蘋果酵素自然發(fā)酵過程中生物活性物質(zhì)的變化

張海燕，康三江 *，袁 晶，蘇渤海

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省果蔬貯藏加工技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅蘭州 730070；3.咸陽市園藝站，西安咸陽 712000）

食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人來食用的酵素產(chǎn)品[1-2]。其在含有植物本身的多種維生素、酶和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，還通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生新的次生代謝物及活性成分，與直接食用蔬菜水果相比，酵素中的生物活性成分和有機(jī)小分子更為濃縮，而且更容易為人體所吸收[3]。食用植物酵素作為一種功能性微生物發(fā)酵制品因其豐富的營養(yǎng)和顯著的功效多年來盛行于歐美、東南亞、日本以及臺(tái)灣地區(qū)，受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[4]，目前有關(guān)自然發(fā)酵蘋果酵素的研究多以短期發(fā)酵為主，楊小幸等[5]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果酵素發(fā)酵第21天獲得了較高總酚含量與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率；李飛等[6]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵50 d的蘋果酵素的抗氧化活性基本呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。但目前酵素研究由于發(fā)酵周期較短，致使產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，酒精含量容易超標(biāo)，大量研究表明，酵素是時(shí)間的產(chǎn)物，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，產(chǎn)品中的活性物質(zhì)逐漸增加[7-11]，因此，進(jìn)一步闡明蘋果酵素自然發(fā)酵過程中活性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化是很有必要的。本研究以蘋果為原料進(jìn)行自然發(fā)酵，探討蘋果酵素自然發(fā)酵過程中抗氧化成分（總酚、總黃酮、維生素C（vitamin C，VC）、總花青素含量）、功效酶活性（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）以及抗氧化能力（DPPH自由基、·OH、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid，ABTS）自由基清除能力和還原力）等的動(dòng)態(tài)變化，并對(duì)總酚、總黃酮含量、SOD活性與抗氧化能力之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。分析蘋果酵素自然發(fā)酵過程中生物活性物質(zhì)的變化，以期為進(jìn)一步闡明蘋果酵素保健功能機(jī)理和綜合性開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富士蘋果（長富2號(hào)）：采自甘肅省慶陽市有機(jī)蘋果基地；冰糖：市售；福林-酚（Folin-Ciocalteau）、NaCO3、沒食子酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、蘆丁、抗壞血酸（VC）、鹽酸、鹽酸、氫氧化鈉、原花青素、香草醛、甲醇、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、鹽酸、氫氧化鈉、酚酞、DPPH、乙醇、ABTS、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、Tris、鄰苯三酚、淀粉酶試劑盒、鹽酸、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、聚乙烯醇、橄欖油、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、無水硫酸鈉、酒石酸鈉、苯酚、3,5-二硝基水楊酸：中瑞化學(xué)試劑公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)：上海凌析達(dá)儀器有限公司；LRH-70型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-S24數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MIRCOCL 17R離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；MDF-U3386S超低溫冰箱：青島海爾集團(tuán)；DL-CJ-1N超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；PB-10型精密pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果酵素加工工藝流程

蘋果原料選擇→清洗→去核→切分→裝罐→加水、加糖→發(fā)酵→過濾→蘋果酵素

1.3.2 操作要點(diǎn)

新鮮蘋果用純凈水沖洗干凈，瀝干水分后去核并切分成3～5 mm的片，冰糖破碎后用紫外燈輻照處理30 min，將蘋果片與純凈水按料液比200（g∶L）加入無菌酵素發(fā)酵罐中，加入15%的冰糖調(diào)節(jié)糖度，置于陰涼干燥的發(fā)酵車間，在常溫（20～26 ℃）條件下自然發(fā)酵30 d后，濾去果肉，繼續(xù)發(fā)酵至90 d，發(fā)酵第一個(gè)月隔天攪拌通氣，之后密封發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束即得蘋果酵素，取上清液進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.3 分析檢測(cè)

（1）生物活性成分測(cè)定

總酚含量參照張靜雯[12]的方法；總黃酮含量、VC含量以及總花青素含量參照李杰等[13]的方法。蘋果酵素中生物活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 蘋果酵素生物活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 1 Regression equations of standard curves of bioactive components in apple Jiaosu

（2）功效酶活性

SOD活性的測(cè)定參照國標(biāo)GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性》；纖維素酶活性的測(cè)定參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 912—2004《纖維素酶活力的測(cè)定-分光光度計(jì)法》；蛋白酶活性的測(cè)定參照商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》；淀粉酶活性的測(cè)定參照淀粉酶試劑盒內(nèi)說明書；脂肪酶活性的測(cè)定參照國標(biāo)GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中的電位滴定法。

（3）抗氧化能力

DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羥基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、還原力的測(cè)定參考樊秋元[14]的方法。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果酵素自然發(fā)酵過程中生物活性成分的變化

蘋果酵素中存在總酚、總黃酮、VC和總花青素等主要生物活性成分，但含量較核桃青皮果蔬、葡萄、生姜等酵素中低[15-17]。蘋果酵素自然發(fā)酵過程中總酚、總黃酮、VC和總花青素的變化結(jié)果見圖1。

圖1 蘋果酵素自然發(fā)酵過程中生物活性成分的變化Fig.1 Changes of bioactive components during natural fermentation process of apple Jiaosu

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，總酚含量的變化呈先升高后降低趨勢(shì)，發(fā)酵0～60 d時(shí)總酚含量從0.17 mg/mL升高至1.16 mg/mL，隨后出現(xiàn)降低趨勢(shì)，這可能是由于部分酚類物質(zhì)與發(fā)酵后期發(fā)酵液中產(chǎn)生的有機(jī)酸結(jié)合，生成酚酸類物質(zhì)，引起總酚含量的降低[18]；隨著發(fā)酵時(shí)間在0～90 d的延長逐漸升高，總黃酮的含量從0.05 mg/mL增加至0.45 mg/mL，且發(fā)酵第1個(gè)月增加較第2個(gè)月緩慢，并于發(fā)酵60 d后緩慢增加或趨于穩(wěn)定，這可能與發(fā)酵體系中微生物的多樣性有關(guān)[19]；VC和總花青素的含量在整個(gè)發(fā)酵過程中變化不大，分別基本保持在0.05 mg/mL和0.01 mg/mL的水平。表明蘋果酵素中VC和總花青素主要來源于原料中。

2.2 蘋果酵素自然發(fā)酵過程中功效酶活性的變化

蘋果酵素自然發(fā)酵過程中功效酶活性的變化結(jié)果見圖2。由圖2可知，蘋果酵素中存在SOD、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等功效酶，且5種酶的活性均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈逐漸升高趨勢(shì)，并基本于發(fā)酵60 d后緩慢增加或趨于穩(wěn)定，其中SOD和纖維素酶的含量較高，發(fā)酵90 d時(shí)分別從發(fā)酵初期的9.63 U/mL和6.00 U/mL升高至42.12 U/mL和23.34 U/mL，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的含量較低，發(fā)酵初期分別為1.01 U/mL、0.81 U/mL和0.27 U/mL，發(fā)酵90 d時(shí)分別達(dá)到10.03 U/mL、6.15 U/mL和2.14 U/mL。結(jié)果表明，通過微生物發(fā)酵，可提高酵素產(chǎn)品發(fā)酵液中SOD、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等功效酶的活力[20]。

圖2 蘋果酵素自然發(fā)酵過程中功效酶的變化Fig.2 Changes of functional enzyme activity during natural fermentation process of apple Jiaosu

2.3 蘋果酵素自然發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化

蘋果酵素自然發(fā)酵過程中自由基清除率的變化結(jié)果見圖3。由圖3可知，DPPH·、O2·、·OH、ABTS·清除率和還原力在蘋果酵素發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化規(guī)律大體較為一致，DPPH自由基清除率和·OH清除率發(fā)酵前60 d逐漸上升，60 d后趨于穩(wěn)定，發(fā)酵60 d時(shí)的自由基清除率分別從發(fā)酵初期的47.82%和43.05%上升至85.29%和78.85%；O2·清除率、ABTS自由基清除率和還原力呈現(xiàn)發(fā)酵前75 d逐漸上升達(dá)到峰值、75 d后略有下降的趨勢(shì)，發(fā)酵75 d時(shí)的自由基清除率分別為65.06%、59.04%和1.93（OD700nm值）。表明發(fā)酵60～75 d時(shí)的蘋果酵素的抗氧化活性較好，這可能與此時(shí)酵素中總酚、總黃酮含量較高有關(guān)系[21]。

圖3 蘋果酵素自然發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化Fig.3 Changes of antioxidant capacity during natural fermentation process of apple Jiaosu

2.4 蘋果酵素中總酚、總黃酮、SOD活性與抗氧化能力的相關(guān)性

酵素發(fā)酵技術(shù)通過復(fù)雜的物質(zhì)代謝，不僅可以改善果蔬原料原有的一些不良風(fēng)味，還可以產(chǎn)生一些新的生物活性成分，增加酵素食品的風(fēng)味、口感及功效，提高產(chǎn)品抗氧化能力[22]，酵素富含的多酚、黃酮以及功效酶等物質(zhì)能夠有效清除機(jī)體內(nèi)自由基[23]。選擇蘋果酵素自然發(fā)酵過程中含量較高的抗氧化成分總酚、總黃酮、SOD活性，分析它們與DPPH自由基清除率、O2-·清除率、·OH清除率、ABTS自由基清除率和還原力之間的相關(guān)性，結(jié)果見表2。

表2 蘋果酵素中總酚、總黃酮、超氧化物歧化酶活性與抗氧化能力的相關(guān)性Table 2 Correlation analysis of total phenols,total flavonoids contents,superoxide dismutase activity and antioxidant capacity of apple Jiaosu

由表2可以看出，總酚含量與DPPH·、O2-·、·OH、ABTS·清除能力及還原力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；SOD活性與DPPH·、·OH、ABTS·清除能力及還原力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總酚、總黃酮含量之間相關(guān)性較弱（P＞0.05）；而DPPH自由基、·OH以及ABTS自由基清除能力之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），因此，想要全面評(píng)估蘋果酵素的抗氧化能力，應(yīng)使用多種測(cè)定方法體系[24]；總黃酮含量與自由基清除能力及還原力之間無顯著相關(guān)性，這可能是由于蘋果酵素中總黃酮含量較低的原因，有待于進(jìn)一步研究。說明蘋果酵素抗氧化能力的主要來源是SOD活性。

3 結(jié)論

通過對(duì)蘋果酵素自然發(fā)酵過程中抗氧化成分（總酚、總黃酮、VC、總花青素含量）、功效酶活性（SOD、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）以及抗氧化能力（DPPH·、O2·、·OH、ABTS·清除能力和還原力）的變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，蘋果酵素自然發(fā)酵過程中，除VC、總花青素含量分別基本保持穩(wěn)定以外，其他抗氧化成分、功效酶活性以及抗氧化能力總體呈先升高再趨于穩(wěn)定或略有下降的趨勢(shì)?？偡雍涂傸S酮含量在發(fā)酵60 d時(shí)達(dá)到最高，分別為1.16mg/mL和0.45 mg/mL；SOD、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的活性在發(fā)酵90d時(shí)達(dá)到最高（42.12U/mL、23.34U/mL、10.03 U/mL、6.15 U/mL和2.14 U/mL）；DPPH·、、·OH、ABTS·清除能力和還原力在發(fā)酵60～75 d時(shí)抗氧化活性最高（85.29%、78.85%、65.06%、59.04%和1.93）。同時(shí)，總酚含量與DPPH·、、·OH、ABTS·清除能力及還原力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；SOD活性與DPPH·、·OH、ABTS·清除能力及還原力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明SOD活性是蘋果酵素抗氧化能力的主要來源。