寒痹康湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路的影響

龐學(xué)豐 李玉玲 吳燕紅 馮玉青 劉歡 蒙宇華 黃政治 林菊 吳偉泳 馬靜 廖家瑜 王思思

【摘 要】目的：觀察寒痹康湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白/Smad（BMP/Smad）信號通路的影響。方法：采用牛Ⅱ型膠原蛋白和弗氏不完全佐劑充分混合乳化制成CⅡ乳劑，進(jìn)行皮下注射成功造模CIA大鼠模型，予灌服甲氨蝶呤作為對照，觀察寒痹康湯高、中、低劑量提取物對CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)，以及Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：治療4周后，各治療組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.01）。寒痹康湯高劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;寒痹康湯中、低劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與空白對照組比較，模型對照組Wnt5α、Wnt7α蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;與模型對照組比較，甲氨蝶呤組和寒痹康湯高、中、低劑量組Wnt5α、Wnt7α蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;寒痹康湯高、中劑量組與甲氨蝶呤組Wnt5α、Wnt7α蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與空白對照組比較，模型對照組β-catenin、BMP-2、BMP-4、BMP-5、Smad4、Smad5、Smad7蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

與模型對照組比較，甲氨蝶呤組和寒痹康湯高、中、低劑量組上述蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;寒痹康湯高、中劑量組與甲氨蝶呤組上述蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：寒痹康湯可以通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路達(dá)到治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及抗骨侵蝕的作用。

【關(guān)鍵詞】 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;寒痹康湯;Wnt/β-連環(huán)蛋白;骨形態(tài)發(fā)生蛋白/Smad;信號通路;大鼠

Effect of Hanbikang Tang（寒痹康湯）on Wnt/β-catenin and BMP/Smad Signaling Pathway in Collagen Induced Arthritis Rats

PANG Xue-feng，LI Yu-ling，WU Yan-hong，F(xiàn)ENG Yu-qing，LIU Huan，MENG Yu-hua，HUANG Zheng-zhi，LIN Ju，

WU Wei-yong，MA Jing，LIAO Jia-yu，WANG Si-si

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Hanbikang Tang（寒痹康湯）on Wnt/β-catenin and BMP/Smad signaling pathway in collagen induced arthritis（CIA）rats.Methods：CⅡ emulsion was prepared by mixing bovine type Ⅱ collagen and Freund's incomplete adjuvant.The CIA rat model was successfully established by subcutaneous injection，and methotrexate was given to establish the control.The effects of high，medium and low dose extracts of Hanbikang Tang on joint swelling index and expressions of Wnt/β-catenin and BMP/Smad signaling pathway related proteins in CIA rats were observed.

Results：After 4 weeks treatment，the difference of the joint swelling index between each treatment group and the model control group

was statistically significant（P < 0.01），

among which the difference between the high-dose Hanbikang Tang group and the methotrexate group was statistically significant（P < 0.01），and the difference between the middle and low dose Hanbikang Tang group and the methotrexate group was not statistically significant（P > 0.05）.Compared with the blank control group，the protein expression of wnt5α and wnt7α in the model control group increased，and the difference was statistically significant（P < 0.05）;compared with the model control group，the protein expression of wnt5α and wnt7α in the methotrexate group，the high，medium and low dose Hanbikang Tang groups decreased，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.There was no significant difference in the protein expression of wnt5α and wnt7α between the high and medium dose Hanbikang Tang groups and the methotrexate group（P > 0.05）.Compared with the blank control group，the protein expressions of β-catenin，BMP-2，BMP-4，

BMP-5，Smad4，Smad5 and Smad7 in the model control group was increased，and the difference was statistically significant（P < 0.05）;compared with the model control group，the above protein expressions of the methotrexate group and the high，medium and low dose Hanbikang Tang groups were decreased，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.There was no significant difference in the above protein expressions between the high and medium dose Hanbikang Tang groups and methotrexate group（P > 0.05）.Conclusion：

Hanbikang Tang can treat rheumatoid arthritis and resist bone erosion by regulating Wnt/β-catenin and BMP/Smad

signaling pathways.

【Keywords】 collagen induced arthritis;rheumatoid arthritis;Hanbikang Tang（寒痹康湯）;Wnt/β-catenin;

BMP/Smad;signal pathway;rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種

常見的難以治愈的慢性自身免疫性疾病，主要侵犯外周關(guān)節(jié)，未經(jīng)系統(tǒng)治療的晚期RA患者將會出現(xiàn)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞和關(guān)節(jié)畸形改變，導(dǎo)致功能喪失[1]。

研究資料表明，Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白/Smad（BMP/Smad）信號通路在RA的發(fā)生、發(fā)展以及骨質(zhì)破壞中起著非常重要的作用，值得深入探討和研究。本實(shí)驗(yàn)充分混合牛CⅡ膠原蛋白和弗氏不完全佐劑，制成CⅡ乳劑，進(jìn)行皮下注射成功建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，予灌服甲氨蝶呤作為對照，觀察不同劑量的寒痹康湯提取物對Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路的影響情況。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級Wistar雌性大鼠60只，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（動物許可證號SCXK桂2014-0002），體質(zhì)量（100±10）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Wnt5α（生產(chǎn)批號PA5-80231）、β-catenin（生產(chǎn)批號71-2700）、BMP-2（生產(chǎn)批號PA5-85956）、BMP-4（生產(chǎn)批號PA5-102424）、Smad4（生產(chǎn)批號PA5-34806）、Smad5（生產(chǎn)批號39-5700）檢測試劑盒購自Invitrogen公司;Wnt7α（生產(chǎn)批號10605-1-AP）、Smad7（生產(chǎn)批號25840-1-AP）、GAPDH（生產(chǎn)批號60004-1-Ig）檢測試劑盒購自Proteintech公司;BMP-5（生產(chǎn)批號sc-517459）檢測試劑盒購自Santa Cruz Biotechnology公司;造模所用的弗氏不完全佐劑和牛Ⅱ型膠原蛋白購自Chondrex公司;全蛋白提取試劑盒（生產(chǎn)批號BC3710）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（生產(chǎn)批號P0010S）購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 甲氨蝶呤片（國藥準(zhǔn)字H22022674）

購自通化茂祥制藥有限公司;寒痹康湯提取物由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院新藥研發(fā)中心按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提取制備提供，將寒痹康湯（秦艽15 g、黃芪15 g、青風(fēng)藤15 g、防風(fēng)10 g、熟附子10 g、麻黃10 g、當(dāng)歸10 g、淫羊藿20 g、狗脊20 g）經(jīng)乙醇萃取，50 ℃溶解離心，取上清液得到含有活性部位的浸膏。于當(dāng)日進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)之前，按照本實(shí)驗(yàn)的要求，按比例加入乙醇和生理鹽水進(jìn)行溶解配制備用。

2 方 法

2.1 分組及造模 將60只清潔級Wistar雌性大鼠放入動物實(shí)驗(yàn)中心的飼養(yǎng)籠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，7 d后隨機(jī)選取10只作為空白對照組，剩余50只按照有關(guān)造模標(biāo)準(zhǔn)[2]注射CⅡ乳劑進(jìn)行造模：于無菌條件下，將5 mL牛Ⅱ型膠原蛋白與5 mL弗氏不完全佐劑一起放入三通管中，進(jìn)行充分混合乳化制成CⅡ乳劑，制備完成放置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。分別在大鼠的頸部和背部給予皮內(nèi)注射CⅡ乳劑造模，每個(gè)部位注射0.1 mL。于14 d后再次按照此前的注射方法和劑量進(jìn)行注射。根據(jù)上述文獻(xiàn)造模成功的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：大鼠四肢的足爪已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重腫脹，并且踝關(guān)節(jié)直徑增長幅度≥2 mm，評為4分。確定每只大鼠均造模成功，符合實(shí)驗(yàn)要求后，再按照隨機(jī)原則分為模型對照組、寒痹康湯高劑量組、寒痹康湯中劑量組、寒痹康湯低劑量組、甲氨蝶呤組，每組10只。

2.2 治療給藥 不限制空白對照組大鼠的休息、活動及飲食;模型對照組大鼠予2 mL·（100 g）-1的生理鹽水進(jìn)行灌胃，每日1次;甲氨蝶呤組大鼠每周灌服1次2.7 mg·kg-1的甲氨蝶呤藥液，寒痹康湯高、中、低劑量組大鼠分別予高、中、低劑量寒痹康湯提取物[31.25 g·（100 g）-1·d-1、15 g·（100 g）-1·d-1、7.5 g·（100 g）-1·d-1]進(jìn)行灌胃（藥物劑量參考有關(guān)文獻(xiàn)計(jì)算[3]，即按70 kg人體質(zhì)量與200 g大鼠的換算系數(shù)計(jì)算得出），每日2次（每日8：00，18：00）。

2.3 關(guān)節(jié)腫脹程度評分 按照參考文獻(xiàn)[4]中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分：0分，無關(guān)節(jié)腫脹;1分，小趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕度腫脹;2分，小趾關(guān)節(jié)和足跖均出現(xiàn)腫脹;3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪均出現(xiàn)腫脹;4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的所有關(guān)節(jié)均出現(xiàn)腫脹。觀察并記錄所有大鼠治療前及治療1，2，4周的關(guān)節(jié)腫脹變化情況。

2.4 Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測 除空白對照組外，其余各組均給藥治療28 d，之后所有大鼠以水合氯醛進(jìn)行腹腔注射充分麻醉后以頸椎脫臼法處死;逐層分離膝關(guān)節(jié)各層組織，打開關(guān)節(jié)腔，可見由髕骨下極向下延續(xù)有一層淺淡黃色平滑光亮的滑膜組織;用手術(shù)刀片小心切下，再用眼科直鑷進(jìn)行鈍性分離并完整剝離滑膜組織，置于-80 ℃冰箱冰凍保存。本實(shí)驗(yàn)大鼠的各種處理符合實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求。

檢測各項(xiàng)指標(biāo)時(shí)按以下步驟進(jìn)行：滑膜組織稱重后置液氮中研磨，將粉末移至玻璃勻漿器中，按1 mL·（0.1 g）-1加入冰預(yù)冷的組織總蛋白裂解緩沖液。冰上勻漿10～15 min，移勻漿至離心管，4 ℃，離心機(jī)以10 000 r·min-1離心15 min，離心半徑40 cm，取上清至新的離心管即為總蛋白，取10 μL放入EP管備蛋白含量測定，其余置-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。總蛋白含量測定采用Bradford法，以保證各組樣品上樣量相同。待測蛋白變性（100 ℃，5 min）后，行SDS-PAGE分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉1×TBST緩沖液（20 mmol·L-1 Tris-base，137 mmol·L-1氯化鈉，體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween-20） 孵育1 h，TBST緩沖液漂洗后，PVDF膜在室溫下與一抗（Wnt5α、Wnt7α、β-catenin、BMP-2、BMP-4、BMP-5、Smad4、Smad5、Smad7和GAPDH） 4℃孵育過夜，再與免疫球蛋白G二抗室溫下孵育1 h，每次孵育之前均用TBST緩沖液漂洗3次，每次5 min。然后再與化學(xué)發(fā)光劑ECL A液和B液1 mL混合反應(yīng)1 min，ChemiDoc? MP Imaging System圖像工作站取像，測定并分析條帶吸光度，以GAPDH為內(nèi)參。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用方差分析或t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠治療前后關(guān)節(jié)腫脹情況比較 治療2周后，各治療組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均低于模型對照組，其中寒痹康湯高、中劑量組和甲氨蝶呤組與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;

寒痹康湯低劑量組與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。治療4周后，各治療組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;寒痹康湯高劑量組關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)優(yōu)于甲氨蝶呤組（P < 0.01）;寒痹康湯中、低劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

3.2 各組大鼠Wnt5α、Wnt7α蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較，模型對照組Wnt5α、Wnt7α蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型對照組比較，甲氨蝶呤組和寒痹康湯高、中、低劑量組Wnt5α、Wnt7α蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。寒痹康湯高、中劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

3.3 各組大鼠β-catenin、BMP-2蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較，模型對照組β-catenin、BMP-2蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型對照組比較，甲氨蝶呤組和寒痹康湯高、中、低劑量組β-catenin、BMP-2蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。寒痹康湯高、中、低劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

3.4 各組大鼠BMP-4、BMP-5蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較，模型對照組BMP-4、BMP-5蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型對照組比較，甲氨蝶呤組和寒痹康湯高、中、低劑量組BMP-4、BMP-5蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。寒痹康湯高、中、低劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。

3.5 各組大鼠Smad4、Smad5、Smad7蛋白表達(dá)情況比較 與空白對照組比較，模型對照組Smad4、Smad5、Smad7蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型對照組比較，甲氨蝶呤組和寒痹康湯高、中、低劑量組Smad4、Smad5、Smad7蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.05）。寒痹康湯高、中劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表5。

4 討 論

Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路作為一種快速信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與介導(dǎo)機(jī)體各種生理病理反應(yīng)，是機(jī)體的一種重要調(diào)節(jié)機(jī)制。并且最近幾年關(guān)于Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路的研究證明，該信號通路在RA發(fā)病中有重要作用。

研究表明，Wnt通路在RA發(fā)生過程中起重要調(diào)控作用[5]，RA發(fā)病過程中產(chǎn)生的部分炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子[如白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等]、關(guān)節(jié)的骨質(zhì)破壞以及骨修復(fù)的缺陷都與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，特別是與Wnt/β-catenin途徑關(guān)系密切，而后者在RA滑膜細(xì)胞的生長、發(fā)育、增殖、分化中發(fā)揮更重要的調(diào)控作用[6]。

BMP有BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-9等多個(gè)亞型，在骨形成的數(shù)個(gè)階段均起作用。哺乳動物的Smad有8種（Smad1～Smad8），其中Smad2～Smad4、Smad7參與轉(zhuǎn)化生長因子-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而Smad1、Smad4～Smad8參與BMP和活化素等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。對BMP/Smad信號通路的研究結(jié)果顯示，BMP可以提高成骨細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達(dá)，從而發(fā)揮誘導(dǎo)成骨的作用。BMP受體分為Ⅰ型和Ⅱ型2種，BMP與Ⅱ型受體結(jié)合并激活該受體后，進(jìn)一步磷酸化Ⅰ型受體，之后依次激活下游一系列的Smad蛋白[8]，Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與某些成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子相互作用進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，在RA的發(fā)生和發(fā)展過程中，間充質(zhì)祖細(xì)胞樣細(xì)胞群異常增殖和聚集，從而產(chǎn)生大量的炎性分子，BMP信號通路被過度激活，過量表達(dá)的BMP-2能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)下游信號分子的活化，最終影響骨和軟骨的形成，并導(dǎo)致骨損傷。針對RA患者滑膜組織活檢的一項(xiàng)研究結(jié)果表明，其BMP-2和BMP-6含量均顯著高于正常健康人群，BMP-7能抑制RA患者體內(nèi)正常的成纖維樣滑膜細(xì)胞向上皮樣間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化[9]。

甲氨蝶呤是臨床常用的改善病情抗風(fēng)濕藥，是治療RA的經(jīng)典錨定藥，療效確切，常被用作實(shí)驗(yàn)研究的對照藥物，因此筆者選擇其作為本實(shí)驗(yàn)的對照藥物。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA屬“痹病”范疇，正氣虧虛是RA發(fā)病的內(nèi)因，感受風(fēng)寒濕之邪為外因，治療原則為扶正祛邪。寒痹康湯為筆者根據(jù)20多年治療寒濕型活動期RA經(jīng)驗(yàn)所總結(jié)出的臨床驗(yàn)方，由補(bǔ)腎藥和抗風(fēng)濕藥物配伍而成，具有補(bǔ)益肝腎、益氣溫經(jīng)、祛風(fēng)除濕、蠲痹止痛的功效。筆者研究團(tuán)隊(duì)多年應(yīng)用寒痹康湯治療寒濕型RA患者發(fā)現(xiàn)，本方能明顯改善患者的臨床癥狀，恢復(fù)紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白、類風(fēng)濕因子、免疫球蛋白至正常水平，且未見明顯的不良反應(yīng)[10]。動物實(shí)驗(yàn)表明，寒痹康湯能降低CIA大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β、核轉(zhuǎn)錄因子-κB水平[11-14]。然而，在RA的發(fā)病及加重過程中，還有不同的因素參與，值得深入研究。因此，本研究從Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路著手，以期進(jìn)一步闡明寒痹康湯治療RA的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在CIA大鼠中，Wnt5α、Wnt7α、β-catenin、BMP-2、BMP-4、BMP-5、Smad4、Smad5、Smad7蛋白表達(dá)升高，經(jīng)治療后均降低，提示寒痹康湯可以通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路而達(dá)到治療RA的作用，能延緩關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞，是其治療RA及抗骨侵蝕的作用機(jī)制之一。

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[13] 龐學(xué)豐，任志宏，程世和，等.寒痹康湯對實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β及IL-4的影響[J].陜西中醫(yī)，2009，30（7）：919-920.

[14] 龐學(xué)豐，王乾，吳燕紅，等.寒痹康湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2013，2（7）：32-34.

收稿日期：2020-12-16;修回日期：2021-01-15