玉米光敏色素A1基因(ZmPHYA1)在棉花中的轉(zhuǎn)化及分子鑒定

馬燕斌 王 霞 李換麗 王 平 張建誠 文 晉 王新勝 宋梅芳 吳 霞,* 楊建平

研究簡報(bào)

玉米光敏色素基因()在棉花中的轉(zhuǎn)化及分子鑒定

馬燕斌1,**王 霞2,**李換麗1王 平3張建誠1文 晉1王新勝1宋梅芳3吳 霞1,*楊建平4,*

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)棉花研究所, 山西運(yùn)城 044000;2運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系, 山西運(yùn)城 044000;3北京市輻射中心, 北京 100875;4河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河南鄭州 450002

為評價(jià)玉米基因在棉花種質(zhì)資源改良中的價(jià)值, 本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在陸地棉() R15材料中進(jìn)行了玉米基因的遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)、抗性愈傷篩選、體細(xì)胞分化誘導(dǎo)后獲得棉花轉(zhuǎn)基因再生植株。通過田間草銨膦除草劑篩選鑒定抗性植株, 并利用PCR擴(kuò)增其草銨膦抗性基因和目的基因進(jìn)行分子鑒定, 發(fā)現(xiàn)陽性植株對草銨膦除草劑具較好抗性, 并可擴(kuò)增到256 bp的草銨膦抗性基因和217 bp基因的特異條帶。進(jìn)一步通過免疫印跡檢測表明, 3個(gè)不同轉(zhuǎn)基因株系中外源基因可正常表達(dá)約170 kD大小的蛋白, 且在不同組織中該外源蛋白均可正常表達(dá)。此外, 對轉(zhuǎn)基因植株的不同農(nóng)藝性狀分析表明, 轉(zhuǎn)基因株系株高明顯低于受體對照, 而鈴重和纖維長度等性狀無明顯差異。本研究成功獲得具有草銨膦抗性和外源基因的棉花新種質(zhì)材料, 為進(jìn)一步利用光敏色素基因創(chuàng)新種質(zhì)資源提供了材料來源。

陸地棉; 玉米光敏色素A1; 蛋白表達(dá); 草銨膦抗性

光敏色素是一類與植物發(fā)育密切相關(guān)的光信號受體蛋白, 它能通過介導(dǎo)光信號調(diào)控植物種子萌發(fā)、向光性、避蔭性、莖稈伸長、葉綠體運(yùn)動(dòng)以及開花期等生長發(fā)育過程[1-2]。光敏色素家族成員在單子葉和雙子葉植物中均有報(bào)道。在擬南芥中光敏色素基因家族有和共5個(gè)成員組成[2]。而在禾本科植物中, 光敏色素基因只存在、和3個(gè)亞家族。其中, 二倍體水稻中含有和3個(gè)單拷貝基因[3-4], 對和基因的單缺失突變體和雙缺失突變體研究證實(shí), 該基因與胚芽鞘伸長、根的向地性反應(yīng)、幼苗去黃化以及開花時(shí)間等的調(diào)控相關(guān)[5-6]。異源六倍體小麥中光敏色素基因家族中和分別有3個(gè)拷貝[7-8]。玉米由于遠(yuǎn)古種基因組經(jīng)過了四倍體化的過程, 造成基因組中和分別保留有2個(gè)拷貝[9-10]; 其中, 玉米中和在不同光條件下均可以正常表達(dá), 但RNA表達(dá)豐度存在一定差異[11]。

光敏色素基因在調(diào)節(jié)作物農(nóng)藝性狀發(fā)育等方面具有一定作用。研究發(fā)現(xiàn), 在雙子葉植物煙草和番茄中過表達(dá)單子葉植物燕麥的基因, 均導(dǎo)致株高顯著降低[12-13], 其中, 在轉(zhuǎn)基因煙草中莖和葉柄的微管組織中能檢測到高濃度的燕麥, 表明微管組織是作用的一個(gè)可能位點(diǎn)[13]。轉(zhuǎn)擬南芥的或到水稻或馬鈴薯中可以分別促進(jìn)水稻籽?；蝰R鈴薯產(chǎn)量發(fā)生變化[15-18]。除此以外, 光敏色素和可通過ABA與茉莉酸的協(xié)同互作對耐鹽性進(jìn)行負(fù)向調(diào)控[14]。由此可見, 光敏素色與作物農(nóng)藝經(jīng)濟(jì)性狀等發(fā)育過程具有較為密切的關(guān)聯(lián)性, 在作物中過表達(dá)光敏色素基因?qū)μ接懽魑锔牧季哂幸欢ǖ闹匾饬x。

為探討光敏色素基因在棉花種質(zhì)資源創(chuàng)制中的利用價(jià)值, 我們通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米基因到棉花中。我們的研究結(jié)果顯示, 外源蛋白在棉花中成功表達(dá), 該基因能有效降低棉花株高, 表明利用光敏色素基因改良棉花具有一定的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 目的基因載體構(gòu)建及棉花轉(zhuǎn)化

利用克隆的玉米基因, 與克隆載體pMD18-T載體鏈接, 測序編碼序列長度為3393 bp[11], 雙酶切后與pJIM19-Bar表達(dá)載體連接, 融合9×Myc標(biāo)簽蛋白, 該基因由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng), 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞, 卡納霉素篩選獲得陽性克隆后, 提取質(zhì)粒并酶切, 經(jīng)PCR檢測目標(biāo)基因。將構(gòu)建好的pJIM19-Bar雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中備用。將該農(nóng)桿菌菌株在含有利福平和卡納的抗生素的LB液體培養(yǎng)基中28℃搖床懸浮過夜培養(yǎng)至OD600值為0.5, 離心收集農(nóng)桿菌后, 倒去上清液, 沉淀用30 g L–1的葡萄糖重新懸浮, 將OD600值調(diào)整到0.2后進(jìn)行侵染。

將R15棉花幼苗的下胚軸切成小段, 用含有目標(biāo)基因的農(nóng)桿菌侵染莖段15 min, 共培養(yǎng)后誘導(dǎo)愈傷組織。誘導(dǎo)后的愈傷組織在含有草銨膦的培養(yǎng)基上篩選形成愈傷組織, 愈傷形成后進(jìn)行分化誘導(dǎo)獲得棉花再生植株[19]。

1.2 田間抗性檢測

再生獲得的棉花植株統(tǒng)一編號, 嫁接成活后收獲T0代種子, 將T0代種子種植移栽, 加代自交保純獲得T1代種子。后續(xù)世代苗期在三至四葉期連續(xù)2次葉面噴施0.05%的草銨膦除草劑, 7 d后篩選抗性轉(zhuǎn)基因植株, 自交后獲得抗性植株種子?？剐灾仓昱c野生型植株種植在隔離網(wǎng)室, 按照田間種植要求統(tǒng)一管理, 連續(xù)自交至純合, 收獲后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 轉(zhuǎn)基因棉花DNA分子檢測

采用改良CTAB法提取棉花材料DNA[20]。16 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系: 8 μL的2×GC buffer、0.5 μL dNTP Mix、0.5 μL引物、0.1 μL Ex酶、0.5 μL模板DNA和ddH2O補(bǔ)足12 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性4 min; 94℃變性40 s, 61℃退火40 s, 72℃延伸45 s, 循環(huán)25次; 最后72℃延伸10 min, 12℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物, 凝膠成像系統(tǒng)照相保存。引物見表1。

表1 轉(zhuǎn)基因棉花植株中用于目標(biāo)基因的檢測引物

1.4 免疫印跡分析

取PCR檢測為陽性的棉花植株的幼嫩葉片, 液氮研磨約0.1 g葉片, 加蛋白提取緩沖液: 50 mmol L–1Tris-HCl、150 mmol L–1NaCl、1 mmol L–1EDTA、10%甘油、2 mmol L–1NaVO4、0.05% Tween-20、25 mmol L–1甘油磷酸和去離子水配制, 提取后轉(zhuǎn)入1.5 mL滅菌離心管中, 離心提取上清液后, 分光光度計(jì)檢測蛋白濃度, 均一化稀釋備用。蛋白電泳上樣前加5′Loading buffer, 樣品煮沸10 min變性, 取等量樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳; 電泳完成后, 切去濃縮膠及不規(guī)則邊緣, 膜與膠、濾紙放置好后轉(zhuǎn)膜1.5 h、取出膜后利用5%脫脂奶粉封閉2 h、期間輕搖; 完成后保持膜濕潤放入含有Myc抗體的2%脫脂奶粉中雜交2 h, TBST清洗后加二抗雜交1.5 h, 清洗后磷酸緩沖液浸泡5 min, 重新加入含有NBT和BCIP的混合液染色, 顯影后清洗晾干備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)ZmPHYA1基因植株的獲得及鑒定

將浸染后的莖段在含有草銨膦篩選的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)并形成愈傷, 持續(xù)誘導(dǎo)分化形成塊狀愈傷(圖1-A, B)。持續(xù)誘導(dǎo)形成胚性愈傷后, 部分發(fā)育可得到體細(xì)胞胚(圖1-C), 挑選胚狀體轉(zhuǎn)接誘導(dǎo)分化形成再生植株(圖1-D)。再生株持續(xù)生長一段時(shí)間后, 將其嫁接到預(yù)先種植的健壯棉花幼苗砧木上, 成活后移入花盆中種植(圖1-E)。提取具有草銨膦抗性的候選再生株系的DNA, 擴(kuò)增草銨膦抗性基因。PCR電泳結(jié)果表明, 草銨膦抗性基因目標(biāo)條帶大小為256 bp, 表明抗性植株中該草銨膦抗性基因成功整合到轉(zhuǎn)基因植株中(圖1-F)。

A: 農(nóng)桿菌侵染后的愈傷篩選及誘導(dǎo); B: 愈傷誘導(dǎo)增殖; C: 胚型愈傷分化形成的體細(xì)胞胚胎; D: 再生的幼苗; E: 再生的嫁接植株; F: 部分再生株草銨膦抗性基因的檢測, 其中1、2、4分別為株系Line 9、Line 14和Line 41, 3為非轉(zhuǎn)基因的再生株, “-”為受體對照, “+”為質(zhì)粒陽性擴(kuò)增, M: DNA marker。

A: callus screening and induction of cotton hypocotyl afterinfection;B: callus induction and proliferation; C: somatic embyos formed from embryonic callus; D: regeneration plants; E: survived regenerated graft plants; F: PCR detection of glufosinate-resistance gene in some regenerated plants. Among them, Lane 1, 2 and 4 denote Line 9, Line 14, and Line 41, respectively, 3 denotes the non-transgenic regenerated plant, “-” denotes WT control, and “+” denotes plasmid positive amplification. M: DNA marker.

為了進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)基因株系中的目的基因(圖2), 生育中期, 先利用草銨膦除草劑分別涂抹植株的幼嫩葉片進(jìn)行抗性檢測, 結(jié)果顯示: 抗性植株的葉片顏色正常, 表現(xiàn)為明顯的抗性(圖2-A~B), 而非抗性植株葉片, 則表現(xiàn)為明顯的干枯斑塊(圖2-C)。

對具有草銨膦抗性的再生植株進(jìn)行基因的檢測。研究結(jié)果表明, 共有17個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中可檢測到217 bp長度的基因目標(biāo)條帶, 其中Line 9、Line 14和Line 41共3個(gè)株系的片段大小如圖2-D所示, 表明該基因成功整合到轉(zhuǎn)基因植株中。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株外源基因ZmPHYA1的蛋白表達(dá)檢測

為了檢測株系中外源ZmPHYA1蛋白的表達(dá), 我們分別提取受體R15和轉(zhuǎn)基因株系中Line 9、Line 14、Line 41株系幼嫩葉片總蛋白進(jìn)行分析, 利用ZmPHYA1融合標(biāo)簽蛋白Myc的特異抗體進(jìn)行免疫印跡雜交, 結(jié)果表明, 在轉(zhuǎn)基因株系Line 9、Line 14和Line 41中能夠檢測到約170 kD左右的條帶, 而對照R15和分離出的非抗植株中無目的條帶(圖3-A)。該結(jié)果表明,基因在Line 9、Line 14和Line 41株系中能夠正常表達(dá)。我們同時(shí)在不同組織中檢測了以上株系中ZmPHYA1的表達(dá)。免疫印跡結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)基因Line 9株系的葉、花和莖中, ZmPHYA1均能正常表達(dá)(圖3-B)。

A, B: 抗除草劑檢測的不同陽性植株后代; C: 分離的非抗性植株后代; D: 部分抗性植株的基因的PCR檢測, 其中“+”為質(zhì)粒陽性擴(kuò)增, 1和2為Line 9株系的不同后代單株, 3和4為Line 14株系的不同后代單株, 5和6為Line 41株系的不同后代單株?！?”為受體對照; M: DNA marker。

A, B: different positive plant offspring detected for herbicide resistance; C: isolated offspring of non-resistant plants; D: PCR detection ofin some resistant plants. Among them, “+” denotes plasmid positive amplification, 1 and 2 denote single progeny plant of Line 9, 3 and 4 denote single progeny plant of Line 14, 5 and 6 denote single progeny plant of Line 41. “-” denotes WT; M: DNA marker.

2.3 轉(zhuǎn)基因植株不同農(nóng)藝性狀的分析

為了分析對棉花農(nóng)藝性狀的影響, 我們考察了轉(zhuǎn)基因植株的株高、單鈴籽棉重、衣分和纖維長度(圖4)。統(tǒng)計(jì)分析表明, 對照的株高測定平均值為112 cm, 轉(zhuǎn)基因株系Line 9、Line 14和Line 41的株高平均值依次為105、103和104 cm, 明顯低于對照植株。

而對照株、Line 9、Line 14和Line 41的單鈴籽棉重平均值依次為5.6、5.4、5.1和5.1 g; 衣分平均值依次為31.1%、31.5%、34.4%和33.9%; 纖維長度依次為2.93、2.96、2.92和2.99 cm, 分析可知, 單鈴籽棉重、衣分、纖維長度性狀差異不顯著。綜合以上結(jié)果分析表明: 過表達(dá)基因可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系株高明顯降低, 但對單鈴籽棉、衣分和纖維長影響不明顯。

3 討論

雖然棉花是全世界重要的經(jīng)濟(jì)作物之一, 但是近年來, 由于用工投入多和經(jīng)濟(jì)效益低等原因, 棉花種植面積不斷減少。持續(xù)培育棉花優(yōu)良品種和提升栽培技術(shù)是保證我國棉花的自給水平和穩(wěn)定棉花種植面積的有效措施。草銨膦抗性基因和()等基因在轉(zhuǎn)基因植株中分別表現(xiàn)出對草銨膦和草甘膦除草劑極好的抗性[21-25]。創(chuàng)制抗草銨膦的棉花種質(zhì)資源可以提高雜草防治效率, 從而達(dá)到生產(chǎn)簡化、降低人力投入和提高雜草防治效率等目的[21]。

M: 蛋白marker; WT: 轉(zhuǎn)基因棉花受體R15; Isolated non-transgenic line: 轉(zhuǎn)基因株系分離的非抗性株; #9、#14、#41分別為轉(zhuǎn)外源基因的不同株系Line 9、Line 14和Line 41?！?”為檢測中利用轉(zhuǎn)玉米中同源基因(3393 bp)的陽性棉花植株。

M: protein markers; WT: transgenic cotton receptor R15; non-transgenic line: non-resistant plants isolated from transgenic lines. Lane #9, #14, #41 represent Line 9, Line 14 and Line 41 of transformed exogenousgene plants. “+” is positive cotton plant using the homologous gene(3393 bp) in the transformed maize.

在本研究中, 我們成功獲得了具有草銨膦抗性的轉(zhuǎn)基因棉花。通過分析其過程觀測發(fā)現(xiàn), 草銨膦篩選的愈傷誘導(dǎo)生長速度比使用卡那霉素篩選生長較慢, 相對試驗(yàn)周期較長, 但篩選誘導(dǎo)的陽性比率較優(yōu)于卡那霉素篩選。另在幼苗期結(jié)合PCR檢測和葉片抗性鑒定, 可較早的鑒定出陽性轉(zhuǎn)化植株, 便于后續(xù)的管理。因此, 本試驗(yàn)在T0種子收獲后, 通過抗性鑒定, 后續(xù)種植可較快的鑒定出分離的抗性后代并自交直至純合。因此, 通過對田間抗性鑒定和草銨膦抗性基因PCR檢測二者相互結(jié)合的方式, 可快速的純合陽性植株, 同時(shí), 該選擇過程也可對轉(zhuǎn)基因材料的抗草銨膦特性保持穩(wěn)定。

多年來, 對棉花抗除草劑、抗逆、抗病、高產(chǎn)等性狀相關(guān)的優(yōu)良基因的不斷發(fā)掘,以及不同棉花基因組的測序完成, 極大的豐富了棉花分子遺傳育種的理論依據(jù)[8,25-26], 為持續(xù)改良棉花種質(zhì)資源的有利農(nóng)藝性狀提供研究基礎(chǔ)。光敏色素是與色素蛋白相關(guān)的一類蛋白, 在植物中過量表達(dá)基因能夠引起多效作用, 如矮化、色素增加和延遲葉片衰老等。在不同作物中過表達(dá)基因證實(shí), 其能夠影響植物株高、籽粒產(chǎn)量等性狀[13,15-17]。本研究中, 通過DNA水平和蛋白水平檢測, 表明基因穩(wěn)定插入棉花中, 可正常翻譯成預(yù)期蛋白。選取其中1個(gè)材料進(jìn)行不同組織的蛋白表達(dá)分析, 該蛋白可以在轉(zhuǎn)基因植株的不同組織部位進(jìn)行表達(dá), 預(yù)示其可能在轉(zhuǎn)基因株系中的不同組織均發(fā)揮一定的作用。另外, 預(yù)測蛋白大小約為140 kD, 但從圖3中可以看到實(shí)際蛋白條帶約170 kD,大于預(yù)期預(yù)測, 分析可能是蛋白翻譯后修飾等原因?qū)е路肿恿孔兇? 所以雜交條帶大于預(yù)期蛋白。而本研究中轉(zhuǎn)基因植株株高測定表明, 過表達(dá)能夠引起棉花株高的降低,引起該表型相關(guān)的分子機(jī)制需要做進(jìn)一步研究。

A: 轉(zhuǎn)基因株系的株高表型, 標(biāo)尺為10 cm; B依次為WT、#9 (Line 9), #14 (Line 14), #41 (Line 41)株系纖維長度圖, 標(biāo)尺為1 cm; C、D、E和F分別為WT、#9 (Line 9)、#14 (Line 14)、#41 (Line 41)的株系平均株高、平均單鈴籽棉重、衣分以及纖維長度。*表示< 0.05差異顯著。

A: plant height phenotype of transgenic lines, Bar = 10 cm; B is the fiber length diagram of Line 9, Line 14 and Line 41, respectively, Bar = 1 cm. Histogram of C, D, E, and F represent the plant height, average weight of single boll seed cotton, lint percentage and fiber length of control (WT), Line 9, Line 14, and Line 41 lines, respectively.*indicates significant differences at< 0.05.

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Transformation and molecular identification of maize phytochromegene () in cotton

MA Yan-Bin1,**,WANG Xia2,**,LI Huan-Li1,WANG Pin3, ZHANG Jian-Cheng1, WEN Jin1, WANG Xin-Sheng1, SONG Mei-Fang3, WU Xia1,*, and YANG Jian-Ping4,*

1Institute of Cotton Research, Shanxi Agricultural University(Shanxi Academy of Agricultural Sciences), Yuncheng 044000, Shanxi, China;2Department of Life Science, Yuncheng University, Yuncheng 044000, Shanxi, China;3Beijing Radiation Center, Beijing 100875, China;4College of Agronomy, Henan Agriculture University, Zhengzhou 450002, Henan, China

In order to evaluate the potential value of maizegene () in the improvement of cotton germplasm resources, we transferred it into upland cotton (L.) R15-mediated transformation with glufosinate-resistancegene as selection marker. The regeneratedcotton plants were obtained through callus induction, antibiotic resistance screeningand differentiation induction. After screening the regenerated plants by the herbicide glufosinate ammonium in the field,PCR detection confirmed that both the target bands, including 256 bp of the glufosinate geneand 217 bp band ofgene,were detected in the homozygous transgenic plants. In addition, the exogenous ZmPHYA1 protein of about 170 kDwas also checked by immuno-blot inthree transgenic cotton lines. The results showed that the specific proteins could be detected in different tissues, including leaves, flowers and stems in the transgenic Line 9. The plant height of transgenic Line 9, Line 14, Line 41 were significantly shorter than that of the wild type, while the differences of other yield-related agronomic traits were not observed between the transgenic lines and the wild type.In this study, new cotton germplasms with glufosinate resistance andgene were successfully obtained, which provided a material source for further utilization of phytochrome gene to innovate germplasm resources.

; maize phytochrome; protein expression; glufosinate resistance

10.3724/SP.J.1006.2021.03037

本研究由山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題(201703D211007-3), 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201253, 31871709), 國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2016ZX08010-003), 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃(YGJPY2007)和運(yùn)城學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(YQ-2017 008)資助。

This study was supported by the Shanxi Province Key Research and Development Program (201703D211007-3), the National Natural Science Foundation of China (31201253, 31871709), the National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08010-003), the Basic Research Program of Agricultural Sciences of Shanxi Academy (YGJPY2007), and the Doctoral Research Project of Yuncheng College (YQ-2017008).

楊建平, E-mail: jpyang@henau.edu.cn; 吳霞, E-mail: wuxiab8270@126.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

馬燕斌,E-mail: myb0517@163.com

2020-06-15;

2020-11-13;

2020-12-28.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201228.0846.002.html