安卡紅曲霉As 3.4811液態(tài)發(fā)酵制備膳食纖維的特性研究

吳學(xué)鳳，陳明鑫，孫聰聰，穆冬冬，陳小舉，田寶東，蔣俊樹，姜紹通，李興江*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230009；2.巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽巢湖 238000；3.匯福糧油泰州公司，江蘇泰州 225300；4.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230051）

我國農(nóng)產(chǎn)品廢渣產(chǎn)量巨大，一般僅作為肥料、飼料使用，或者直接丟棄，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。廢渣中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)如碳源、氮源和礦物質(zhì)等，其中膳食纖維含量豐富，是提取高品質(zhì)膳食纖維的廉價(jià)原料[1]。因此，如何高效、高值利用農(nóng)產(chǎn)品廢渣中的膳食纖維成為了近年來的研究熱點(diǎn)。

膳食纖維（dietary fiber，DF）主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠和樹膠等物質(zhì)組成[2]，分為可溶性膳食纖維（solubledietaryfiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insolubledietary fiber，IDF）。DF具有抗癌、抗氧化、降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病等作用[3-4]。DF的制備方法主要有酸法、堿法、酶法和發(fā)酵法。其中發(fā)酵法是利用微生物降解原料中植酸、大分子多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，以其環(huán)境友好特點(diǎn)備受關(guān)注[5-6]。

紅曲霉是一種非致病性絲狀腐生真菌，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生Monacolin K、紅曲色素、γ-氨基丁酸等功能性物質(zhì)，還有淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等各種酶類[7]。本研究以豆渣、麥麩和梨渣為原料，利用紅曲霉菌發(fā)酵生產(chǎn)集紅曲色素及DF保健功能于一體的紅曲膳食纖維，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，以期為農(nóng)產(chǎn)品廢渣的精深加工和綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

HNY-100Y恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱：恒立國際有限公司；Jeol JSM-6490LV掃描電子顯微鏡：日本電子制造；D/MAX 2500V型X-射線衍射儀：日本電子制造；Thermo Nicolet 67紅外光譜儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；E2695高效液相色譜儀：上海沃特斯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豆渣、麥麩、梨渣膳食纖維的制備

（1）發(fā)酵法：按照參考文獻(xiàn)[8]，采用紅曲霉發(fā)酵法、酶法（對照樣品）制備DF。紅曲霉發(fā)酵豆渣、麥麩、梨渣，分別得到安卡紅曲豆渣SDF（Monascusokara soluble dietary fiber，MOSDF）、紅曲麥麩SDF（Monascuswheat bran soluble dietary fiber，MBSDF）、紅曲梨渣SDF（Monascuspear residue soluble dietary fiber，MPSDF）、紅曲豆渣IDF（Monascusokara insolu ble dietary fiber，MOIDF）、紅曲麥麩IDF（Monascuswheat bran insoluble dietary fiber，MBIDF）和紅曲梨渣IDF（Monascuspear residue insoluble dietary fiber，MPIDF）。將提取的SDF和IDF混合，即得紅曲豆渣膳食纖維（Monascusokara dietary fiber，MODF）、紅曲麥麩膳食纖維（Monascuswheat bran dietary fiber，MBDF）和紅曲梨渣膳食纖維（Monascuspear residue dietary fiber，MPDF）。

（2）酶法：酶法制備的DF作為對照組，分別得到豆渣SDF（okara soluble dietary fiber，OSDF）、麥麩SDF（wheat bran soluble dietary fiber，BSDF）、梨渣SDF（pear residue soluble dietary fiber，PSDF）、豆渣IDF（okara insoluble dietary fiber，OIDF）、麥麩IDF（wheat bran insoluble dietary fiber，BIDF）和梨渣IDF（pear residue insoluble dietary fiber，PIDF）。將提取的SDF和IDF混合，即得豆渣DF（okara dietary fiber，ODF）、麥麩DF（wheat bran dietary fiber，BDF）和梨渣DF（pear residue dietary fiber，PDF）。

1.3.2 X-射線衍射檢測方法

按照參考文獻(xiàn)[9]的方法對OIDF、MOIDF、BIDF、MBIDF、PIDF和MPIDF進(jìn)行衍射圖譜分析。測量條件：18 kW臺(tái)式高頻X射線發(fā)生器旋轉(zhuǎn)靶，管壓40 kV，掃描范圍5～60°，步長0.02°，X衍射線來自于銅。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜檢測方法

早晨，蘇穆武在和票友在唱京劇。蘇穆武唱的是《馬前潑水》朱買臣的一段：走上前來苦哀告，賢妻且把怒氣消……

按照參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行測定。將樣品與溴化鉀粉末混合，在4 000～400 cm-1的波數(shù)區(qū)域內(nèi)讀取光譜，檢測器分辨率為1.0 cm-1。

1.3.4 掃描電子顯微鏡檢測方法

按照參考文獻(xiàn)[11]的方法，使用掃描電子顯微鏡觀察紅曲霉菌絲體和IDF的形態(tài)。將樣品置于導(dǎo)電條上，并通過在真空蒸發(fā)器中連接到濺射涂層的蒸發(fā)器，用細(xì)金層覆蓋。電子顯微鏡設(shè)定為20 kV的電壓。觀察樣品的放大倍數(shù)為500×和1 000×。

1.3.5 紅曲色素的檢測方法

按照參考文獻(xiàn)[12]的方法，以乙醇作為空白對照，利用雙光束紫外可見分光光度計(jì)記錄紅曲霉種子液（Monascusseed broth，MSB）紅曲霉豆渣發(fā)酵液（Monascusokara fermentation broth，MOFB）、紅曲霉麥麩發(fā)酵液（Monascuswheat branfermentationbroth，MBFB）和紅曲霉梨渣發(fā)酵液（Monascuspearresiduefermentationbroth，MPFB）中的紅曲色素在300nm至600 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜，確定光密度值（optical density，OD），將OD值乘以稀釋倍數(shù)即為紅曲色素的色價(jià)。

1.3.6 橘霉素含量的測定[13]

使用C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定橘霉素含量。試驗(yàn)條件：雙二極管陣列檢測器，檢測波長為222 nm，設(shè)定波長為200～500 nm，柱溫為28 ℃，乙腈∶超純水（3∶1，V/V，磷酸調(diào)節(jié)至pH 2.5）作為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，進(jìn)樣時(shí)間為20 min。橘霉素含量計(jì)算公式如下：

式中：C為HPLC測定的MSB、MOFB、MBFB和MPFB中的橘霉素質(zhì)量濃度，mg/L。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用SPSS軟件V19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Duncan檢驗(yàn)，認(rèn)為P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 IDF的結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析

DF的結(jié)晶結(jié)構(gòu)直接影響其物理和化學(xué)性質(zhì)，例如持水性、持油性和膨脹性[14]。由圖1可知，對照組IDF和紅曲霉發(fā)酵樣品IDF在衍射方向21.8°附近均有強(qiáng)衍射峰，豆渣、麥麩和梨渣IDF具有典型的纖維素Ⅰ型晶體結(jié)構(gòu)。X-射線衍射圖譜中的峰越尖表明樣品的結(jié)晶度越高，樣品的拉伸強(qiáng)度和硬度也越大[15]?？瞻讓φ誌DF比紅曲霉發(fā)酵處理的IDF的峰更尖銳，表明紅曲霉發(fā)酵處理降低了豆渣、麥麩和梨渣IDF的結(jié)晶度。紅曲霉發(fā)酵降解農(nóng)產(chǎn)品廢渣中的植酸、大分子多糖、蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，從而使廢渣的完整結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)部結(jié)構(gòu)的暴露促進(jìn)了結(jié)晶區(qū)域中的酶水解是IDF結(jié)晶度降低的主要原因[16]。

圖1 豆渣、麥麩和梨渣不溶性膳食纖維的X-射線衍射圖Fig.1 X-ray diffraction diagrams of insoluble dietary fiber from okara,wheat bran and pear residue

2.2 豆渣、麥麩和梨渣DF紅外光譜分析

2.2.1 豆渣DF的紅外光譜分析結(jié)果

由圖2可知，3 300 cm-1、2 913 cm-1、1 628 cm-1、1 370 cm-1、1 028 cm-1和892 cm-1波數(shù)處的譜帶是纖維素的特征峰，分別對應(yīng)于CH2，C-H，C-O-C，OH，C-C-H和C-O-H振動(dòng)。經(jīng)紅曲霉發(fā)酵后，MOSDF和MOIDF在波數(shù)3 300 cm-1處的譜帶變寬，表明纖維中存在氫鍵[17]，MODF中含水量增加。在波數(shù)1 028 cm-1處的譜帶是DF中低聚糖的吸收峰，而DF中的β-糖苷鍵則引起紅外光譜波數(shù)892 cm-1處的伸縮振動(dòng)[18]，表明發(fā)酵后低聚糖減少，β-糖苷鍵變化不明顯。

圖2 豆渣可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of soluble dietary fiber and insoluble dietary fiber from okara

2.2.2 麥麩DF的紅外光譜分析結(jié)果

由圖3可知，紅曲霉發(fā)酵制備的SDF和IDF與對照相比，峰強(qiáng)度降低，且峰向低波數(shù)移動(dòng)，說明了多糖的降解、纖維素和半纖維素分子內(nèi)氫鍵斷裂。波數(shù)2 924 cm-1的條帶歸因于來自多糖亞甲基的C-H伸縮帶。波數(shù)1 638 cm-1處的峰值是由于木質(zhì)素的芳烴的彎曲或拉伸。MBIDF在該處的峰強(qiáng)度變?nèi)?，說明了木質(zhì)素的降解[19]。BSDF和BIDF在波數(shù)1 050 cm-1處有吸收峰，這是寡糖的吸收峰。MBSDF和MBIDF在該處峰強(qiáng)度增大，說明了發(fā)酵后DF中的多糖大分子降解成小分子糖。

圖3 麥麩可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of soluble dietary fiber and insoluble dietary fiber from wheat bran

2.2.3 梨渣DF的紅外光譜分析結(jié)果

由圖4可知，MPSDF、PSDF、MPIDF和PIDF均具有波數(shù)3 249 cm-1處的寬帶，這歸因于多糖的O-H的伸縮振動(dòng)峰。波數(shù)2 930 cm-1的條帶歸因于來自多糖亞甲基的C-H伸縮振動(dòng)。波數(shù)1 623 cm-1處的峰值是由于木質(zhì)素的芳烴的彎曲或拉伸。MPIDF在該處的峰強(qiáng)度變?nèi)酰f明了木質(zhì)素的降解。在波數(shù)1 233 cm-1附近處的吸收峰是結(jié)晶吸收帶，MPSDF和MPIDF在該處的吸收峰明顯增強(qiáng)。PSDF和PIDF在波數(shù)1 014 cm-1處有吸收峰，這是寡糖的吸收峰，說明PDF中含有吡喃糖環(huán)[20]。

圖4 梨渣可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of soluble dietary fiber and insoluble dietary fiber from pear residue

2.3 微觀結(jié)構(gòu)分析

由5（a）可知，紅曲霉菌絲細(xì)長并且具有透明的管狀結(jié)構(gòu)。這些菌絲相互交織，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由圖5（b）和圖5（c）可以看出，OIDF具有較大的顆粒，松散的片狀結(jié)構(gòu)，波紋表面和致密的結(jié)構(gòu)，從而賦予了膳食纖維良好的持水性，保油性和溶脹性。MOIDF的形狀不規(guī)則，結(jié)構(gòu)疏松多孔，表面更粗糙，同時(shí)呈現(xiàn)出蜂窩狀。MOIDF顆粒的結(jié)構(gòu)比表面積更大，羥基也更多，這與FI-IR光譜結(jié)果一致。從圖5（d）可以看出，BIDF具有規(guī)則的形狀和大小，且纖維表面完整致密。而MBIDF結(jié)構(gòu)疏松，表面突出不規(guī)則，邊緣粗糙且出現(xiàn)大量的微孔，IDF的層狀結(jié)構(gòu)遭到破壞。紅曲霉液態(tài)發(fā)酵處理促進(jìn)了麥麩中IDF表面的破裂和脫離，導(dǎo)致纖維基質(zhì)不連續(xù)且松散，使其暴露出大量的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[21]。從圖5（f）和5（g）可以看出，發(fā)酵法和酶法制備的梨渣IDF結(jié)構(gòu)都受到破壞，無完整纖維顆粒，經(jīng)紅曲霉發(fā)酵處理的IDF表面褶皺和紋路增多。因此，紅曲霉液態(tài)發(fā)酵使豆渣、麥麩和梨渣IDF結(jié)構(gòu)改變，比表面積和結(jié)構(gòu)孔隙率增大，有助于提高DF的水合性能。這與IDF的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相一致[22]。

圖5 紅曲霉菌絲體和農(nóng)產(chǎn)品廢渣不溶性膳食纖維的掃描電子顯微鏡圖Fig.5 Scanning electron microscope image of Monascus mycelium and insoluble dietary fiber from agricultural product waste

2.4 紅曲豆渣、麥麩和梨渣中紅曲色素的成分分析

圖6（a）是MSB的全波長掃描圖，其特點(diǎn)是有三個(gè)吸收峰，分別對應(yīng)為紅色素（532 nm）、橙色素（410 nm）和黃色素（370 nm）。圖6（b）是MOFB的全波長掃描圖，具有兩個(gè)吸收特征峰，分別為紅色素和橙色素吸收峰，其中來自紅曲豆渣的紅曲色素中橙色素峰值處的色價(jià)顯著高于在紅色素峰值處的色價(jià)。圖6（c）是MBFB的全波長掃描圖，具有紅色素（532 nm）和黃色素（370 nm）兩個(gè)吸收峰。從圖6（d）可以看出，MPFB的全波長掃描顯示有三個(gè)特征吸收峰，分別對應(yīng)于紅色素（532 nm）、橙色素（410 nm）和黃色素（370 nm）。

圖6 不同發(fā)酵液中紅曲色素的全波長掃描曲線Fig.6 Full-wavelength scanning curves of Monascus pigments in different fermentation broths

紅曲色素的色價(jià)與其含量成正相關(guān)[23]。因此，通過測量紅曲色素的色價(jià)可以分析紅曲霉發(fā)酵豆渣、麥麩和梨渣產(chǎn)生紅曲色素的含量。由表1可知，MSB中紅色素、橙色素和黃色素的含量均較低。MOFB中含有紅色素和橙色素，橙色素含量遠(yuǎn)高于紅色素含量，其色價(jià)分別為258.8 U/mL和140.2 U/mL。MBFB中含有紅色素和黃色素，其色價(jià)分別為154.4 U/mL和236.6 U/mL。MPFB含有紅色素、橙色素和黃色素，其中紅色素和黃色素色價(jià)較低，橙色素色價(jià)最高，為248.2 U/mL。由此可見，發(fā)酵底物影響紅曲色素成分，采用不同農(nóng)產(chǎn)品廢渣可以獲得不同組分的紅曲色素。

表1 豆渣、麥麩和梨渣對紅曲色素成分的影響Table 1 Effect of okara,wheat bran and pear residue on the Monascus pigments compositions

續(xù)表

2.5 不同發(fā)酵液中橘霉素含量的測定

紅曲霉在發(fā)酵過程中不僅產(chǎn)生紅曲色素等有益物質(zhì)，還會(huì)產(chǎn)生一些有毒物質(zhì)，其中橘霉素是紅曲發(fā)酵的關(guān)鍵毒素。橘霉素具有高毒性，對腎臟特別有害，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物腎臟腫大和上皮細(xì)胞壞死等[24]，因此，必須對發(fā)酵產(chǎn)生的橘霉素含量進(jìn)行監(jiān)控。根據(jù)國標(biāo)規(guī)定，食品中的橘霉素含量不得超過0.05 mg/kg（或mg/L）[25]。在本研究中，通過HPLC測出MSB、MOFB、MBFB和MPFB中橘霉素含量分別為0.009 8 mg/L、0.009 4 mg/L、0.008 8 mg/L和0.009 0 mg/L，符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論

以豆渣、麥麩和梨渣為底物，進(jìn)行紅曲霉液態(tài)發(fā)酵，不僅能夠增加農(nóng)產(chǎn)品廢渣中SDF的含量，改善DF的品質(zhì)，還可產(chǎn)生紅曲色素等多種次級(jí)代謝物，增加產(chǎn)品的保健功能，提高農(nóng)產(chǎn)品廢渣的利用價(jià)值。本研究采用安卡紅曲霉發(fā)酵豆渣、麥麩和梨渣，制備膳食纖維，并研究了紅曲霉發(fā)酵對膳食纖維結(jié)構(gòu)組成的影響。研究結(jié)果表明，紅曲霉發(fā)酵可以改變豆渣等農(nóng)產(chǎn)品廢渣的膳食纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而有效改善膳食纖維的理化特性，有利于提高其在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。后期應(yīng)對紅曲霉發(fā)酵機(jī)理及紅曲膳食纖維的組分及結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)研究。