醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣相色譜-離子遷移譜分析

楊曉璇，李 陽，馬 寧，管 蕊，王 駿，胡 梅，宿書芳，耿 越*

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品營養(yǎng)和安全重點實驗室山東省動物抗性生物學(xué)重點實驗室，山東濟南 250014；2.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南 250101）

醬油是起源于我國的一種傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，早期的醬油由醬演變而來，從周朝就有記載[1]。醬油是我國最為常見、使用范圍最廣的調(diào)味品之一，也是東南亞國家和歐美國家廣受歡迎的調(diào)味品[2]。醬油的主要原料有大豆、豆粕、面粉、小麥、麩皮等，經(jīng)過微生物發(fā)酵作用和代謝產(chǎn)物間互相作用等一系列復(fù)雜反應(yīng)最終形成液體醬油[3-4]。與國外尤其是日本相比，我國對醬油風(fēng)味的研究仍有一定的差距，因此研究我國醬油風(fēng)味物質(zhì)并不斷完善醬油風(fēng)味體系是非常必要的[5]。

目前在我國鄉(xiāng)村，不采取密封包裝方式就進行售賣的散裝醬油仍然較為常見。散裝醬油常常由于生產(chǎn)廠家使用劣質(zhì)原輔料、生產(chǎn)工藝落后、衛(wèi)生條件差等原因而導(dǎo)致質(zhì)量檢測合格率較低[6]，且散裝醬油在運輸和銷售過程中長時間暴露于空氣中，容易受到污染致使品質(zhì)下降，造成檢驗不合格[7-8]。過去一些關(guān)于散裝醬油品質(zhì)的報道都是針對細菌總數(shù)、總酸、重金屬含量等衛(wèi)生指標，而散裝醬油與市售品牌醬油的風(fēng)味是否具有差異仍然未知。

目前研究醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS），檢測中通常升溫到200 ℃以上，會對醬油中一些熱不穩(wěn)定物質(zhì)造成破壞，因而檢測結(jié)果可能與揮發(fā)性物質(zhì)在醬油中分布的真實情況有偏差。此外，檢測前需要對樣品進行預(yù)處理以富集揮發(fā)性成分，萃取過程不僅步驟復(fù)雜繁瑣而且耗時較長，通常要經(jīng)過幾十分鐘甚至幾小時的萃取才能進樣檢測。

氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一種近些年來新興的氣相分離檢測技術(shù)，結(jié)合了氣相色譜分離能力強和離子遷移譜響應(yīng)快、鑒別能力強的優(yōu)點，適用于痕量檢測揮發(fā)性物質(zhì)[9]，已在毒品檢測[10]、疾病監(jiān)測[11]、環(huán)境保護[12]、食品風(fēng)味分析[13-14]等方面廣泛應(yīng)用。GC-IMS具有檢測限低（低至ng/kg級）、選擇性好、分析時間短、可在常壓下操作、無需樣品前處理、操作簡單等一系列優(yōu)點。在食品風(fēng)味檢測應(yīng)用中，GC-IMS檢測溫度較低，能夠保護一些熱不穩(wěn)定物質(zhì)免受破壞，因此可以更加真實的呈現(xiàn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在食品中的分布情況。其次，相較于GC-MS，GC-IMS技術(shù)樣品的孵育和進樣之間全自動無縫銜接，大大節(jié)省了時間和人力。

本研究利用GC-IMS對市售品牌醬油和散裝醬油樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行檢測，根據(jù)揮發(fā)性成分指紋圖譜，利用多元統(tǒng)計法分析散裝醬油與品牌醬油的差異和散裝醬油與不同等級品牌醬油的差異，旨在為醬油風(fēng)味檢測提供新思路，對醬油風(fēng)味改良和工藝優(yōu)化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究使用的品牌醬油樣品共21個：均由山東省食品藥品檢驗研究院在市場采購獲得，品牌分別有欣和味達美（XHWDM6919、XHWDM7486）、巧媳婦（QXF6920、QXF7399、QXF8105、QXF7613）、嘉和（JH6996、JH8154）、廚邦（CB7774）、東古（DG6922、DG8420）、加加（JJ8434）、德馨齋（DXZ8662）、好太太（HTT7021、HTT7028）、海天（HT8095、HT7561、HT8415）、魯花（LH8374）、燈塔（DT7095、DT7183），其中特級醬油有5個，一級醬油有2個，二級醬油有1個，三級醬油有13個；散裝樣品共3個：分別采自山東三個鄉(xiāng)村糧油店，編號為SZ1、SZ2、SZ3。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

樣品密閉存放于常溫條件下，檢測前每個樣品取1 mL置于20 mL頂空瓶中，密封后上機。儀器自動在40 ℃條件下對樣品進行10 min的孵育，然后進樣。

1.3.2 儀器條件

自動頂空進樣條件：孵化溫度40 ℃；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；孵育時間10 min；進樣針溫度45 ℃；進樣體積500 μL。

氣相色譜條件：載氣為高純氮氣（N2）（純度≥99.999%）；柱溫為60 ℃；分析時間為30 min。

離子遷移譜條件：離子源為氚源（6.5 keV）；漂移氣為高純氮氣（N2）（純度≥99.999%）；漂移氣流量為150 mL/min；模式為正離子模式；漂移管溫度為45 ℃；電場強度為500 V/cm；漂移管長度為9.8 cm。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

GC-IMS的數(shù)據(jù)利用儀器自帶的軟件和插件進行處理，使用LAV（Laboratory Analytical Viewer）軟件用于查看醬油樣品的分析譜圖，樣品中檢出的揮發(fā)性有機物以色點的形式在圖上呈現(xiàn)出來；Reporter插件，用于對比樣品之間的二維圖譜差異和三維圖譜差異；Gallery Plot插件，用于制作揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜，以對比不同樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的差異。GC-IMS Library Search軟件內(nèi)置美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫和管理信息系統(tǒng)（information management system，IMS）數(shù)據(jù)庫，通過搜索數(shù)據(jù)庫完成對揮發(fā)性物質(zhì)的定性分析，并生成指紋圖譜對比，對樣品風(fēng)味物質(zhì)進行正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least square method-discriminant analysis，OPLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油的離子遷移譜分析

部分醬油樣品的GC-IMS分析三維圖譜見圖1。由圖1可知，初步看出品牌醬油樣品之間雖略有區(qū)別但較為相似，而品牌醬油與散裝醬油之間具有一定的差異，一些信號峰普遍在品牌醬油中峰體積較大，也有某些信號峰在散裝樣品中峰體積較大。

圖1 部分醬油樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-IMS三維圖譜Fig.1 GC-IMS three-dimensional spectrogram of volatile flavor compounds in some soy sauce samples

與三維圖譜相對應(yīng)的二維俯視圖見圖2。由圖2可知，色點為白色或接近底色（藍色）時表示物質(zhì)的濃度較低，紅色表示物質(zhì)濃度較高，顏色越深代表濃度越高?？梢郧宄乜吹?，品牌醬油之間信號峰的位置和強度比較相似，而品牌醬油和散裝醬油樣品之間的差異非常明顯，差異大的信號峰主要存在于保留時間在100～200 s和遷移時間（歸一化處理）在1.0～1.5的范圍內(nèi)。

圖2 部分醬油樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-IMS二維圖譜Fig.2 GC-IMS two-dimensional spectrogram of volatile flavor compounds in some soy sauce samples

使用Gallery Plot插件截取代表揮發(fā)性物質(zhì)的色點，繪制出各樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜見圖3。由圖3可知，圖中綠色框內(nèi)的物質(zhì)為品牌醬油樣品中普遍存在的揮發(fā)性物質(zhì)，這些物質(zhì)在幾乎所有的品牌醬油中都有一定量分布；紅色框表示散裝醬油的特征性風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)幾乎只在散裝樣品組中大量檢出，而在品牌醬油樣品中幾乎不存在或檢出量很低；黃色框中的物質(zhì)為造成不同的品牌醬油樣品之間差異的風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)在不同的品牌醬油樣品之間分部差異較大，而在散裝樣品中幾乎不存在或檢出量很低。

圖3 醬油樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜Fig.3 Fingerprint spectrum of volatile flavor compounds in soy sauce samples

在醬油樣品中共檢測到72種揮發(fā)性組分，經(jīng)過與NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫比對后29種組分得到定性，按照圖3從左至右的順序，綠色框中的物質(zhì)為：苯乙醛、丙醛、5-甲基-2-呋喃甲醇、2,3-丁二酮、5-甲基糠醛（單體）、丁醛、乙醇、5-甲基糠醛（二聚體）、乙酸乙酯、丙酮、戊酸、2-丁酮；紅色框中的物質(zhì)為：糠醛（單體）、己醛、3-甲硫基丙醛（單體）、2-乙?；秽ǘ垠w）、糠醛（二聚體）、3-甲硫基丙醛（二聚體）、檸檬烯（單體）、檸檬烯（二聚體）、3-羥基-2-丁酮、異戊醛；黃色框中的物質(zhì)為：2-乙?；秽▎误w）、乙二醇單丁醚、乳酸乙酯、乙酸異戊酯、苯甲醛、2-庚酮、丙酸乙酯。

仔細比較品牌醬油和散裝醬油的揮發(fā)性化合物之間的差別發(fā)現(xiàn)，品牌醬油普遍含有的物質(zhì)（綠色框）并非全部都在散裝樣品里普遍存在，如丙醛（propanal）、5-甲基-2-呋喃甲醇（5-methyl-2-furanmethanol）、46號、56號、34號物質(zhì)在散裝樣品中含量很低或幾乎不存在。一些幾乎只在散裝樣品中大量檢出的物質(zhì)（紅色框）在品牌醬油中普遍含量很低，但三個散裝醬油樣品之間也各有差異，如己醛（hexanal）、70號物質(zhì)只在SZ3樣品大量檢出，3-甲硫基丙醛（3-methylthiopropanal）、檸檬烯單體和二聚體（limonene）只在SZ2樣品大量檢出，異戊醛（3-methylbutanal）只在SZ1樣品中大量檢出。黃色框內(nèi)的物質(zhì)在各個品牌樣品之間分布差異很大，可能為某一個或幾個品牌醬油的特征性風(fēng)味物質(zhì)，在其他品牌中不具代表性。

將品牌醬油按等級分類后分別與散裝醬油進行對比，醬油樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜分別見圖4和圖5。由圖4可知，5個特級醬油樣品分別來自5個不同的品牌，組內(nèi)差異較大，而與散裝醬油比較組間差異較小，綠色框內(nèi)許多物質(zhì)在各特級醬油樣品中的含量差異大，如丙醛、5-甲基糠醛（5-methylfurfurar）、乙酸乙酯（ethyl acetate）、丙酮（acetone）、2-丁酮（2-butanone）、56號、32號、64號化合物等，紅色框物質(zhì)只在散裝組大量檢出，黃色框的物質(zhì)主要分布于某個或某幾個樣品。由圖5可知，三級醬油和散裝醬油之間的差異明顯，與品牌醬油和散裝醬油間的差異相似，綠色框內(nèi)的物質(zhì)在三級醬油中分布較為普遍，而其中某些物質(zhì)在散裝醬油中含量甚微，紅色框的物質(zhì)幾乎只在散裝組大量檢出，黃色框的物質(zhì)主要分布于某個或某幾個樣品。

圖4 特級和散裝醬油樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜Fig.4 Fingerprint spectrum of volatile flavor compounds in premium grade and bulk soy sauce samples

圖5 三級和散裝醬油樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜Fig.5 Fingerprint spectrum of volatile flavor compounds in grade 3 and bulk soy sauce samples

2.2 醬油中主要的風(fēng)味物質(zhì)

散裝醬油樣品采自農(nóng)村的糧油店，多為小工廠或小作坊制得，其風(fēng)味可能與品牌醬油產(chǎn)品之間存在差異。品牌醬油樣品由規(guī)范化的企業(yè)和工廠生產(chǎn)，在原料挑選、生產(chǎn)操作、包裝銷售等過程把控嚴格，其品質(zhì)相對比較穩(wěn)定。選取品牌醬油樣品來分析醬油中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

根據(jù)圖3顯示的結(jié)果，選取綠色框中的總共20種物質(zhì)作為合格醬油產(chǎn)品的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)在所有或大多數(shù)品牌醬油樣品中檢出較多，在不同品牌樣品之間含量差別不大，是合格的醬油產(chǎn)品中不可或缺的非常重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。醬油中主要的揮發(fā)性物質(zhì)詳細信息見表1。這20種組分中一共有12種組分被定性，除去同種物質(zhì)的二聚體共11種揮發(fā)性化合物。由表1可知，醛類化合物有3種，分別為苯乙醛、丙醛和丁醛；醇類化合物僅有乙醇1種；酯類化合物僅有乙酸乙酯1種；有機酸僅有戊酸1種；酮類化合物有3種，分別為2,3-丁二酮、丙酮和2-丁酮；雜環(huán)類化合物有2種，分別為5-甲基-2-呋喃甲醇和5-甲基糠醛。

表1 醬油中主要的揮發(fā)性物質(zhì)詳細信息Table1 Detailed information of main volatile substances in soy sauce

醬油中的醛類物質(zhì)是淀粉質(zhì)原料被酶解產(chǎn)生的葡萄糖經(jīng)過醛酸途徑產(chǎn)生，氣味辛辣刺激，主要起調(diào)和香氣的作用[20]，苯乙醛、丙醛、丁醛為醬油提供焦糖香、可可香、咖啡香等氣味[15]。醇類物質(zhì)被認為是醬油中含量最高的一類風(fēng)味成分，是成酯的基礎(chǔ)，其中含量最高的為乙醇，為醬油提供醇和的酒香味[17]。酯類物質(zhì)是醬油中的基礎(chǔ)香氣成分之一，由有機酸和醇類酯化生成，能使醬油氣味更加醇厚，其中乙酸乙酯是醬油中酯類的代表之一，能夠使醬油香氣更加醇和[17]。醬油中的有機酸不但可以提供香氣還起到呈味作用，為醬油提供酸味和緩和咸味，除此之外，有機酸還能與醇類物質(zhì)成酯，增加醬油中的酯香[21]。醬油中的酮類化合物本身不是風(fēng)味物質(zhì)，但少量羰基化合物可提供果香和焦糖香[20]。雜環(huán)化合物對醬油風(fēng)味的貢獻很大，在醬油中呋喃類的雜環(huán)化合物含量較多[22]，5-甲基-2-呋喃甲醇和5-甲基糠醛等雜環(huán)化合物主要提供焦糖香和焙烤香氣[16]。這些醬油中主要的揮發(fā)性成分相互調(diào)和，為醬油提供了醇厚的基礎(chǔ)香味。

李俊剛等[23]采用同時蒸餾法萃取4種品牌高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中的揮發(fā)性成分并使用GC-MS進行分析，在4種醬油中鑒定出較多的醛酮類、醇類、雜環(huán)類化合物。與李俊剛等[23]的研究結(jié)果相似，本研究在品牌醬油中找到的主要揮發(fā)性物質(zhì)中也有很多為醛酮類和雜環(huán)類物質(zhì)，僅鑒定出1種醇類。除此之外，4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-ethylguaiacol，4-EG）、2-乙基-4-羥基-5-甲基-3（2H）呋喃酮（2-ethyl-4-hydroxy-5-methyl-3（2H）furanone，HEMF）、4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2,5-dimethyl-3（2H）furanone，HDMF）等物質(zhì)在許多文獻中被認為是醬油的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[5，24]，在本研究中并未鑒定出。在采用GC-MS分析醬油中風(fēng)味物質(zhì)的研究中，由于采取的萃取方法以及醬油樣品種類不同，檢測到的物質(zhì)種類和含量各有差異[25-26]。

相比之下，一些重要揮發(fā)性物質(zhì)在散裝樣品（SZ1、SZ2、SZ3）中含量明顯低于品牌醬油或幾乎不存在，如丙醛、5-甲基-2-呋喃甲醇、48號、56號和34號化合物。這表明散裝樣品中缺失了一些合格醬油所需要具備的重要的風(fēng)味物質(zhì)，可能會導(dǎo)致散裝醬油在風(fēng)味方面的感官體驗不如市售品牌醬油。

值得注意的是，在散裝醬油與其他品牌醬油的比較中，3個散裝醬油樣品（SZ1、SZ2、SZ3）均顯示出較高的糠醛（furfural）含量?？啡┚哂刑鹣恪⒛鞠?、焦糖香氣、烘烤香氣，食品中的糠醛通常產(chǎn)生于熱加工或發(fā)酵過程[27]。在白酒的釀造中使用谷皮、玉米芯、麩糠等原料可以產(chǎn)生更多糠醛，工業(yè)上多使用玉米芯等含有豐富半纖維素的原料生產(chǎn)糠醛，食品中一定量的糠醛可以帶來特殊香氣，但含量過高會對身體多個臟器產(chǎn)生不良影響[28-29]。散裝醬油樣品可能使用了較多的麥麩、麩皮等原料，原料成本雖然較低，但產(chǎn)生過多的糠醛可能影響散裝醬油的安全性。

2.3 多元統(tǒng)計分析

進一步利用多元統(tǒng)計分析散裝醬油和品牌醬油的風(fēng)味差異。醬油樣品揮發(fā)性組分的主成分分析（principal component analysis，PCA）得分圖見圖6A。由圖6A可知，散裝醬油樣品和品牌醬油樣品之間得到很好的區(qū)分，同時品牌醬油內(nèi)部也存在一定差異，尤其是燈塔牌樣品（DT7095、DT7183）與其他品牌樣品之間。OPLS-DA得分圖見圖6B。由圖6B可知，OPLS-DA得分區(qū)分結(jié)果更明顯，表明品牌醬油和散裝醬油風(fēng)味物質(zhì)之間的差異非常顯著。OPLS-DA載荷雙標圖見圖6C。由圖6C可知，大部分物質(zhì)聚集于品牌醬油一側(cè)，僅有少量物質(zhì)分布于散裝樣品一側(cè)，表明絕大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在品牌醬油中含量高于散裝醬油，散裝醬油的香氣不如品牌醬油濃郁。

PCA和OPLS-DA顯示的結(jié)果與GC-IMS的風(fēng)味指紋圖譜顯示的結(jié)果基本一致。基于GC-IMS數(shù)據(jù)的PCA和OPLS-DA分析都顯示，散裝醬油樣品和品牌醬油樣品的風(fēng)味之間具有顯著的差異，也表明GC-IMS應(yīng)用于醬油風(fēng)味檢測和鑒別具有可行性。

圖6 醬油樣品揮發(fā)性化合物的多元統(tǒng)計分析Fig.6 Multivariate statistical analysis of volatile compounds in soy sauce samples

特級醬油和散裝醬油樣品的多元統(tǒng)計分析結(jié)果見圖7。由圖7可知，PCA和OPLS-DA都可將特級醬油和散裝醬油分開，但分布相對較分散，與圖4風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜的結(jié)果相似。

圖7 特級和散裝醬油樣品揮發(fā)性化合物的多元統(tǒng)計分析Fig.7 Multivariate statistical analysis of volatile compounds in premium grade and bulk soy sauce samples

三級醬油和散裝醬油樣品的多元統(tǒng)計分析結(jié)果見圖8。由圖8可知，PCA和OPLS-DA處理兩組醬油分組明顯，尤其是OPLS-DA可以很好的區(qū)分。雖然三級醬油組內(nèi)具有一定差異，但兩組之間的差異仍很顯著，與圖5風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜的結(jié)果一致。

無論是所有品牌醬油與散裝醬油比較還是不同等級的品牌醬油與散裝醬油比較，均顯示出有差異。綜合來看，品牌醬油與散裝醬油之間具有非常明顯的差異，也印證了散裝樣品生產(chǎn)、儲存、銷售中的不確定性會導(dǎo)致其與合格品牌醬油產(chǎn)品的風(fēng)味存在差異的猜想，結(jié)果表明GC-IMS結(jié)合多元統(tǒng)計分析可以應(yīng)用于分析不同醬油的差異，GC-IMS在醬油風(fēng)味分析檢測具有廣闊應(yīng)用前景。

圖8 三級和散裝醬油樣品揮發(fā)性化合物的多元統(tǒng)計分析Fig.8 Multivariate statistical analysis of volatile compounds in grade 3 and bulk soy sauce samples

3 結(jié)論

本研究使用GC-IMS技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法分析了散裝醬油和品牌醬油的差異。結(jié)果顯示雖然品牌醬油內(nèi)部存在一定的差異，但是散裝醬油與品牌醬油之間存在更為明顯的差異，品牌醬油中主要的風(fēng)味物質(zhì)有苯乙醛、丙醛、5-甲基-2-呋喃甲醇、2,3-丁二酮、5-甲基糠醛、乙醇、乙酸乙酯等。

在本研究中GC-IMS技術(shù)能夠很好地呈現(xiàn)出散裝醬油和品牌醬油間的差異甚至不同品牌樣品間的細微差異，表明該技術(shù)在醬油的鑒別和風(fēng)味分析方面具有巨大潛力。