇、氯化鋰、硼酸、三氯乙酸、磺基水楊酸、苦味酸、苯酚(均為分析純)：廣州試劑廠；鉀鈉緩沖液、茚三酮(均為分析純)、40種氨基酸混標(濃度為2.5 μmol/mL)：德國賽卡姆公司；甲醇(色譜純)：弗舍爾公司；高純氮氣：大連大特氣體有限公司。

1.2 儀器與設備

S433D型氨基酸分析儀 德國賽卡姆公司；D3024R型高速冷凍臺式離心機 賽洛捷克公司；MS3渦旋混勻器 德國艾卡公司；ME204E型電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取約2 g醬油于50 mL離心管中，加入30 mL無水乙醇，渦旋振蕩2 min后，定容至50 mL后置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min, 于4 ℃下以12000 r/min離心20 min。取1 mL上清液用0.02 mol/mL鹽酸定容至10 mL，搖勻后過膜上機。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 標準溶液的配制

臨上機前，取標準液分別稀釋至10，50，100，200，250 nmol/mL。

1.3.2.2 鋰緩沖系統溶液的配制

緩沖液A：稱一水氫氧化鋰5.04 g、無水檸檬酸15.0 g于1 L燒杯中，加入50 mL無水乙醇、7.8 mL鹽酸，加入適量水溶解后定容至1 L，將溶解pH調至2.9，過膜后使用。

緩沖液B：稱氯化鋰4.2 g、一水氫氧化鋰8.4 g、無水檸檬酸15.0 g于1 L燒杯中，加入8.6 mL鹽酸，加入適量水溶解后定容至1 L，將溶解pH調至4.2，過膜后使用。

緩沖液C：稱硼酸10.0 g、氯化鋰4.2 g、無水檸檬酸10.0 g、一水氫氧化鋰8.4 g于1 L燒杯中，加入3.3 mL鹽酸，加入適量水溶解后定容至1 L，將溶解pH調至8.0，過膜后使用。

再生液D：稱19.5 g一水氫氧化鋰于1 L燒杯中，加入適量水溶解后定容至1 L。

1.3.2.3 衍生液的配制

稱取茚三酮20 g、苯酚2 g于燒杯中，加入鉀鈉緩沖液400 mL、甲醇600 mL，溶解后過膜置于棕色瓶內保存。

1.4 色譜條件

色譜柱為LCA K07/Li柱；衍生系統流速為0.25 mL/min，緩沖系統流速為0.45 mL/min；檢測波長為440 nm(脯氨酸、羥脯氨酸)、570 nm(其余氨基酸)；進樣量為50 μL。

1.4.1 梯度洗脫條件

梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 The gradient elution conditions

1.4.2 梯度柱溫程序

梯度柱溫程序見表2。

表2 梯度柱溫程序Table 2 The gradient column temperature program

2 結果與分析

2.1 緩沖溶液體系的確定

氨基酸與離子交換樹脂中磺化苯乙烯-二乙烯基苯聚合物的磺酸基結合而保留在色譜柱中，隨著緩沖系統pH值和離子強度的逐步升高，依次達到不同氨基酸的等電點，磺酸基被堿金屬陽離子所頂替，隨流動相依次流出得到分離。實驗分別用了鉀、鈉、鋰系統對38種不同氨基酸進行洗脫分離，發(fā)現鉀離子的洗脫能力遠遠大于鈉離子和鋰離子，38種氨基酸幾乎被一次洗脫出來，不適用氨基酸的分離檢測。而鈉離子的洗脫能力稍強于鋰離子，大部分氨基酸能夠得到有效分離，但部分氨基酸仍無法有效地分離，如谷氨酸和谷氨酰胺、甲基組氨酸的同分異構體等出現重疊出峰的現象，因此，本實驗采用了鋰離子系統緩沖體系對38種游離氨基酸進行分離，利用各緩沖溶液不同的pH值和離子強度的差異逐步提高緩沖系統的洗脫能力，從而使38種氨基酸均能得到有效分離，洗脫程序見表1，洗脫效果色譜圖見圖1。

圖1 38種氨基酸標準色譜圖Fig.1 The standard chromatogram of 38 kinds of amino acids

2.2 沉淀溶劑的選擇

醬油存在一定量的蛋白質和短肽，對氨基酸的分離造成一定的干擾，需要進行除雜?；腔畻钏?、三氯乙酸、苦味酸、乙醇常作為沉淀劑用于沉淀樣品中蛋白質、短肽，本文采用加標濃度比50 nmol/mL的醬油考察了不同沉淀劑(3%磺基水楊酸、3%三氯乙酸、3%苦味酸、無水乙醇)樣品雜質的除雜效果，分別平行測定6次，結果見圖2。

圖2 不同沉淀劑對氨基酸回收率的影響Fig.2 The effect of different precipitants on the recovery rates of amino acids

由圖2可知，無水乙醇的凈化效果最好，而使用其他3種試劑作為沉淀劑，會出現試劑雜質峰，影響基線，特別是使用磺基水楊酸和苦味酸時凈化效果較差且回收率較低。當采用無水乙醇作為沉淀劑時，實際樣品的凈化效果見圖3。

圖3 實際分析樣品色譜圖Fig.3 The chromatogram of actual analysis samples

由圖3可知，樣品基線較平整，雜質峰少，目標峰分離效果良好，表明無水乙醇的凈化效果好。

2.3 線性范圍和檢出限

38種氨基酸的線性范圍、相關系數和檢出限見表3。結果顯示，38種氨基酸在10～250 nmol/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數大于0.9990。

由于醬油均為氨基酸陽性樣品，方法檢出限無法采用陰性樣品進行試驗，本研究采用目標峰附近30個數據點2倍基線噪聲值峰高乘以樣品含量，再除以峰高計算方法檢出限，結果見表3。38種氨基酸方法檢出限介于1.5～19.0 mg/kg，相比醬油中游離氨基酸含量，方法檢出限遠遠小于含量，表明方法的靈敏度滿足檢測要求。

表3 38種氨基酸線性范圍、相關系數、檢出限Table 3 The linear ranges, correlation coefficients and detection limits of 38 kinds of amino acids

2.4 回收試驗

采用3個濃度比水平進行樣品加標，使最終上機樣品液加標濃度比為50，100，200 nmol/mL，按本研究建立的方法平行測定6次，結果見表4。

表4 回收試驗結果Table 4 The results of recovery experiments

續(xù) 表

由表4可知，在50，100，200 nmol/mL加標水平下，方法的平均回收率介于89.6%～100.8%，相對標準偏差介于1.7%～7.2%，方法的穩(wěn)定性和精密度滿足分析檢測要求[17]，表明該方法適用于醬油中38種游離氨基酸的測定。

3 結論

建立了一種同時測定醬油中38種游離氨基酸的柱后衍生陽離子交換色譜法。樣品采用了乙醇和冷凍沉淀物進行雙重凈化，離心后取上清液經陽離子交換色譜柱分離，與茚三酮衍生反應，于440，570 nm處檢測。實際樣品分析表明，本法凈化效果良好、前處理簡單、靈敏度高，適用于醬油中38種游離氨基酸的定性定量分析。