夾脊電針調(diào)控P2X7R/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)因子改善脊髓損傷大鼠微環(huán)境炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制研究*

劉玲玲，梅繼林，李 諾，李曉寧

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)患者通常長(zhǎng)期殘疾，喪失工作和日常生活能力，需要長(zhǎng)期甚至終生的醫(yī)療護(hù)理[1-2]。脊髓損傷后脊髓組織微環(huán)境平衡被破壞，導(dǎo)致占主導(dǎo)地位的神經(jīng)免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，在脊髓局部微環(huán)境中進(jìn)一步發(fā)生炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等病理機(jī)制，加重神經(jīng)元繼發(fā)性損傷，在病理機(jī)制中炎癥反應(yīng)又扮演著重要角色，因此學(xué)者將如何在脊髓損傷發(fā)生后及時(shí)控制炎癥反應(yīng)作為研究治療脊髓損傷的重中之重[3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)夾脊電針能通過(guò)抑制脊髓損傷大鼠NLRP3炎癥小體的活化，達(dá)到減輕脊髓損傷后炎性損傷作用[4]，然而調(diào)控NLRP3炎癥小體的上游因子還不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)SCI大鼠夾脊電針治療后微環(huán)境中 P2X7R/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)變化，探討該信號(hào)通路對(duì)炎癥反應(yīng)可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

Sprague-Dawley(SD)大鼠120只，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供。隨機(jī)分為5組，假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、夾脊電針組(EA)、P2X7干擾組(P2X7R siRNA)和干擾對(duì)照組(Control siRNA)；每組又劃分成1 d、3 d、7 d和21 d共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵照國(guó)際方面相關(guān)的動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑 過(guò)氧化氫(國(guó)藥，中國(guó))；蘇木精、 DAB 顯色液、山羊血清和抗熒光衰減封片劑(Solarbio，中國(guó))；cleaved caspase-1(Wanleibio，中國(guó))；OX42(abcam，美國(guó))；P2RX7(alomone，以色列)；IL-1β(Bioss，中國(guó))；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(中國(guó)Beyotime)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(thermofisher，美國(guó))；P2X7慢病毒、陰性對(duì)照慢病毒(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司)。

1.2.2 儀器 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備，上海)；石蠟切片機(jī)(Leica，德國(guó))；超純水系統(tǒng)(Heal Force，香港)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH36001B，天津泰斯特公司)；顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡(OLUMPUS，日本)；電針儀(KWD-808II，中國(guó)英迪)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備及評(píng)價(jià)

改良打擊法Allen’s制作脊髓損傷使用的動(dòng)物模型，給予10%比例水合氯醛腹部麻醉，待大鼠麻醉后，將其固定于手術(shù)臺(tái)上，以T10為中心進(jìn)行脫毛、備皮和消毒，之后以T10棘突為中心點(diǎn)切開(kāi)大約3 cm大小的手術(shù)切口，將T9～11棘突暴露。觀察到大鼠尾巴擺動(dòng)，身體呈現(xiàn)痙攣性抽搐，提示造模成功，之后將傷口縫合。最后給予生理鹽水注射，肌注青霉素。等待大鼠蘇醒后，BBB評(píng)分在1～3分范圍內(nèi)以及觸診到膀胱脹大者，確認(rèn)造模成功[5]。BBB評(píng)分對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能情況進(jìn)行評(píng)定，評(píng)分1～3分者納入實(shí)驗(yàn)。

2.2 干預(yù)方法

2.2.1 Sham 除去對(duì)應(yīng)椎板，只是暴露不進(jìn)行脊髓打擊，捆綁，常規(guī)喂養(yǎng)，無(wú)其他干預(yù)。

2.2.2 Model 造模成功后，除正常捆綁外，不給予其他處理。

2.2.3 EA 造模成功后[6]3 h夾脊電針干預(yù)：刺入T9、T11節(jié)段對(duì)應(yīng)的夾脊穴4～5 mm，之后把電針儀正極和負(fù)極分別夾在同側(cè)對(duì)應(yīng)的針灸針的兩針柄上，計(jì)時(shí)30 min，調(diào)節(jié)電流大小為1～2 mA，頻率為100 Hz，每日1 次，30 min/次。

2.2.4 P2X7R siRNA 造模成功的大鼠，注射滴度為107 TU/mL P2X7R干擾慢病毒，抽取8 μL的病毒懸液，選取損傷部位頭側(cè)和尾側(cè)分別進(jìn)行注射，各注射點(diǎn)注射2 μL懸液。

2.2.5 Control siRNA 同上述方法，給予陰性的對(duì)照慢病毒。造模成功后采取單籠獨(dú)立飼養(yǎng)，正常捆綁，無(wú)其他干預(yù)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 BBB評(píng)分評(píng)估大鼠后側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)功能 于模型建立后第1天、3天、7天和21天進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估，評(píng)分0～21分[7-8]，評(píng)分越低提示后肢運(yùn)動(dòng)功能損傷越嚴(yán)重。

2.3.2 免疫組化法 檢測(cè)大鼠脊髓組織中Cleaved caspase-1、IL-1β和P2X7R的表達(dá)情況 脊髓組織固定后修復(fù)、脫水和二甲苯固定，包埋后將其切成5 μm厚度的薄片，置于60 ℃溫箱中2 h，之后進(jìn)行烘干、脫蠟和IHC檢測(cè)。

2.3.3 免疫熒光雙標(biāo)法觀察P2X7R與OX42共定位情況 脊髓組織切片脫蠟至水：每一張石蠟切片放置在切片架上，60 ℃烘箱烤片，之后分別浸于Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)二甲苯中，依次浸入95%、85%和75%乙醇中；抗原修復(fù)：放置在煮沸抗原修復(fù)液中，進(jìn)行低火修復(fù)；血清封閉：加入山羊血清直至完全覆蓋全部組織；一抗孵育：加入一抗共同孵育；二抗孵育：加入熒光二抗直至完全覆蓋全部組織；DAPI復(fù)染：加入DAPI進(jìn)行復(fù)染核；抗熒光衰減封片：加入抗熒光衰減封片劑之后，進(jìn)行封片；最后顯微鏡鏡檢[9]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組比較大鼠BBB評(píng)分比較

與Sham組，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)Model組大鼠BBB評(píng)分明顯降低(P<0.05)。與P2X7R siRNA組相比較，3 d、7 d和21 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)Control siRNA組大鼠評(píng)分明顯降低(P<0.05)。與Model組相比較，3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)EA組與P2X7R siRNA組評(píng)分都升高(P<0.05)。隨著時(shí)間的推移，EA組與P2X7R siRNA組評(píng)分為上升趨勢(shì)，說(shuō)明EA組與P2X7R siRNA組均對(duì)大鼠脊髓損傷后后側(cè)肢體功能有改善作用，并且21 d時(shí)效果更顯著。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠BBB評(píng)分比較

表2 各組大鼠脊髓組織Cleaved caspase-1的平均光密度值

3.2 各組大鼠脊髓組織相關(guān)因子表達(dá)變化情況

3.2.1 各組大鼠脊髓組織中Cleaved caspase-1表達(dá)變化比較 與Sham組比較，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)Model組表達(dá)含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明模型制備成功。與P2X7R siRNA組比較，1 d、3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)Control siRNA組表達(dá)含量仍較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明構(gòu)建干擾慢病毒載體成功。夾脊電針治療后，3 d、7 d和21 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)EA組表達(dá)均低于Model組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；質(zhì)粒病毒裝載小片段RNA注射脊髓組織后，3 d、7 d和21 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)P2X7R siRNA組表達(dá)均低于Model組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。結(jié)果提示脊髓損傷后微環(huán)境中Cleaved caspase-1表達(dá)明顯升高，質(zhì)粒病毒siRNA干擾P2X7R能抑制Cleaved caspase-1表達(dá)，夾脊電針也可抑制Cleaved caspase-1蛋白表達(dá)，進(jìn)而可能干擾其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，治療脊髓炎性損傷，隨著時(shí)間的進(jìn)展治療優(yōu)勢(shì)更明顯。

圖1 各組大鼠脊髓組織Cleaved caspase-1表達(dá)的比較(400×)

圖2 各組大鼠脊髓組織IL-1β表達(dá)的比較(400×)

3.2.2 各組大鼠脊髓組織IL-1β表達(dá)比較 與Sham組比較，各時(shí)間點(diǎn)Model組表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明模型制備成功。與P2X7R siRNA組比較，3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)Control siRNA組表達(dá)水平仍較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明構(gòu)建干擾慢病毒載體成功。經(jīng)夾脊電針治療后，3 d、7 d和21 d共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)EA組表達(dá)均低于Model組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；質(zhì)粒病毒裝載小片段RNA注射脊髓組織后，3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)P2X7R siRNA組表達(dá)均低于Model組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。結(jié)果提示脊髓損傷后微環(huán)境中IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高，質(zhì)粒病毒siRNA干擾P2X7R能抑制IL-1β表達(dá)，夾脊電針也可抑制IL-1β的表達(dá)，進(jìn)而可能抑制其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，治療脊髓炎性損傷，隨著時(shí)間增加，其治療優(yōu)勢(shì)更明顯。

3.2.3 各組大鼠脊髓組織P2X7R表達(dá)比較 與Sham組比較，各時(shí)間點(diǎn)Model組P2X7R蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明模型制備成功。與P2X7R siRNA組比較，1 d、3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)Control siRNA組表達(dá)水平仍較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明構(gòu)建干擾慢病毒載體成功。經(jīng)夾脊電針治療后，3 d、7 d和21 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)EA組表達(dá)均低于Model組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；質(zhì)粒病毒裝載小片段RNA注射脊髓組織后，3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)P2X7R siRNA組表達(dá)均低于Model組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表4。隨著時(shí)間的推移，Model組表達(dá)在1 d、3 d和7 d表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，7 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，21 d時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)；EA組大鼠脊髓組織表達(dá)在1 d和3 d表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，3 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，7 d和21 d時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。結(jié)果提示脊髓損傷后微環(huán)境中P2X7R表達(dá)明顯升高，質(zhì)粒病毒siRNA干擾P2X7R能抑制表達(dá)，夾脊電針也可抑制表達(dá)，進(jìn)而可能抑制其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，治療脊髓炎性損傷，隨著時(shí)間增加治療優(yōu)勢(shì)更明顯。

表3 各組大鼠脊髓組織IL-1β的平均光密度值

圖3 各組大鼠脊髓組織P2X7R表達(dá)的比較(400×)

表4 各組大鼠脊髓組織P2X7R的平均光密度值

3.3 各組大鼠脊髓組織中P2X7R與OX42共定位表達(dá)

P2X7R與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物OX42免疫熒光雙染可見(jiàn)，P2X7R與OX42存在共定位，且紅色熒光為P2X7R陽(yáng)性，綠色熒光為OX42陽(yáng)性，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，雙陽(yáng)性為橙色。與Sham組比較，各時(shí)間點(diǎn)Model組P2X7R與OX42共定位明顯增多。夾脊電針治療后3 d、7 d和21 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)EA組表達(dá)明顯低于Model組；質(zhì)粒病毒裝載siRNA干擾P2X7R表達(dá)后，3 d、7 d和21 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)P2X7R siRNA組表達(dá)顯著低于Model組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脊髓損傷后P2X7R在脊髓組織小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)明顯增多，夾脊電針和質(zhì)粒病毒裝載siRNA干擾P2X7R表達(dá)能夠有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中P2X7R表達(dá),起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。見(jiàn)圖4。

4 討論

外傷性脊髓損傷導(dǎo)致嚴(yán)重的不可逆性功能喪失。據(jù)估計(jì)，全世界有2 700多萬(wàn)人在脊髓損傷后長(zhǎng)期殘疾，其中90%是由于外傷造成的[10]。課題組前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后NLRP3炎癥小體被激活并且引起一系列的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，證實(shí)夾脊電針可以通過(guò)抑制NLRP3活化，減輕NLRP3炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)脊髓損傷后的肢體功能恢復(fù)，但是激活NLRP3炎性小體上游的調(diào)節(jié)因子尚未明確。酒精性脂肪性肝炎可以通過(guò)抑制或沉默P2X7R阻斷P2X7R/NLRP3信號(hào)軸減少I(mǎi)L-1β以及其他炎性因子的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)[11]。急性脊髓損傷后可以引起小膠質(zhì)細(xì)胞中P2X7R表達(dá)量增加，NLRP3炎癥小體相關(guān)因子表達(dá)升高，從而加重神經(jīng)損傷[12]。夾脊電針是否可以通過(guò)抑制P2X7R阻斷NLRP3炎癥小體活化，減少相關(guān)因子的釋放。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)SCI大鼠在夾脊電針治療后微環(huán)境中P2X7R/NLRP3通路相關(guān)因子的表達(dá)變化，探討該信號(hào)通路對(duì)脊髓損傷炎癥的作用機(jī)制。

炎癥小體首先由 Tschopp 及其同事提出[13]，指的是可以通過(guò) NOD 樣受體[14](NOD- like receptors, NLR)傳遞細(xì)胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)的多蛋白復(fù)合物，它的激活可引起下游的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在所有 NLR 炎性小體中，NLRP3 是研究最廣泛的[15-16]。NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，主要由NOD樣受體家族成員NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC以及pro-caspase-1三部分構(gòu)成[17]。NLRP3炎癥小體的形成通常包括兩個(gè)不同的步驟，即啟動(dòng)(信號(hào)1)和激活(信號(hào)2)[18]。在功能性 NLRP3炎性小體形成之前，細(xì)胞內(nèi)除了必須在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平保證 NLRP3 的合理表達(dá)外，還必須積累一定量的 pro-IL-1β和 IL-18，這是一個(gè)稱為炎性小體啟動(dòng)的過(guò)程，或“信號(hào) 1”。NLRP3 在接受刺激[19-20]，與ASC等蛋白形成功能性NLRP3 炎癥小體，將 pro-capase-1 剪切形成活化的 caspase-1(Cleaved-caspase-1),進(jìn)而將 pro-IL-1β和 pro-IL-18 剪切形成炎癥因子 IL-1β和 IL-18，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這一過(guò)程稱之為炎癥小體的激活過(guò)程,或“信號(hào) 2”。激活NLRP3炎癥小體的機(jī)制很多，主要有細(xì)胞內(nèi)鉀離子的外排、溶酶體破裂、線粒體活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的生成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激等[21]。其中，鉀離子外排是引起炎癥的常見(jiàn)機(jī)制，三磷酸腺苷(Adenosine triphos-phate, ATP)與嘌呤受體P2X7(Purinergic 2X7 receptor，P2X7R)結(jié)合使其激活。研究證實(shí)P2X7R是NLRP3炎性小體最有效的激活因子之一，也是caspase-1裂解和成熟IL-1釋放的激活因子之一[22]。在脊髓損傷中，抑制NLRP3炎癥小體的激活有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[23]，因此，阻斷ATP-P2X7R-NLRP3信號(hào)通路的激活有可能是脊髓損傷治療的新靶點(diǎn)。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)夾脊電針能通過(guò)抑制脊髓損傷大鼠NLRP3炎癥小體的活化，達(dá)到減輕脊髓損傷后炎性損傷[4]、促進(jìn)肢體功能恢復(fù)的作用，但對(duì)與通路上下游的炎癥因子的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，模型組Cleaved-caspase-1、 IL-1β和P2X7R蛋白表達(dá)量增加，說(shuō)明此信號(hào)通路的相關(guān)因子參與了脊髓損傷的機(jī)制，抑制劑Cleaved-caspase-1、 IL-1β和P2X7R表達(dá)量均顯著降低，是由于特異性地抑制P2X7R的表達(dá)，從而減少微環(huán)境中Cleaved-caspase-1、 IL-1β的含量，抑制脊髓組織的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

脊髓損傷的臨床表現(xiàn)與痿病的肢體筋脈遲緩、不能隨意運(yùn)動(dòng)和肌肉萎縮的癥狀相似，故脊髓損傷歸為中醫(yī)“痿病”的范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中將痿分為“脈痿”“筋痿”“肉痿”“骨痿”，又言:“治痿者獨(dú)取陽(yáng)明一經(jīng)，陽(yáng)明者五臟六腑之海，主潤(rùn)宗筋，能束骨而利機(jī)關(guān)也”“陽(yáng)明為之長(zhǎng)……而絡(luò)于督脈”。由此，治痿離不開(kāi)督脈。脊髓損傷位置正在督脈所過(guò)之處，“經(jīng)絡(luò)所過(guò)，主治所及”。夾脊穴位于脊椎兩側(cè)，督脈位于脊椎正中央，夾脊穴、督脈與脊柱形成一體兩翼的關(guān)系。從夾脊穴的解剖來(lái)說(shuō)，其下走行脊神經(jīng)，脊神經(jīng)前根負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)，后跟負(fù)責(zé)感覺(jué)，刺激夾脊穴可直接調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能。電針療法(EA)是將電流應(yīng)用于針刺入體內(nèi)的針上，在脊髓損傷周圍形成電磁場(chǎng)，是治療脊髓損傷的有效方法[24-25]。夾脊電針能明顯緩解和延緩脊髓損傷，促進(jìn)脊髓損傷后脊髓神經(jīng)的恢復(fù)[26]。

圖4 各組大鼠脊髓組織中P2X7R與OX42共定位表達(dá)(600×)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：脊髓組織損傷大鼠脊髓組織中的炎癥相關(guān)因子表達(dá)量增加，而夾脊電針可以降低加重炎癥因子的表達(dá)量，因而加快了脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。因此，筆者得出結(jié)論，夾脊電針作用機(jī)制可能與抑制大鼠脊髓損傷組織微環(huán)境 P2X7R/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)炎癥因子表達(dá)有關(guān)。