CXCL13 通過CXCR5 激活星形膠質(zhì)細(xì)胞中JNK參與痛覺過敏*

張 敏 曹德利 姜保春 高永靜

（南通大學(xué)疼痛醫(yī)學(xué)研究院 特種醫(yī)學(xué)研究院，南通226019）

慢性疼痛是指持續(xù)或反復(fù)發(fā)作3 個(gè)月以上的疼痛，發(fā)病率占成年人口的11%～19%，影響全球上億人群，然而目前臨床治療效果不佳。近年來的研究表明，由神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞）釋放的趨化因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等炎癥因子介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在慢性疼痛發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1,2]。趨化因子CXCL13 又稱B 淋巴細(xì)胞趨化因子，最初發(fā)現(xiàn)于B 細(xì)胞濾泡的基質(zhì)細(xì)胞中，通過受體CXCR5 調(diào)節(jié)B 細(xì)胞和T 細(xì)胞亞群的歸巢。最近研究顯示，CXCL13 和CXCR5 在正常小鼠脊髓均有低表達(dá)；在神經(jīng)損傷后，CXCL13和CXCR5 分別在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)大幅度增加，而且CXCR5 基因敲除的小鼠，神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活受到很大程度的抑制，神經(jīng)病理性疼痛也顯著緩解[3]，表明CXCL13 通過CXCR5 促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)病理性疼痛。但CXCL13 是否由神經(jīng)元分泌、CXCL13 和CXCR5 如何發(fā)生相互作用、CXCL13 如何激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，這些問題都缺乏研究。

有絲分裂原激活的蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs) 是在慢性疼痛發(fā)生發(fā)展中起重要作用的細(xì)胞內(nèi)激酶，主要包括c-Jun N 末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signaling-regulated kinase, ERK) 和p38。以往的研究顯示，JNK 在脊髓中只表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，而且JNK 的磷酸化對(duì)于脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和慢性疼痛的維持起重要作用[4,5]。CXCR5 表達(dá)于脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，JNK 是否參與CXCL13 引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活以及痛覺過敏呢？本研究用體外神經(jīng)元培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染CXCL13 和CXCR5 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法，研究了CXCL13 在神經(jīng)元中的表達(dá)和分泌以及CXCL13 和CXCR5 的相互作用，并采用星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)和藥理學(xué)方法，研究了JNK 在CXCL13 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活和痛覺過敏中的作用。

方 法

1.材料

動(dòng)物：健康成年雄性ICR 小鼠和新生ICR 小鼠由南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表方法進(jìn)行分組。

試劑和藥品：CXCL13 抗體 (Santa Cruz Biotechnology)；MAP2 抗體 (Sigma-Aldrich)；CXCL13重組因子（美國PeproTech）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（美國Thermal Scientific）；Cy3-donkey anti-goat IgG 和Alex-488-donkey anti-mouse 標(biāo)記熒光二抗（美國Jackson Research）；組織裂解液Lysis Buffer (Beyotime)；DMEM 培養(yǎng)基 (Gibco)；胎牛血清FBS (Gibco)；SP600125 (Calbiochem)；其余化學(xué)試劑從美國Sigma 公司購買。

實(shí)驗(yàn)所用主要儀器：von Frey filament (Stoeling)；Model390 熱痛覺過敏測(cè)試儀電 (IITC Life Science)；電泳儀（美國Bio-Rad）；倒置激光共聚焦顯微鏡SP8 (Leica)；高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf)；Odyssey 雙色紅外熒光掃描儀（美國LI-COR）；多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek）。

2. 方法

（1）脊髓背角神經(jīng)元體外培養(yǎng)：提前用多聚賴氨酸包被玻片；將新生3～4 天ICR 小鼠用75%酒精消毒，斷頭。剪下脊柱放入預(yù)冷的HBSS + HEPES 中，在解剖鏡下進(jìn)行腹側(cè)椎板切除手術(shù)，除去脊髓外膜，取脊髓背角放入預(yù)熱的Papain 消化液中，37℃消化30 min。離心，棄Papain 消化液，加HBSS + HEPES 液洗3 次，離心，棄上清；加完全培養(yǎng)基吹打，靜止1～2 min，吸取上層細(xì)胞懸液；用40 μm 網(wǎng)篩過濾細(xì)胞懸液；離心，1000 rpm，5 min，棄上清，加完全培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞接種到小皿中，第2 天換液。

（2）原代星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)：新生2～3天ICR 小鼠用75%酒精消毒，斷頭，取大腦皮層，放置在預(yù)冷的D-Hanks 液中；在解剖鏡下剔除大腦皮層外膜和血管。吸去多余的D-Hanks 液，用剪刀剪碎組織，轉(zhuǎn)移至離心管，加入完全培養(yǎng)基吹打至無明顯固體；過100 μm 網(wǎng)篩；3000 rpm 離心，棄上清；加低糖完全培養(yǎng)基重懸，過10 μm 濾器，分至六孔板；第2 天換液；3～4 天換1 次液，10天左右加D-環(huán)腺苷酸，1 天后可用。

（3）行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定：①小鼠機(jī)械性觸誘發(fā)痛行為檢測(cè)：將成年ICR 小鼠放置于行為檢測(cè)架上適應(yīng)至其安靜，連續(xù)適應(yīng)3 天，適應(yīng)時(shí)禁食、禁水，溫度在23℃左右，時(shí)間在上午8 點(diǎn)至下午6 點(diǎn)之間；連續(xù)適應(yīng)3 天后用von Frey filament 進(jìn)行小鼠足底刺激。觸誘發(fā)痛檢測(cè)采用Dixon 建立的“up and down”方法，得到機(jī)械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)。縮足閾值越低，表示機(jī)械性觸誘發(fā)痛越嚴(yán)重；②小鼠熱痛覺過敏檢測(cè)：將成年ICR 小鼠放置在熱痛檢測(cè)的塑料盒中適應(yīng)至其安靜，適應(yīng)時(shí)禁食、禁水，溫度在23℃左右，時(shí)間在上午8 點(diǎn)至下午6 點(diǎn)之間。適應(yīng)后用一定強(qiáng)度的熱輻射照射小鼠左足底，通過調(diào)節(jié)照射強(qiáng)度將基礎(chǔ)縮足時(shí)間控制在12～14 s，小鼠出現(xiàn)縮足時(shí)停止照射，記錄時(shí)間。為避免灼傷足底，照射時(shí)間不超過20 s。每只小鼠照射3 次，間隔15 min，計(jì)算其平均值，得到熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)。縮足潛伏期越低，表示熱痛覺過敏越嚴(yán)重。

（4）小鼠脊髓鞘內(nèi)給藥：剔除小鼠背部毛發(fā)，吸入異氟烷麻醉，75% 酒精消毒，用胰島素針在第L4、L5腰椎棘突間注射10 μl藥物至小鼠蛛網(wǎng)膜下隙，尾巴甩動(dòng)或顫抖證明注射成功，注射結(jié)束后停留數(shù)秒后退針。

（5）Western Blot 蛋白檢測(cè)：組織/細(xì)胞蛋白質(zhì)提?。杭尤隦IPA 裂解液70 μl 裂解組織/細(xì)胞，在冰上靜置30 min；4℃，1 5000 rpm，離心20 min，吸蛋白上清。吸取3 μl 上清加21 μl 雙蒸水進(jìn)行稀釋8 倍，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。每孔加入30 μg蛋白進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃敷一抗過夜，一抗用5%脫脂奶粉稀釋(p-JNK, 1:1000; GAPDH, 1:1 0000)；第2 天室溫復(fù)溫1 h 后用TBST 洗3 次，每次15 min；熒光二抗用5%的脫脂奶粉稀釋1 0000 倍，室溫孵育2 h；TBST 洗3 次，每次15 min，用Odyssey 紅外成像機(jī)器顯影。

（6）免疫熒光染色：細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，0.01 M PBS 洗1 次，用4%多聚甲醛灌注固定20 min。0.01 M PBS 洗片3 次，每次5 min；加1%BSA 室溫封閉2 h；用1%BSA 稀釋一抗(CXCL13, 1:200; MAP2, 1:5000)，4 ℃孵育過夜；次日復(fù)溫1 h 后0.01 M PBS 洗3 次，每次5 min；分別加入用0.01 M PBS 稀釋Cy3 和 Alexa 488 標(biāo)記的熒光二抗(1:1000, Jackson Immuno Research)；避光室溫孵育2 h，0.01 M PBS洗3 次，每次5 min，晾干，倒置熒光顯微鏡下拍照觀察。

（7）質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染：分別構(gòu)建CXCL13羧基端融合RFP 和CXCR5 羧基端融合GFP 的表達(dá)質(zhì)粒，委托上海吉?jiǎng)P基因構(gòu)建，質(zhì)粒信息見圖1。

HEK 293T 細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%并狀態(tài)良好時(shí)適合轉(zhuǎn)染。分別轉(zhuǎn)染pCMV-RFP、pCMV-CXCL13-RFP、pCMV-GFP 和pCMV-CXCR5-GFP 質(zhì)粒。先用預(yù)熱好的Opti-MEM 稀釋質(zhì)粒，再用Opti-MEM稀釋Lipofectamine 3000 [Lipofectamine 3000：質(zhì)粒 (ml:mg) = 1:2]；然后將二者1:1 混合均勻，室溫靜止10～15 min；將混合液加入細(xì)胞中，6 h 后換液，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h 即可進(jìn)行觀察熒光和細(xì)胞傳代。

分別按照pCMV-CXCL13-RFP 和pCMV-GFP、pCMV-RFP 和pCMV-CXCR5-GFP、pCMV-CXCL13-RFP和pCMV-CXCR5-GFP 分組，將轉(zhuǎn)染了不同質(zhì)粒的細(xì)胞接種到一起。

3.圖像和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 CXCL13 與CXCR5 結(jié)合并內(nèi)化實(shí)驗(yàn)示意圖Fig. 1 Schematic diagram showing the experimental design to prove the binding of CXCL13 with CXCR5 and the internalization

處理使用Image J 軟件進(jìn)行圖像處理，統(tǒng)計(jì)各條帶的灰度值；用目的條帶的灰度值與內(nèi)參GAPDH 蛋白灰度值（均扣除背景）的比值作為最終統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，用以表示相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。所有計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism (version 8.01)，均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用雙因素方差分析 (Two-way ANOVA)，多組之間比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，兩組之間比較采用t 檢驗(yàn) (Student's t-test)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.脊髓背角神經(jīng)元表達(dá)趨化因子CXCL13

本課題組前期研究顯示，脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型中，脊髓背角神經(jīng)元中CXCL13表達(dá)增加[3]，為了明確小鼠正常生理狀態(tài)下脊髓背角神經(jīng)元表達(dá)CXCL13 的情況，本研究取新生3～4天的ICR 小鼠脊髓背角神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)5 天后固定進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果顯示，趨化因子CXCL13 在神經(jīng)元的胞漿和突起中呈點(diǎn)狀分布，在胞外的培養(yǎng)基中也有散點(diǎn)狀陽性熒光信號(hào)（見圖2A），且該神經(jīng)元與微管相關(guān)蛋白2 (MAP2) 共標(biāo)（見圖2B, C），說明CXCL13 表達(dá)于脊髓背角神經(jīng)元并向胞外分泌。

2.分泌型CXCL13 與受體CXCR5 結(jié)合并發(fā)生內(nèi)化

為進(jìn)一步研究趨化因子CXCL13 作為分泌型蛋白如何與其受體CXCR5 相互作用發(fā)揮功能，本研究首先構(gòu)建CXL13-RFP 過表達(dá)質(zhì)粒、CXCR5-GFP過表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒（RFP 或GFP 過表達(dá)質(zhì)粒），分別轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞，觀察CXCL13 和CXCR5 細(xì)胞表達(dá)、分布情況。結(jié)果顯示HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染CXCL13-RFP 過表達(dá)質(zhì)粒后，胞內(nèi)有點(diǎn)狀分布的CXCL13 陽性顆粒（見圖3A），對(duì)照組RFP 在胞漿內(nèi)均勻分布（見圖3D）。轉(zhuǎn)染GFP 對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞中也見GFP 均勻分布（見圖3B），轉(zhuǎn)染CXCR5-GFP 過表達(dá)質(zhì)粒后，CXCR5 在胞漿和胞膜上都有表達(dá)（見圖3E）。圖層拼合后的結(jié)果顯示，將分別轉(zhuǎn)染CXCL13-RFP 過表達(dá)質(zhì)粒和GFP 對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞傳代后接種到一起，兩者信號(hào)不共標(biāo)（見圖3A-C）；將分別轉(zhuǎn)染RFP 對(duì)照質(zhì)粒與CXCR5-GFP 過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞傳代后接種到一起，兩者信號(hào)也不共標(biāo)（見圖3D-F）。但是將分別轉(zhuǎn)染CXCL13-RFP 過表達(dá)質(zhì)粒與CXCR5-GFP 過表達(dá)質(zhì)粒后的細(xì)胞接種到一起，CXCL13 蛋白信號(hào)不但在轉(zhuǎn)染CXCL13-RFP 的細(xì)胞中表達(dá)，也可見于表達(dá)CXCR5-GFP 的細(xì)胞中，且CXCL13 和CXCR5兩種蛋白信號(hào)有共標(biāo)，呈顆粒狀分布在胞質(zhì)中（圖3G-I，局部放大見圖3J-L），說明分泌的CXCL13能夠與受體CXCR5 結(jié)合并發(fā)生內(nèi)化。

3. CXCL13 激活星形膠質(zhì)細(xì)胞中JNK

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，受體CXCR5 在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[3]，為了研究CXCL13 與受體CXCR5 結(jié)合后激活的下游信號(hào)通路，本文采用體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，用10 ng/ml 的CXCL13 重組因子刺激0.5 h 或1 h，通過Western Blot 檢測(cè)p-JNK 的表達(dá)。結(jié)果顯示，CXCL13 孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞0.5 h 后，引起JNK 磷酸化水平升高（見圖4A, B）；但CXCL13 孵育1 h 后，p-JNK 的表達(dá)與對(duì)照組無顯著性差異（見圖4C, D），說明CXCL13 與受體CXCR5 結(jié)合快速激活JNK。

圖2 體外培養(yǎng)的脊髓背角神經(jīng)元表達(dá)趨化因子CXCL13 (A)免疫熒光染色顯示趨化因子CXCL13 分布于神經(jīng)元胞內(nèi)及培養(yǎng)基中；(B) 神經(jīng)元標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白2 (MAP2) 免疫熒光染色；(C) CXCL13 與MAP2 共定位Fig. 2 In vitro cultured spinal dorsal horn neurons express chemokine CXCL13 (A) Immunofluorescence staining showing the distribution of CXCL13 in the neuron and culture medium; (B) Immunofluorescence staining of neuronal marker microtubule-associated protein 2 (MAP2); (C) CXCL13 is co-localized with MAP2.

圖3 CXCL13 與受體CXCR5 結(jié)合并發(fā)生內(nèi)化 (A-C) 分別轉(zhuǎn)染CXCL13-RFP 過表達(dá)質(zhì)粒和GFP 對(duì)照質(zhì)粒后接種到一起的HEK 293T 細(xì)胞；(D-F) 分別轉(zhuǎn)染CXCR5-GFP 過表達(dá)質(zhì)粒和RFP 對(duì)照質(zhì)粒后接種到一起的HEK 293T 細(xì)胞；(G-I) 分別轉(zhuǎn)染CXCL13-RFP 和CXCR5-GFP 過表達(dá)質(zhì)粒后接種到一起的HEK 293T 細(xì)胞Fig. 3 CXCL13 binds to the receptor CXCR5 and is internalized (A-C) Mix of HEK 293T cells that were transfected with CXCL13-RFP overexpression plasmid or GFP control plasmid; (D-F) Mix of HEK 293T cells that were simultaneously transfected with CXCR5-GFP overexpression plasmid or RFP control plasmid; (G-I) Mix of HEK 293T cells that were transfected with CXCL13-RFP or CXCR5-GFP overexpression plasmids.

4.脊髓鞘內(nèi)注射CXCL13 重組因子激活JNK

為進(jìn)一步體內(nèi)驗(yàn)證CXCL13 激活JNK，鞘內(nèi)注射100 ng CXCL13 重組因子0.5 h 或1 h 后，Western Blot 檢測(cè)了脊髓中JNK 磷酸化水平（即p-JNK 的表達(dá)）。結(jié)果顯示，與鞘內(nèi)注射PBS 相比，CXCL13注射后0.5 h，JNK 磷酸化水平顯著升高（見圖5A, B）。注射后1 h，PBS 組和CXCL13 組的JNK 磷酸化水平無顯著性差異（見圖5C, D）。說明在脊髓中CXCL13 對(duì)JNK 的激活也是快速而短暫。

5. 抑制JNK 激活緩解CXCL13 誘導(dǎo)的痛敏反應(yīng)

為了明確脊髓JNK 信號(hào)通路是否參與CXCL13誘導(dǎo)的痛敏反應(yīng)，本研究使用JNK 抑制劑SP600125 (20 nmol) 進(jìn)行鞘內(nèi)注射，30 min 后再鞘內(nèi)注射100 ng的CXCL13，檢測(cè)小鼠痛敏反應(yīng)行為。結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射CXCL13 誘導(dǎo)正常小鼠產(chǎn)生明顯的機(jī)械性觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏，痛敏反應(yīng)持續(xù)6 h 以上；而提前注射SP600125 有效緩解了CXCL13 誘導(dǎo)的熱痛覺過敏（見圖6A）和機(jī)械性觸誘發(fā)痛（見圖6B），說明抑制JNK 激活能夠緩解CXCL13 誘導(dǎo)的痛覺過敏。

圖4 CXCL13 激活星形膠質(zhì)細(xì)胞中JNK (n = 3, ±SEM) (A) p-JNK，GAPDH Western Blot 條帶；(B) p-JNK條帶統(tǒng)計(jì)圖，*P ＜ 0.05，與Control 組相比Fig. 4 CXCL13 activates JNK in astrocytes (n = 3, ±SEM) (A) Western Blot bands for p-JNK and GAPDH; (B) The statistics of p-JNK band. *P ＜ 0.05, compared with the Control group.

圖5 鞘內(nèi)注射CXCL13 重組因子激活脊髓JNK (n = 3, ±SEM) (A) 鞘內(nèi)注射100 ng CXCL13 后0.5 h，p-JNK 和GAPDH Western Blot 條帶圖；(B) p-JNK 條帶統(tǒng)計(jì)圖，*P ＜ 0.05，與PBS 組相比；(C) 鞘內(nèi)注射CXCL13 后1 h，p-JNK 和GAPDH Western Blot 條帶圖；(D) p-JNK 條帶統(tǒng)計(jì)圖，P > 0.05，與PBS 組相比Fig. 5 Intrathecal injection of CXCL13 activates JNK in the spinal cord (n = 3, ±SEM) (A) p-JNK and GAPDH Western Blot 0.5 h after intrathecal injection of CXCL13 (100ng); (B) The statistics for p-JNK band. *P ＜ 0.05, compared with PBS group; (C) p-JNK and GAPDH Western Blot 1 h after intrathecal injection of CXCL13; (D) The statistics for p-JNK band. P > 0.05, compared with PBS group.

圖6 抑制JNK 的激活緩解了CXCL13 誘導(dǎo)的痛敏反應(yīng) (n = 6-7, ±SEM)(A, B) 鞘內(nèi)注射PBS + CXCL13 誘導(dǎo)正常小鼠產(chǎn)生明顯的熱痛敏反應(yīng)和機(jī)械性觸誘發(fā)痛，持續(xù)6 h 以上；提前鞘內(nèi)注射SP600125 有效緩解了CXCL13 引起的小鼠的(A) 熱痛覺過敏和 (B)機(jī)械性觸誘發(fā)痛***P ＜ 0.001，與BL 組相比；#P ＜ 0.05，###P ＜ 0.001，與PBS + CXCL13 組相比Fig. 6 Inhibition of JNK activation alleviates the hyperalgesia induced by CXCL13 (n = 6-7, ±SEM)(A, B) Intrathecal injection of PBS + CXCL13 induced obvious heat hyperalgesia and mechanical allodynia which lasted for more than 6 h; Pretreatment with SP600125 effectively relieved CXCL13 induced heat hyperalgesia (A) and mechanical allodynia (B).***P ＜ 0.001, compared with the BL (baseline); #P ＜ 0.05, ###P ＜ 0.001, compared with the PBS + CXCL13 group.

討 論

本研究采用原代細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、Western Blot、免疫熒光染色以及行為學(xué)檢測(cè)等方法，研究了CXCL13 和CXCR5 的相互作用以及參與痛覺過敏的下游信號(hào)通路。研究結(jié)果顯示：正常小鼠脊髓背角神經(jīng)元表達(dá)分泌趨化因子CXCL13；CXCL13與其受體CXCR5 結(jié)合并發(fā)生內(nèi)化；CXCL13 激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和脊髓中JNK；鞘內(nèi)注射JNK 抑制劑緩解CXCL13 誘導(dǎo)的痛敏反應(yīng)。

趨化因子是一類特殊類型的細(xì)胞因子，因其具有白細(xì)胞趨化性和細(xì)胞因子活性而被命名為“趨化因子”。趨化因子家族共有50 多個(gè)成員，其中30 多個(gè)在脊髓中表達(dá)。近年來的研究揭示了多種趨化因子如CCL2，CCL7，CXCL1，CXCL10，CXCL12，CXCL16，CX3CL1 通過介導(dǎo)神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞間的相互作用參與不同類型的慢性疼痛[6,7]。CXCL13 在正常小鼠腦中不表達(dá)，但在神經(jīng)纖維蛋白沉著癥、自身免疫性脫髓鞘、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、手術(shù)等情況下，CXCL13 在腦中表達(dá)增加[8～11]；在神經(jīng)損傷或糖尿病引起的神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，CXCL13 在脊髓的表達(dá)增加[3,12]。本研究通過體外培養(yǎng)脊髓背角神經(jīng)元，檢測(cè)到CXCL13在神經(jīng)元胞體和突起中呈點(diǎn)狀分布，且在培養(yǎng)基中也有較多的CXCL13 陽性信號(hào)，支持CXCL13 在神經(jīng)元的表達(dá)，并向細(xì)胞外分泌，從而作用于其他細(xì)胞，參與不同類型細(xì)胞間的相互作用。

趨化因子受體是具有7 次跨膜結(jié)構(gòu)的G 蛋白偶聯(lián)受體，共有20 多種類型，少于趨化因子的種類，因此趨化因子和受體并不一一對(duì)應(yīng)。盡管CXCR5被認(rèn)為是CXCL13 的唯一受體，但在CXCR5 基因敲除的小鼠，鞘內(nèi)注射CXCL13 引起的痛覺過敏并沒有完全消除，只是大幅度下降，提示CXCL13可能有其他受體[3]。本研究中用體外轉(zhuǎn)染的方法，觀察到CXCL13 不但向胞外分泌，還進(jìn)入到轉(zhuǎn)染了CXCR5 表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中，并且CXCL13 與CXCR5 形成共標(biāo)顆粒，說明CXCL13 與CXCR5結(jié)合后發(fā)生了內(nèi)化。有文獻(xiàn)報(bào)道，趨化因子受體CCR2 介導(dǎo)沿腦微血管的趨化因子CCL2 的結(jié)合和內(nèi)化[13]，并且內(nèi)化后的CCR2 到達(dá)早期的內(nèi)小體，然后到達(dá)溶酶體降解[14]。CXCL13 和CXCR5 結(jié)合并內(nèi)化后也可能通過溶酶體途徑降解，這仍有待以后進(jìn)一步的研究；CXCL13 的其他受體也需要以后的研究。

以往的研究顯示，趨化因子和受體結(jié)合后使G蛋白的α 亞基和βγ 亞基分離，激活不同的信號(hào)通路, 如MAPK 通路、磷脂酶C (phospholipase C, PLC) 通路和磷脂酰肌醇3 激酶 (phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)通路[7]。JNK 和ERK 是MAPKs 激酶家族的重要成員。脊髓背角中ERK 的激活與外周刺激是否具有傷害性密切相關(guān)，而且ERK 表達(dá)的細(xì)胞類型與外周刺激的類型與時(shí)程相關(guān)。例如，在辣椒素誘導(dǎo)的急性炎癥性疼痛模型中，pERK 表達(dá)于脊髓背角神經(jīng)元中[15]；在神經(jīng)病理性疼痛模型中，pERK 在神經(jīng)損傷初期表達(dá)于神經(jīng)元，之后表達(dá)于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，但后期則表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞中[16]。與ERK 的分布不同，JNK 只表達(dá)于脊髓背角的星形膠質(zhì)細(xì)胞，且在組織炎癥或神經(jīng)損傷后，p-JNK只在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)增加[5]。本課題組以往的研究顯示，鞘內(nèi)注射CXCL13 激活p-ERK 在脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而且MEK 抑制劑PD98059 緩解了CXCL13 誘導(dǎo)的痛覺過敏，說明CXCL13/CXCR5 信號(hào)通路可以通過激活ERK 促進(jìn)痛敏。基于CXCR5 主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞[3]，本實(shí)驗(yàn)研究檢測(cè)了CXCL13 對(duì)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中JNK 的激活，觀察到CXCL13 只在刺激后30 min激活了JNK，在1 h 恢復(fù)正常；鞘內(nèi)注射CXCL13也在30 min 后使脊髓中的p-JNK 顯著增加；而CXCL13 對(duì)ERK 的激活時(shí)間也從30 min 開始，持續(xù)1 h 以 上[3]，說 明CXCL13 對(duì)ERK 和JNK 的 激活時(shí)程不完全相同。以往的研究證明， JNK 抑制劑SP600125 可減輕炎癥性疼痛和神經(jīng)性疼痛[5,17,18]，本研究中行為學(xué)結(jié)果也顯示鞘內(nèi)注射JNK 抑制劑緩解了CXCL13 誘發(fā)的觸誘發(fā)痛，表明JNK 和ERK共同作用介導(dǎo)CXCL13 引起的痛覺過敏。

本研究同時(shí)觀察到鞘內(nèi)注射CXCL13 誘導(dǎo)的熱痛覺過敏持續(xù)了6 h 以上，但JNK 和ERK 都是短暫的激活，提示JNK 和ERK 可能通過下游通路促進(jìn)了疼痛的持續(xù)。以往的研究證明，鞘內(nèi)注射CXCL13 誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP 在6 h 和24 h 的表達(dá)顯著升高，MEK 抑制劑PD98059 抑制CXCL13 引起的GFAP 的表達(dá)增加和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活[3]，說明ERK 可能通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)痛覺過敏的長(zhǎng)時(shí)間存在。而且，ERK 和JNK 磷酸化后均可轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)新的基因的合成，如JNK 的下游基因c-Jun 直接促進(jìn)趨化因子CCL2的表達(dá)，而CCL2 由星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放后通過受體CCR2 增加神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞[19]，從而促進(jìn)中樞敏化和疼痛慢性化。

綜上所述，本研究揭示了CXCL13 與受體CXCR5直接結(jié)合并激活星形膠質(zhì)細(xì)胞中JNK 信號(hào)通路，促進(jìn)痛覺過敏的產(chǎn)生，拓展了CXCL13/CXCR5 參與慢性疼痛的機(jī)制，說明靶向趨化因子和MAPKs 可能緩解慢性疼痛。