ERK磷酸化抑制在改善異氟醚致成年小鼠認(rèn)知損害中的作用

湯娜娜，李 娟，曹福羊，劉曉梅

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是指麻醉和(或)手術(shù)后認(rèn)知功能的惡化，表現(xiàn)為記憶或注意力障礙，可出現(xiàn)在術(shù)后數(shù)天或數(shù)月內(nèi)[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，有12%認(rèn)知功能正常的患者在手術(shù)后可出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，其中年齡、麻醉和手術(shù)類型等是POCD發(fā)生的重要影響因素[3，4]。臨床研究表明，吸入麻醉可對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用并導(dǎo)致認(rèn)知障礙，但其發(fā)生機(jī)制尚不明確[5]。本研究旨在探討異氟醚對(duì)成年小鼠的認(rèn)知功能損傷、損傷機(jī)制及ERK磷酸化抑制在改善異氟醚所致的認(rèn)知損害中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取SPF級(jí)健康雄性C57BL/6J P6小鼠66只，體重20～25 g，由北京華阜康生物工程有限公司提供。均飼養(yǎng)于無特殊病原菌環(huán)境，溫度22～24 ℃，濕度40%～50%，每12 h晝/夜交替，自由攝食水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對(duì)照組(Con組)、異氟醚組(Iso組)、干預(yù)組(Iso+U0126)，每組22只。本研究經(jīng)北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物處置過程符合倫理學(xué)要求。

1.2 方法 Iso組和Iso+U0126組小鼠置于1個(gè)帶進(jìn)出口的密閉樹脂盒，通過氣體流量計(jì)和異氟醚獨(dú)立揮發(fā)罐將1.4%異氟醚(CAS：26675-46-7；麥克林公司生產(chǎn))+60%氧氣+38.6%空氣混合通入樹脂盒，對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉處理2 h；Iso+ U0126組小鼠于異氟醚處理前30 min，腹腔注射100 mg/kg U0126(MEK1/2抑制劑)預(yù)處理。Con組小鼠置于同樣樹脂盒，僅給予60%氧氣+40%空氣處理2 h。采用Vamous麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀(德國(guó)Drager公司)監(jiān)測(cè)異氟醚及O2濃度。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 β淀粉樣蛋白1-42(amyloid β protein 1-42, Aβ1-42)水平檢測(cè) 造模結(jié)束后每組隨機(jī)選取6只小鼠心臟灌流后斷頭，取皮層樣本，稱重加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液勻漿，4 ℃,14 000 r/min,離心10 min后取上清，采用BCA法測(cè)定樣本濃度。每組再隨機(jī)選取4份皮層樣本，采用ELISA法測(cè)定β淀粉樣蛋白42(Aβ1-42)表達(dá)水平。所有試劑盒購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3.2 蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1, p-ERK1)水平 3組取上述皮層樣本采用Western blot法檢測(cè)皮層p-ERK1表達(dá)情況。將等量蛋白(50 μg)加入SDS上樣緩沖液中，70 ℃恒溫加熱10 min使其變性。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入小鼠抗磷酸化ERKl單克隆抗體(1∶1000，美國(guó)Cell Signaling公司) 4 ℃過夜，漂洗后加入羊抗鼠二抗(1∶2000，美國(guó)Sigma公司)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光顯影，定影，采用美國(guó)Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)掃描，照相。以目的條與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反應(yīng)目的條帶的表達(dá)水平。

1.3.3 免疫熒光法檢測(cè)p-ERK1水平 造模結(jié)束后每組隨機(jī)選取6只小鼠心臟灌流后斷頭，將小鼠皮層剝離后用4%多聚甲醛固定24 h，20%蔗糖脫水4 h,30%蔗糖脫水4 h，制成厚度為5 μm的冰凍切片。固定、破膜、封閉后，添加兔抗p-ERKl單克隆抗體(1∶1000，美國(guó)Cell Signaling公司)。將載玻片放在濕盒中， 4 ℃冰箱中過夜。洗滌3次后，加入山羊抗兔抗體(1∶1000，美國(guó)Cell Signaling公司)，37 ℃孵育1 h。在室溫下用DAPI(104139，Abcam)孵育5 min。滴加抗熒光淬滅劑后封片，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行觀察，對(duì)視野中綠色熒光表示的p-ERK1+細(xì)胞和藍(lán)色熒光表示的總細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以p-ERK1+細(xì)胞數(shù)/DAPI+細(xì)胞數(shù)×100%表示。

1.3.4 水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮系統(tǒng)(Haslings 公司，美國(guó))為直徑150 cm、高60 cm的黑色圓柱形水池，池壁上以4個(gè)等距點(diǎn)將水池平均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限，平臺(tái)置于第Ⅰ象限中央，直徑10 cm，低于水面1 cm。水中加入白色染料拌勻，保持水溫25 ℃，訓(xùn)練期間平臺(tái)位置和水池周圍參照物保持不變。水迷宮實(shí)驗(yàn)共7 d，第1～7 天行定位航行實(shí)驗(yàn)，小鼠面向池壁分別從第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限入水點(diǎn)入水，間隔15 min，記錄小鼠從入水到找到平臺(tái)的時(shí)間。當(dāng)逃避潛伏期超過 90 s，則引導(dǎo)小鼠至平臺(tái)并停留 10 s，時(shí)間記為90 s，取4次逃避的平均值為逃避潛伏期。第7天同時(shí)行空間探索實(shí)驗(yàn)：撤除平臺(tái)，于第Ⅰ象限中點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，記錄其30 s 內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)[6]。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠皮層p-ERK1和Aβ1-42表達(dá)水平比較 WB和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示(圖1)，與Con組比較， Iso組Aβ1-42水平顯著升高，小鼠皮層p-ERK1的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。與Iso組比較，Iso+U0126組Aβ1-42表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，皮層p-ERK1水平顯著下降(P<0.05，表1)。

表1 各組小鼠皮層p-ERK1和Aβ1-42表達(dá)水平比較

2.2 小鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)的比較 造模后第2～7天，與Con組相比，Iso組小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Iso組比較，Iso+U0126組小鼠逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

圖1 3組小鼠皮層p-ERK1表達(dá)水平比較 Con組為對(duì)照組，Iso組為異氟醚組， Iso+U0126組為干預(yù)組

表2 三組小鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)的比較

3 討 論

異氟醚通過調(diào)節(jié)NMDA型谷氨酸受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生鎮(zhèn)痛和麻醉作用[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)， NMDA型谷氨酸受體在學(xué)習(xí)和記憶過程中有關(guān)鍵作用，也可能在麻醉誘導(dǎo)的大腦認(rèn)知缺陷中發(fā)揮作用[10]。有研究指出，麻醉藥物處理下的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化的水平的改變可能是神經(jīng)元凋亡的潛在原因[11]。

本研究參考臨床常用的異氟醚濃度(正常成年人的最低肺泡濃度1.15%)，對(duì)照文獻(xiàn)[12]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行模型，選取出生后2月齡的C57BL/6J小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行1.4%異氟醚連續(xù)2 h處理。研究表明異氟醚可劑量依賴性地?fù)p傷海馬突觸可塑性和增加炎性反應(yīng)水平，導(dǎo)致海馬相關(guān)性認(rèn)知損傷[13]。本研究結(jié)果表明，Iso組小鼠造模24 h后連續(xù)7 d的逃避潛伏期較Con組顯著增長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，提示小鼠經(jīng)過異氟醚處理后，海馬相關(guān)的認(rèn)知功能受到顯著損害。

Aβ1-42是與認(rèn)知功能和腦損傷有關(guān)的蛋白，其在阿爾茨海默病、炎性腦病、腦缺血再灌注損傷中均可明顯增高[14]。ERK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其主要包括ERK1和ERK2兩種亞型，可將細(xì)胞外刺激傳遞給細(xì)胞內(nèi)并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能。大腦中Aβ的異常累積同時(shí)會(huì)上調(diào)p-ERK的水平，而通過抑制Aβ激活的p-ERK水平，可提高小鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元的存活數(shù)量，提高小鼠學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力[15]。本研究采用ELISA法檢測(cè)皮層Aβ1-42含量，經(jīng)典WB法和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠皮層p-ERK1水平。結(jié)果顯示，與Con組相比，Iso組小鼠皮層Aβ1-42含量升高，p-ERK1水平顯著升高，說明異氟醚致成年小鼠皮層Aβ異常累積，并致ERK磷酸化水平上調(diào)。

U0126是一種常用的MAPKK抑制劑，即MAPK 激酶抑制劑或MEK1/2抑制劑。U0126可以通過細(xì)胞選擇性抑制MEK1/2，從而抑制MAP 激酶 (ERK1/2即p44/42 MAPK)的磷酸化和激活[16]。在本研究中，相比Iso組，Iso+U0126組小鼠皮層Aβ1-42水平無顯著變化，而p-ERK1的水平顯著降低，逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多，表明預(yù)先給予U0126可改善異氟醚處理后Aβ1-42異常累積所致的p-ERK1水平上調(diào)及認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，1.4%異氟醚連續(xù)2 h處理可致成年小鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與Aβ1-42異常累積致ERK磷酸化水平升高有關(guān)，而通過預(yù)先抑制ERK磷酸化水平可改善異氟醚所致的認(rèn)知功能損害。本研究初步探討了吸入麻醉誘導(dǎo)POCD的相關(guān)機(jī)制，而ERK作為新靶點(diǎn)可能為臨床預(yù)防或治療POCD的發(fā)生提供新的方向，下一步將進(jìn)行更全面的研究。