以吸附量為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選黃芩炭的提取工藝

趙玉升 張藎元 甄偉哲 王芊云 度偉 李龍朝 張萱 孔慧

摘要：目的優(yōu)選黃芩炭的提取工藝。方法通過(guò)正交試驗(yàn)法對(duì)加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行考察，以水提物的吸附量為考察指標(biāo)，優(yōu)選黃芩炭的提取工藝。結(jié)果加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素對(duì)黃芩炭提取物吸附量的影響依次為：提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量，黃芩炭的最佳提取工藝為：黃芩炭粉碎過(guò)2號(hào)篩，加水8倍，提取3次，每次2 h。結(jié)論本研究首次測(cè)定了黃芩炭提取物的吸附量，相較于測(cè)定黃芩炭粉的吸附力，更能體現(xiàn)臨床用藥實(shí)際情況，優(yōu)選的黃芩炭提取工藝合理可行，為臨床上黃芩炭的提取提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃芩炭;吸附量;提取工藝;正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B文章編號(hào)：1007-2349（2021）02-0074-04

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi.的干燥根，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效[1]，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃芩具有治療脾胃虛寒的作用[2]。關(guān)于黃芩炭的記載可追溯至北宋《太平圣惠方》，其為“麝香魔膏方……煎候黃芩黑色”。黃芩炒炭的目的是增強(qiáng)其止血功效，黃芩炭主要用于血熱導(dǎo)致的吐血、衄血、血崩等各種出血癥[3]。對(duì)于黃芩炭的質(zhì)量控制，有學(xué)者認(rèn)為炒炭后黃酮苷含量降低而黃酮苷元的含量相應(yīng)增加，應(yīng)對(duì)此類(lèi)成分進(jìn)行控制[4]，但是其與止血功效的增強(qiáng)相關(guān)性不強(qiáng)。對(duì)于黃芩炭止血的物質(zhì)基礎(chǔ)，還有學(xué)者研究了其鞣質(zhì)的含量變化，發(fā)現(xiàn)炒炭后鞣質(zhì)含量更低，與止血功效增強(qiáng)相關(guān)性不大;目前比較認(rèn)可的是炒炭后產(chǎn)生的“炭素”，其吸附力比生黃芩明顯上升，是產(chǎn)生止血的主要因素[5]。但是文獻(xiàn)中對(duì)于黃芩炭吸附力的測(cè)定是采用的黃芩炭粉直接吸附亞甲基藍(lán)的方法[6]，筆者認(rèn)為，黃芩炭在臨床中是煎煮后服用的，其產(chǎn)生的止血物質(zhì)應(yīng)該在其提取物中，故其吸附力的判定采用提取物進(jìn)行測(cè)定更有說(shuō)服力度。本文將以提取物的吸附量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)市售黃芩炭進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，以期獲得更能反映與止血作用相關(guān)聯(lián)的提取工藝。

1儀器與試藥

CECIL 7200型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（英國(guó)Cecil Instruments公司），BSA1245-CW型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司），DGG-9240B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），亞甲基藍(lán)為分析純（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)220D029），其余試劑均為分析純。黃芩炭購(gòu)自北京仟草中藥飲片有限公司（產(chǎn)地：內(nèi)蒙古 生產(chǎn)批號(hào)180316006 優(yōu)）。

2方法與結(jié)果

2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)黃芩炭在臨床使用中是采取水煎煮的方法，故本實(shí)驗(yàn)采用水提取。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩炭粉碎過(guò)2號(hào)藥典篩之后，提取物的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于黃芩炭飲片直接提取，為了保證提取完全，在本實(shí)驗(yàn)中使用的黃芩炭均是指已經(jīng)粉碎過(guò)2號(hào)篩的樣品。

選取常規(guī)影響中藥提取的主要因素，加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素為考察因素，各因素相應(yīng)安排3個(gè)水平，選用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)[7]，因素水平表見(jiàn)表1。

2.2黃芩炭的提取為了避免黃芩炭粉碎粒度對(duì)提取率的影響，本實(shí)驗(yàn)將所購(gòu)藥材統(tǒng)一粉碎過(guò)藥典2號(hào)篩（24目），作為提取的樣品。按表2L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，稱(chēng)取黃芩炭粉50 g，加水，煎煮，濾過(guò)，濾液濃縮至100 mL（0.5 g/mL），平行取濃縮液10 mL各3份，水浴鍋上蒸干，置105℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥2h，放置室溫，稱(chēng)重，取均值，計(jì)算出膏率（%），折算出100 mL藥液的總出膏量（g）。

2.3吸附力的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)依據(jù)“木質(zhì)活性炭試驗(yàn)方法亞甲基吸附值的測(cè)定”《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T12496.10-1999》[6]的方法，測(cè)定黃芩炭水提物的吸附力。

2.3.1供試品溶液的制備取以上正交試驗(yàn)所得黃芩炭提取干膏，粉碎，取約0.05 g，平行取樣3份，精密稱(chēng)定，置10 mL離心管內(nèi)，精密加入已知濃度為30.32 mg·L-1的亞甲基藍(lán)溶液5 mL，置恒溫振蕩器上，振蕩45min（溫度為25℃，振蕩器轉(zhuǎn)速150 r·min-1），0.22μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液1 mL，加PBS溶液3 mL稀釋?zhuān)靹?，作為供試品溶液?/p>

2.3.2亞甲基藍(lán)所含水分的測(cè)定稱(chēng)取亞甲基藍(lán)約0.2 g，置于事先在105℃烘箱干燥至恒重的扁形稱(chēng)量瓶中，精密稱(chēng)定，然后置烘箱中105℃開(kāi)蓋干燥4h，取出置干燥器中，自然冷卻至室溫，精密稱(chēng)定，計(jì)算減失的水分。結(jié)果該實(shí)驗(yàn)使用的亞甲基藍(lán)含水量為10.62%。

2.3.3亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱(chēng)定已知含水分為10.62%的亞甲基藍(lán)0.17 g，置于100 mL容量瓶中，加pH≈7的PBS緩沖溶液溶解并稀釋至刻度，按公式計(jì)算得含以亞甲基藍(lán)干燥品計(jì)濃度為1.5497 mg·mL-1的亞甲基藍(lán)對(duì)照品母液，搖勻，再?gòu)闹芯芪?.4 mL至100 mL容量瓶中，加PH≈7的PBS緩沖溶液稀釋至刻度并搖勻，即得每1 mL含0.0217mg的亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。精密移取亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL，0.5 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加pH≈7 的PBS緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻。以亞甲基藍(lán)濃度為0的溶液作為空白溶液，置UV分光光度計(jì)中掃描基線，然后作為參比，分別在665 nm 處測(cè)定以上系列溶液的吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，以亞甲基藍(lán)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y =224.34X+0.0291，亞甲基藍(lán)在0.000434～0.00434mg/mL（R=0.9991）線性關(guān)系良好。

計(jì)算公式：C1=m（1-E）V

其中：C1一以干燥品計(jì)算的亞甲基藍(lán)溶液的濃度

m一未干燥的亞甲基藍(lán)的質(zhì)量

E一亞甲基藍(lán)的水分

V一溶液體積

2.3.4樣品測(cè)定取以上供試品溶液，以PBS緩沖溶液為空白對(duì)照，在665 nm 處測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中游離的亞甲基藍(lán)量，并根據(jù)下方公式計(jì)算出吸附量，進(jìn)一步計(jì)算出吸附力。結(jié)果見(jiàn)表2。

公式：吸附量=已知準(zhǔn)確加入的亞基藍(lán)總量-測(cè)得的游離亞甲基藍(lán)量，吸附力=吸附量/樣品量

2.4正交試驗(yàn)分析根據(jù)黃芩炭提取物總吸附量=吸附力×出膏量，計(jì)算各種條件下的總吸附量，結(jié)果見(jiàn)表2;并以此進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出三個(gè)因素對(duì)黃芩炭提取物總吸附量的影響均無(wú)顯著性差異，又根據(jù)表2極差分析結(jié)果，對(duì)黃芩炭提取物吸附量的影響依次為：提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量，且 A、B、C三個(gè)因素最大極差值分別為第1、第3、第3個(gè)水平，故優(yōu)選的工藝為A1B3C3，即加水8倍量，提取2h，提取3次。也就是正交表2中的第3號(hào)實(shí)驗(yàn)，從表中可以看出，該工藝所得提取物對(duì)亞甲基藍(lán)的吸附量最大。

2.5重復(fù)和放大驗(yàn)證試驗(yàn)[8]粉碎過(guò)篩后，稱(chēng)取黃芩炭粉500 g三組，分別加水8倍量，煎煮2h，提取3次，濾液濃縮至1000 mL（0.5 g/mL），每組平行取濃縮液100 mL各3份，水浴鍋上蒸干，再置于105℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥2h，放置室溫，稱(chēng)重，取均值，計(jì)算出膏率（%），折算出1000 mL藥液的總出膏量（mg）。取以上所得黃芩炭干膏，粉碎，測(cè)定吸附力。

由表4可知，放大實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)論基本一致。

3討論

中藥炭藥在中國(guó)已有兩千多年的應(yīng)用歷史，其“炒炭止血”的理論也為臨床醫(yī)家所公認(rèn)。對(duì)于其止血的物質(zhì)基礎(chǔ)，比較公認(rèn)的是炒炭后產(chǎn)生的“炭素”和鞣質(zhì)的變化是其產(chǎn)生止血或止血作用增強(qiáng)的主要因素。而吸附力增強(qiáng)被認(rèn)為與止血作用密切相關(guān)，且主要是由炭素產(chǎn)生的，例如：側(cè)柏葉[9]、生地黃[10]、牡丹皮[11]、梔子[12]炒炭后的吸附力較生品明顯增強(qiáng);大黃[13]隨炒制程度的增強(qiáng)吸附力增大;不同炮制程度的槐米炭（生品、輕炭、標(biāo)炭、重炭），色素吸附力呈先上升后下降的趨勢(shì)[14]。

更有學(xué)者研究了吸附力與止血作用的相關(guān)性，證明吸附力增加其止血作用也隨之增強(qiáng)，例如，藕節(jié)炒炭后，吸附力增強(qiáng)，對(duì)小鼠的凝血時(shí)間明顯縮短[15];干姜炒炭后鞣質(zhì)和吸附力均比生品增強(qiáng)，證明其止血作用相應(yīng)增強(qiáng)[16]。本團(tuán)隊(duì)利用小鼠斷尾出血和肝臟出血模型研究了黃芩炭止血作用與吸附力之間的相關(guān)性，結(jié)果二者呈正相關(guān)，且相關(guān)性良好，以吸附力可以作為體外評(píng)價(jià)黃芩炭止血作用的評(píng)價(jià)指標(biāo)。以上評(píng)價(jià)均是在統(tǒng)一樣品質(zhì)量的情況下，比較吸附力的大小，但是在本文中，由于出膏率不同，所以?xún)H用吸附力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)有失偏頗，故本文將吸附力和出膏率綜合考慮，采用吸附量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，更能反映提取物的綜合性質(zhì)。

湖北中醫(yī)學(xué)院毛維倫教授多年從事中藥材“炒炭存性”炮制的研究，旨在建立一種既能反映中藥材固有特征，又能給出穩(wěn)定的中藥量化評(píng)價(jià)的方法。通過(guò)綜合分析研究結(jié)果，毛教授首次提出以吸附力作為炭藥質(zhì)量控制指標(biāo)的方法，對(duì)炭藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究有重要意義[17]。也對(duì)炭藥的炮制工藝提供了評(píng)價(jià)指標(biāo)[18]。

但是，從以上報(bào)道的研究方法看，其吸附力的測(cè)定均是采用炒炭后的炭品直接測(cè)定，忽略了炭藥產(chǎn)生藥理作用首先要經(jīng)過(guò)提取這一重要的過(guò)程，因此，本文首次提出以提取物的吸附量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，更符合臨床實(shí)際，這是對(duì)炭藥性質(zhì)的更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

本研究以黃芩炭為例，以提取物的吸附量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法，優(yōu)選出黃芩炭的最佳提取工藝為：黃芩炭粉碎過(guò)2號(hào)篩，加水8倍量，提取2h，提取3次，將為臨床上炭藥的煎煮提供更科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2020-08-21）