花生油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)譜分析

許 靜 潘麗娟 李昊遠(yuǎn) 王 通 陳 娜 陳明娜 王 冕 禹山林 侯艷華,* 遲曉元,*

花生油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)譜分析

許 靜1,**潘麗娟1,**李昊遠(yuǎn)2王 通1陳 娜1陳明娜1王 冕1禹山林1侯艷華2,*遲曉元1,*

1山東省花生研究所, 山東青島 266100;2哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 山東威海 264209

為研究不同發(fā)育時(shí)期花生籽仁油脂合成過(guò)程中基因表達(dá)調(diào)控模式, 本研究以高油酸、中油花生品系F18和低油酸、低油花生品種‘魯花6號(hào)’為材料, 對(duì)下針后10、30、40、60 DAP (days after pegging)的花生種子進(jìn)行表達(dá)譜芯片測(cè)序。結(jié)果表明, 130、3556、2783個(gè)基因分別在30、40、60 DAP時(shí)期差異表達(dá)。GO注釋和KEGG富集結(jié)果顯示, 差異表達(dá)的基因主要富集在脂肪酸合成和光合等代謝進(jìn)程中, 其中、、等主要參與油酸的積累, 參與光合作用的基因均為捕光葉綠素/結(jié)合蛋白, 全部上調(diào)表達(dá)。代謝通路圖結(jié)果表明, 籽仁發(fā)育的40 DAP和60 DAP時(shí)期, 脂肪酸合成途徑的基因均上調(diào)表達(dá)。研究結(jié)果為花生油脂代謝的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ), 同時(shí)也為花生品質(zhì)改良貢獻(xiàn)了基因資源。

花生; 基因芯片; 差異表達(dá)分析; 油脂合成相關(guān)基因

花生(L.)是世界上重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物, 也是重要的食用油和食用蛋白源, 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。我國(guó)是世界上最大的花生消費(fèi)國(guó), 每年花生總產(chǎn)量的46%~48%用于榨油。花生籽仁中脂肪含量占50%左右, 其中80%為不飽和脂肪酸, 能夠降低有害膽固醇, 減緩動(dòng)脈粥樣硬化, 有效預(yù)防冠心病等心腦血管疾病[2], 是人們理想的健康食用油。因此, 提高花生含油量是國(guó)家發(fā)展的重大需求, 市場(chǎng)潛力巨大, 發(fā)展前景廣闊。

植物油脂的合成過(guò)程復(fù)雜, 涉及多種酶的催化作用。甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(-glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)、溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(lysophosphatidyl acyltransferase, LPAAT)和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase, DGAT)是參與植物油脂合成的3個(gè)關(guān)鍵酶。近年來(lái), 花生油脂合成方面也取得了一定的研究進(jìn)展。陳玉梅等[3]對(duì)花后20、35、50、60 d的花生籽粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 共得到135條代謝通路, 其中與油脂合成相關(guān)的有脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成、脂肪酸延長(zhǎng)、脂肪酸代謝、花生四烯酸代謝等代謝通路。Chi等[4]在花生中分離得到6個(gè)基因, RT-PCR分析發(fā)現(xiàn), 在花生籽仁發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加, 同時(shí)在逆境環(huán)境下,基因在葉片或根中的表達(dá)顯著增加。3個(gè)基因從花生中被克隆出來(lái),在籽仁發(fā)育的初期表達(dá)較低, 但在果針入土50 d時(shí)表達(dá)增加,在果針入土10 d和50 d高表達(dá),在果針入土20 d和50 d表達(dá)量最高[5]。Zheng等[6]將轉(zhuǎn)到煙草中, 與野生型相比, 脂肪酸含量增加14.7%~20.9%。Chi等[7]通過(guò)RT-PCR或RACE-PCR在花生中克隆得到4個(gè)基因,基因在籽粒中富集表達(dá), 主要集中在籽粒發(fā)育初期, 然而基因在籽粒發(fā)育時(shí)期表達(dá)量下降, 主要在花中富集表達(dá)。Chen等[8]克隆了花生中的基因, RT-PCR表明在花后40 d和50 d表達(dá)量與種子中油脂的積累速率同步增加。皮廣靜等[9]分析高油品系農(nóng)大D666及其親本不同發(fā)育時(shí)期籽仁內(nèi)三類酰基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)量表明, R5期和、基因表達(dá)量之間協(xié)調(diào)性較好, 有利于油脂的合成與積累。

硬脂酰-ACP去飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase, FAB2)是實(shí)現(xiàn)硬脂酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶, 微粒體Δ12去飽和酶(Microsomal Δ12 desaturase, FAD2)是調(diào)控花生油酸、亞油酸含量和油亞比(O/L)的關(guān)鍵酶。在酵母中異源表達(dá)和發(fā)現(xiàn)了亞油酸的形成, 證實(shí)了兩基因的功能[10]。此外, Chi等[11]克隆了一系列的脂肪酸去飽和酶, RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)和在籽粒中較其他組織表達(dá)量高, 在籽粒發(fā)育時(shí)期,、、表達(dá)量逐漸上升達(dá)到最高水平, 然后降低。轉(zhuǎn)錄因子WRINKLED(WRI1)是在種子皺縮的擬南芥突變體中發(fā)現(xiàn)并命名, 研究發(fā)現(xiàn)該基因會(huì)導(dǎo)致突變體種子含油量降低80%[12]。隨后, WRI1轉(zhuǎn)錄因子常被用于油料作物和模式植物油分改良相關(guān)的研究。Pouvreau等[13]研究表明, 過(guò)表達(dá)基因, 能使轉(zhuǎn)基因玉米種子中含油量增加, 同時(shí)還發(fā)現(xiàn)基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中三酰甘油主鏈生成的作用。孫金波等[14]從二倍體花生野生種和四倍體栽培種克隆到20個(gè)WRI1轉(zhuǎn)錄因子, 轉(zhuǎn)錄組分析表明在種子中的表達(dá)高于其他組織, RT-PCR結(jié)果進(jìn)一步表明,表達(dá)隨種子成熟水平逐漸增加。為進(jìn)一步研究花生油脂合成的調(diào)控機(jī)制, 本研究選用油酸和油脂含量差異顯著的2個(gè)花生品種(系)。通過(guò)基因芯片測(cè)序技術(shù), 研究花生種子不同發(fā)育階段的全基因組表達(dá)譜, 并分離克隆出與種子發(fā)育有關(guān), 特別是與油脂或脂肪酸合成和調(diào)控有關(guān)的特異表達(dá)基因, 以期為花生品質(zhì)的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

花生(L.)材料選擇山東省花生研究所雜交育種課題組培育的高油酸、中油花生品系F18和低油酸、低油花生品種‘魯花6號(hào)’。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 分別在10、30、40、60 DAP選取無(wú)病害、長(zhǎng)勢(shì)一致的花生莢果, 剝?nèi)セㄉ鷼ず笱杆賹⒆讶史湃胍旱兴賰?-80℃保存, 作為芯片測(cè)序的樣品。另取各個(gè)時(shí)期花生莢果適量, 作為油脂和脂肪酸含量測(cè)定的樣品。

1.2.2 花生籽仁油脂和脂肪酸含量測(cè)定 采用索氏提取法[15]提取油脂, 脂肪酸的提取及氣相色譜分析方法具體參考遲曉元等[16]的方法。樣品采用3 g左右研磨成粉末的花生種子, 每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.3 RNA提取和純化 采用北京天根生化科技有限公司試劑盒(RNeasy Mini Kit)提取樣品總RNA。使用NucleoSpin RNA純化試劑盒(MAC HEREYNAGEL, 德國(guó)) 進(jìn)行RNA樣品的純化。用甲醛瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA質(zhì)檢, 然后用Nanovue Plus分光光度計(jì)(General Electric Company, USA)對(duì)RNA進(jìn)行定量。所有RNA樣品均保存于-80℃冰箱備用。

1.2.4 基因芯片制備 芯片測(cè)序工作由廈門(mén)博奧生物科技有限公司完成。采用Roche公司的NimbleGen花生表達(dá)譜芯片, 芯片包含36,158個(gè)探針組。Roche NimbleGen表達(dá)譜芯片試驗(yàn)流程按照博奧生物公司的規(guī)定流程進(jìn)行, 具體方法參考Yu等[17]的方法。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用NimbleScan v2.6軟件將雜交芯片的圖像信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。采用Genespring v13.0軟件分位數(shù)法進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理, 以上工作均由博奧生物有限公司完成。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 差異基因的篩選條件為: 校正后的-value≤0.05且2個(gè)樣品的差異倍數(shù)|fold change|≥2。

1.2.6 GO功能注釋及富集分析 首先利用blast+ v2.2.30將基因序列與NCBI中的NR、Swissprot、TrEm1等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。然后將比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入Blast2GO中用于GO注釋, 主要包括分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組分信息注釋。最后利用WEGO對(duì)GO功能進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)(http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)。

1.2.7 KEGG Pathway分類與富集分析 利用KEGG網(wǎng)站(http://www.kegg.jp/)對(duì)獲得的序列進(jìn)行代謝通路分類, 同一個(gè)基因序列可能注釋到多個(gè)代謝通路中。使用R軟件中g(shù)gplot2軟件包進(jìn)行富集分析。

1.2.8 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 將F18和‘魯花6號(hào)’40 DAP和60 DAP 2個(gè)時(shí)期的所有差異表達(dá)的基因序列比對(duì)結(jié)果上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)中, 分析蛋白之間的互作關(guān)系。然后導(dǎo)入到cytoscape中進(jìn)行編輯作圖。

1.2.9 差異表達(dá)基因的RT-PCR驗(yàn)證 參照陳娜等[18]的方法進(jìn)行熒光定量PCR的反應(yīng)。每個(gè)樣品3次重復(fù), 內(nèi)參基因選擇, 采用2–DDCt方法分析數(shù)據(jù)。熒光定量PCR所用引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育時(shí)期花生籽仁油脂和脂肪酸含量分析

F18和‘魯花6號(hào)’不同發(fā)育時(shí)期花生籽仁含油量和脂肪酸組分含量如表2, 兩品種(系)含油量和油酸含量隨著籽仁的發(fā)育不斷積累。除了30 DAP發(fā)育時(shí)期, F18在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的含油量均高于‘魯花6號(hào)’, 兩品種(系)在60 DAP發(fā)育時(shí)期含油量均最高, 分別為50.81%和45.44%。F18在4個(gè)發(fā)育時(shí)期的油酸含量均高于‘魯花6號(hào)’, 在40 DAP發(fā)育時(shí)期達(dá)76.06%, 而‘魯花6號(hào)’在60 DAP達(dá)到最高, 為43.98%。亞油酸含量在兩品種(系)中隨著籽仁發(fā)育呈下降趨勢(shì), F18和‘魯花6號(hào)’均在60 DAP發(fā)育時(shí)期達(dá)到最低, 為1.55%和34.28%, 油亞比均最高為45.65和1.28。

表1 RT-PCR驗(yàn)證基因所用的引物

2.2 不同發(fā)育時(shí)期花生籽仁差異表達(dá)基因分析

根據(jù)芯片雜交結(jié)果中不同發(fā)育時(shí)期籽仁基因表達(dá)水平, 篩選出顯著差異表達(dá)的基因。10 DAP時(shí)期兩品種(系)基因表達(dá)水平差異不顯著(圖1-A); 30 DAP時(shí)期在兩品種(系)中差異表達(dá)的基因共130個(gè), 與‘魯花6號(hào)’相比, F18上調(diào)表達(dá)基因20個(gè), 下調(diào)表達(dá)基因110個(gè)(圖1-B); 兩品種(系)在40 DAP時(shí)期差異表達(dá)的基因數(shù)目最多, 達(dá)3556個(gè), 其中上調(diào)的差異表達(dá)基因有2056個(gè), 下調(diào)的有1500個(gè)(圖1-C); 60 DAP時(shí)期兩品種(系)差異表達(dá)的基因共2783個(gè), 相對(duì)于‘魯花6號(hào)’, F18上調(diào)表達(dá)的基因有1746個(gè), 下調(diào)表達(dá)的基因有1037個(gè)(圖1-D)。

表2 不同發(fā)育時(shí)期兩品種(系)油脂和脂肪酸含量

A: 10 DAP差異表達(dá)基因; B: 30 DAP差異表達(dá)基因; C: 40 DAP差異表達(dá)基因; D: 60 DAP差異表達(dá)基因。紅色表示F18相對(duì)于‘魯花6號(hào)’差異表達(dá)的基因。

A: different expression genes of 10 DAP; B: different expression genes of 30 DAP; C: different expression genes of 40 DAP; D: different expression genes of 60 DAP. Red blots represent the different expression genes of F18 compared with ‘Luhua 6’.

根據(jù)篩選的差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn), 一些基因在花生籽仁發(fā)育的不同時(shí)期均有表達(dá)。由圖2可知, 與‘魯花6號(hào)’相比, F18在30、40、60 DAP 3個(gè)時(shí)期同時(shí)表達(dá)上調(diào)的基因有6個(gè), 下調(diào)表達(dá)的基因?yàn)?0個(gè); 在40、60 DAP 2個(gè)時(shí)期共同差異表達(dá)上調(diào)的有712個(gè), 差異表達(dá)下調(diào)的有362個(gè)。

A: F18相比于‘魯花6號(hào)’上調(diào)表達(dá)基因; B: F18相比于‘魯花6號(hào)’下調(diào)表達(dá)基因。

A: the up-regulated expression genes of F18 compared with ‘Luhua 6’; B: the down-regulated expression genes of F18 compared with ‘Luhua 6’.

2.3 不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)基因的GO功能注釋分析

對(duì)篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋, 3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期分別注釋22、1914和1559個(gè)差異基因, 主要包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別。如圖3-A所示, 40 DAP和60 DAP時(shí)期差異表達(dá)基因主要參與代謝調(diào)控(metabolic process GO: 0008152)和催化進(jìn)程(catalytic activity GO: 0003824)。有趣的是, 參與光合作用的基因全部上調(diào)(53個(gè))而沒(méi)有下調(diào), 這些參與光合作用的基因大量上調(diào)導(dǎo)致F18固定空氣中更多的CO2, 并合成為自身碳源, 最終流向脂質(zhì)合成。此外, 還發(fā)現(xiàn)前體代謝物和能量的生成上調(diào)的基因有42個(gè), 而下調(diào)僅有1個(gè)。這些光合作用、糖、蛋白等代謝也對(duì)油脂合成和積累有一定影響。進(jìn)一步對(duì)40 DAP和60 DAP 2個(gè)時(shí)期差異表達(dá)的1074個(gè)基因進(jìn)行富集發(fā)現(xiàn), 共有598個(gè)基因富集到11個(gè)GO類別中(圖3-B)。其中代謝進(jìn)程富集的基因最多, 這表明‘魯花6號(hào)’和F18參與代謝途徑的基因的表達(dá)有顯著差異。

2.4 不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)基因的KEGG Pathway富集分析

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù), 本研究對(duì)花生籽仁40 DAP和60 DAP 2個(gè)發(fā)育時(shí)期1074個(gè)差異表達(dá)的基因(上調(diào)表達(dá)基因712個(gè), 下調(diào)表達(dá)基因362個(gè))進(jìn)行KEGG Pathway富集分析。上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在光合、氰氨基酸代謝、脂肪酸合成和淀粉蔗糖代謝4個(gè)代謝途徑中(圖4-A), 注釋的基因分別為25、12、21和9個(gè)。下調(diào)表達(dá)的基因只富集在檸檬烯和蒎烯降解途徑中, 沒(méi)有富集到與脂肪酸代謝相關(guān)的途徑(圖4-B)。這表明, 與‘魯花6號(hào)’相比, F18中參與脂肪酸合成的基因在花生籽仁發(fā)育的后期表達(dá)量普遍較高。另外, 本研究發(fā)現(xiàn), 光合途徑差異表達(dá)基因編碼的都是捕光葉綠素/結(jié)合蛋白, 這些蛋白復(fù)合體能夠捕獲并傳遞光能, 調(diào)節(jié)光能分配, 而光合作用是植物一切物質(zhì)積累的源頭, 這一發(fā)現(xiàn)反應(yīng)了2個(gè)品種(系)自身的遺傳差異。

針對(duì)我們感興趣的脂肪酸合成途徑, 繪制了代謝通路圖(圖5)。結(jié)果顯示, 在F18和‘魯花6號(hào)’后2個(gè)發(fā)育時(shí)期脂肪酸合成途徑中沒(méi)有找到下調(diào)的基因, 說(shuō)明在這一時(shí)期中, F18的脂肪酸合成代謝比‘魯花6號(hào)’更旺盛, 產(chǎn)生更多的脂肪酸。在代謝通路的最開(kāi)始, 第1個(gè)上調(diào)的是ACCase (EC: 6.4.1.2)基因, 催化脂肪酸生物合成的起始; 而后在脂肪酸合成循環(huán)的通路中, β-酮脂酰ACP合酶(FabF)、β-酮脂酰ACP還原酶(FabG)、β-羥?；鵄CP脫水酶(FabZ)和烯酰-ACP還原酶(FabI)均上調(diào), 他們共同催化脂肪酸的縮合反應(yīng); 在途徑的末端, 長(zhǎng)鏈?；铣擅?EC:6.2.1.3)基因上調(diào)表達(dá), 合成長(zhǎng)鏈的脂肪酸。

2.5 油脂代謝相關(guān)基因的篩選

根據(jù)GO注釋的結(jié)果, 我們分別在40 DAP和60 DAP籽仁發(fā)育時(shí)期篩選到64個(gè)和62個(gè)參與油脂代謝相關(guān)的基因, 其中分別鑒定到25個(gè)和27個(gè)油脂合成的關(guān)鍵基因(表3和表4)。硬脂酰ACP去飽和酶(FAB2)是催化硬脂酸產(chǎn)生油酸的關(guān)鍵酶, ω6脂肪酸去飽和酶(FAD2)是催化油酸C12位去飽和酶形成亞油酸的一類酶?；ㄉ讶拾l(fā)育的40 DAP時(shí)期, F18花生品系中兩基因均上調(diào)表達(dá)(和), 比‘魯花6號(hào)’花生品種中的表達(dá)量分別高3.48倍和2.06倍。在60 DAP發(fā)育時(shí)期,起關(guān)鍵作用, 與‘魯花6號(hào)’相比, F18中()表達(dá)量顯著增加, 高達(dá)29.89倍。

2.6 WRI1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

在花生籽仁發(fā)育后期的差異表達(dá)基因中篩選到WRI1轉(zhuǎn)錄因子, 以WRI1為核心進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析, 共發(fā)現(xiàn)9個(gè)與WRI1互作的蛋白(圖6)。其中KASI (3-酮酰基?；d體蛋白合酶)、MOD1 (烯?；d體蛋白還原酶)和GLB1 (氮調(diào)控蛋白)與脂質(zhì)代謝有關(guān), SUC5 (蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)和UGT84B1 (葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)參與糖代謝, 進(jìn)一步使碳源從糖代謝流向脂肪酸合成, 促進(jìn)脂肪酸合成。

2.7 不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)基因的RT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證芯片測(cè)序結(jié)果中基因表達(dá)量的準(zhǔn)確性, 隨機(jī)挑選了不同發(fā)育時(shí)期的16個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證, 16個(gè)差異表達(dá)基因及內(nèi)參基因引物如表1所示。將RT-PCR結(jié)果與芯片測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn), 16個(gè)差異表達(dá)基因與芯片數(shù)據(jù)基本吻合(圖7和表5), 表明芯片測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性, 可以用來(lái)分析不同發(fā)育時(shí)期花生籽仁差異表達(dá)的基因。

紅色代表相對(duì)于‘魯花6號(hào)’, F18上調(diào)表達(dá)的基因。

Red represents the up-regulated expression genes of F18 compared with ‘Luhua 6’.

表3 40 DAP發(fā)育時(shí)期油脂代謝相關(guān)基因

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

a表示F18相對(duì)于‘魯花6號(hào)’的上調(diào)和下調(diào)。

arepresents the up- and down-regulated expression genes of F18 compared with ‘Luhua 6’.

表4 60 DAP發(fā)育時(shí)期油脂代謝相關(guān)基因

(續(xù)表4)

a表示F18相對(duì)于‘魯花6號(hào)’的上調(diào)和下調(diào)。

arepresents the up- and down-regulated expression genes of F18 compared with ‘Luhua 6’.

3 討論

油酸是有益脂肪酸, 能夠減少心腦血管的發(fā)生, 維持身體健康[19]。最近幾年已有多家單位開(kāi)展高油酸花生育種工作: 姜慧芳等[20]發(fā)現(xiàn), 遠(yuǎn)緣雜交后脂肪酸的變異遠(yuǎn)超過(guò)親本間的差異, 并且獲得了6份油酸含量達(dá)64.0%以上且棕櫚酸含量在8.5%以下的新種質(zhì); 于明洋等[21]將‘花育22’與‘開(kāi)農(nóng)1716’雜交并不斷回交, 獲得了24個(gè)油酸含量高于70%的花生新品系。然而, 高油酸代謝的分子機(jī)制研究相對(duì)較少, 尤其是不同花生品種(系)之間。本研究對(duì)‘魯花6號(hào)’和F18不同發(fā)育時(shí)期的花生籽仁進(jìn)行芯片測(cè)序, 分別在10 DAP、30、40、60發(fā)育時(shí)期篩選到130、3556、2783個(gè)差異表達(dá)的基因(10 DAP發(fā)育時(shí)期無(wú)差異表達(dá)基因)。本研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)育初期(10 DAP和30 DAP)兩品種(系)之間差異表達(dá)基因較少, 而在40 DAP發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)基因數(shù)目最多, 60 DAP發(fā)育時(shí)期相對(duì)減少, 這與植物種子油脂積累呈現(xiàn)慢—快—慢的變化規(guī)律相一致[22]。

黑色和灰色分別代表相對(duì)于‘魯花6號(hào)’, F18上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因。

Black and grey represent the up- and down-regulated expression genes of F18 compared with ‘Luhua 6’.

表5 差異表達(dá)基因的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

(續(xù)表5)

a表示F18相對(duì)于‘魯花6號(hào)’的上調(diào)和下調(diào)。

arepresents the up- and down-regulated expression genes of F18 compared with ‘Luhua 6’.

GO注釋及富集分析發(fā)現(xiàn), 40 DAP和60 DAP 2個(gè)時(shí)期共有416個(gè)差異表達(dá)的基因富集到代謝進(jìn)程(metabolic process)。其中相比于‘魯花6號(hào)’, F18在脂質(zhì)代謝進(jìn)程中上調(diào)表達(dá)基因居多, 表明F18在花生籽仁發(fā)育后期, 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因活躍, 油脂合成加快, 這可能是造成兩品種(系)間含油量差異的原因。GO富集分析發(fā)現(xiàn), F18中參與光合作用的基因表達(dá)量均比‘魯花6號(hào)’高, 這將促使F18固定更多的碳源并流向油脂合成途徑。此外, F18中前體代謝和能量生成途徑上的基因上調(diào)表達(dá)。這些光合作用、糖、蛋白等代謝進(jìn)程的活躍將促進(jìn)油脂合成和積累, 與前人研究相符[23]。

已有研究證明和在改善油料作物脂肪酸組分方面發(fā)揮了作用。與野生型相比, 轉(zhuǎn)基因的煙草植株不飽和脂肪酸(尤其是油酸)含量更高[24]。FAD2是調(diào)控花生油酸、亞油酸含量和油亞比(O/L)的關(guān)鍵酶,酶活性的喪失是產(chǎn)生高O/L比值花生的主要原因之一[25]。本研究發(fā)現(xiàn), 60 DAP花生發(fā)育時(shí)期, F18中兩基因均上調(diào)表達(dá), 但的表達(dá)量差異倍數(shù)(29.89)遠(yuǎn)高于(3.82), 這表明F18品系花生籽仁發(fā)育后期,基因起主要作用, 因此導(dǎo)致F18的油酸含量高于‘魯花6號(hào)’。這與官梅等[26]利用芯片測(cè)序的結(jié)果一致。

轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá), 有研究發(fā)現(xiàn), 一些轉(zhuǎn)錄因子能夠參與植物油脂代謝[27]。WRI1 (WRINKLED1)轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP家族的一員, Maeo等[28]發(fā)現(xiàn), 超表達(dá)基因能夠上調(diào)脂肪酸合成途徑的一系列基因, 包括、、、等。Fukuda等[29]的研究表明,能夠與脂肪酸合成相關(guān)基因的上游序列AW-box結(jié)合, 調(diào)控乙酰輔酶A羧化酶基因的表達(dá), 進(jìn)而調(diào)控油脂代謝。本研究在花生籽仁發(fā)育的后期篩選到了轉(zhuǎn)錄因子, 其在F18中的表達(dá)量比在‘魯花6號(hào)’高3.99倍, 但是本文中篩選到的與油脂合成相關(guān)的差異表達(dá)基因是否受到該轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控有待進(jìn)一步研究。

以上數(shù)據(jù)表明, 花生籽仁油脂的合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程, 受許多基因和轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控。研究結(jié)果可為花生籽仁油脂合成機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ), 為花生品質(zhì)育種提供新的基因資源, 但是相關(guān)基因復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

分別在30、40、60 DAP時(shí)期檢測(cè)到130、3556、2783個(gè)差異表達(dá)的基因。GO注釋、KEGG富集和代謝通路圖表明, 差異表達(dá)的基因主要參與脂肪酸合成和光合等代謝進(jìn)程, 其中硬脂酰-ACP去飽和酶(FAB2)、微粒體Δ12去飽和酶(FAD2)、WRI1轉(zhuǎn)錄因子主要參與油酸的積累。

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Expression pattern analysis of genes related to lipid synthesis in peanut

XU Jing1,**, PAN Li-Juan1,**, LI Hao-Yuan2, WANG Tong1, CHEN Na1, CHEN Ming-Na1, WANG Mian1, YU Shan-Lin1, HOU Yan-Hua2,*, and CHI Xiao-Yuan1,*

1Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, Shandong, China;2School of Marine and Technology, Harbin Institute of Technology, Weihai 264209, Shandong, China

In order to survey the regulation patterns of genes expression in the synthesis of oil at different developmental stages in peanut seed, F18 (high-oleic medium oil peanut variety) and ‘Luhua 6’ (low-oleic acid low oil variety) were used as research materials. The expression pattern analysis of genes was performed for peanut seeds on the 10, 30, 40, and 60 DAP, respectively. The results indicated that 130, 3556, and 2783 genes were significantly differentially expressed in the two varieties (lines) on the 30, 40, and 60 DAP, respectively. GO annotation and KEGG enrichment showed that DEGs were mainly enriched in the fatty acid synthesis and photosynthetic pathways, such as,,genes, which were involved in the accumulation of oleic acid. All the genes involved in photosynthesis pathway were photochlorophyll binding proteins and all of them were up-regulated. KEGG pathway indicated that all the genes involved in fatty acid biosynthesis pathway on the 40 DAP and 60 DAP were up-regulated. In summary, these results provide a theoretical basis for molecular study of fatty acid synthesis in the development stage of peanut seeds and offer some candidate genes as gene resources of quality improvement in peanut breeding.

peanut; microarray; differentially expressed genes; genes involved in lipid synthesis

10.3724/SP.J.1006.2021.04150

本研究由國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(花生)建設(shè)專項(xiàng)(CARS-13), 青島市科技惠民示范引導(dǎo)專項(xiàng)(20-3-4-26-nsh), 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC2016B02, CXGC2018E21), 山東省重大科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2019JZZY010702), 廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2020B020219003), 山東省良種工程(2017LZGC003), 臨沂市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2019YD009)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31701464)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System (CARS-13), the Qingdao People’s livelihood Science and Technology Program (20-3-4-26-nsh), the Agricultural Scientific and Technological Innovation Project of Shandong Academy of Agricultural Sciences (CXGC2016B02, CXGC2018E21), the Breeding Project from Department Science & Technology of Shandong Province (2019JZZY010702), the Key-Area Research and Development Program of Guangdong Province (2020B020219003), the Improved Variety Engineering Project of Shandong Province (2017LZGC003), the Key Research and Development Program of Linyi (2019YD009), and the National Natural Science Foundation of China (31701464).

遲曉元, E-mail: chi000@126.com; 侯艷華, E-mail: houyanhua2006@163.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

許靜, E-mail: xu_jing_cool@yeah.net

2020-07-10;

2020-11-13;

2020-12-23.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201223.1136.006.html