POLB基因在動物上的研究進展

李玉龍，翟亞瑩，呂世杰，于 翔，朱肖亭，張志杰，張格陽，張子敬，施巧婷，陳付英，徐照學，王二耀*

(1. 河南省農業(yè)大學動物科技學院， 鄭州 450002；2. 河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所， 鄭州 450002;3. 河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，鄭州 450003.)

DNA聚合酶β(DNA polymerase beta，POLB)屬于DNA聚合酶X家族中的一員，為Weisssbach等[1]在1971年首次發(fā)現(xiàn)。該家族成員還包含Polλ、Polμ以及末端轉移酶TdT等[2]。其主要功能是參與堿基切除修復(base excision repair,BER)系統(tǒng)對DNA損傷進行堿基的切除以及修復。脫氧核糖核酸(Deoxyribonoulecic acid，DNA)是攜帶有合成RNA和蛋白質所必需的遺傳物質，是生物體發(fā)展發(fā)育和正常運轉必不可少的生物大分子，DNA分子的穩(wěn)定性對機體很重要，它是機體內各項生命活動的基礎。但是，細胞內的DNA分子卻常常受到機體內源性與外源性的各種有害信號的誘導致使DNA損傷。DNA損傷在細胞中如不能得到有效修復，易導致細胞的衰老、凋亡以及癌變等后果[3]。Wang等[4]研究證明，POLB在細胞周期調控中起著重要作用。由于POLB表達下降使得上述的癌基因、抑癌基因(如ras、p53和Rb等)受到損傷后卻不能得到正確修復，從而導致細胞周期的紊亂、增殖失控。因此，進一步深入探討POLB在細胞周期調控機制中的作用，為畜禽品種的改善并開發(fā)新的分子輔助標記具有非常重要的意義。

1 POLB基因的結構

在人體中POLB基因定位在第8號染色體的第P11-P12區(qū)，該基因橫跨范圍長達14個外顯子和13個內含子[5]。POLB蛋白分子質量只有39 KD，是真核細胞中最小的DNA多聚酶[6]。從結構上看，人和嚙齒動物POLB蛋白由335個氨基酸組成，在蛋白二級結構中由螺旋(10%)和β片層(50%)組成[7-8]。POLB包含兩大重要的結構域：8 KD的N-末端和31 KD的C-末端，N-末端具有5′-脫氧核糖磷酸裂解酶功能和單鏈DNA結合功能，C-末端具有雙鏈DNA聚合酶催化功能[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，C-末端分為三個亞區(qū)，一個“指部”亞區(qū)、一個“掌部”亞區(qū)、一個“拇指”亞區(qū)。另外，在N-末端內有一個稱為螺旋-發(fā)卡-螺旋(helix-hairpin-helix,HhH)的結構，此為POLB蛋白與DNA作用的重要區(qū)域[10]。1981年，Tanabe 等[8]人從多種哺乳類動物細胞中提取POLB蛋白并測定其分子量和分子結構，結果發(fā)現(xiàn)POLB蛋白在的中細胞中的分子量和分子結構大致相同。Chang等[11]也研究發(fā)現(xiàn)POLB在哺乳類動物中的同源性以及在結構進化過程中相當保守，說明其在哺乳類動物中功能相似。

2 POLB基因的生物學功能

2.1 POLB基因參與DNA損傷修復

POLB基因參與堿基切除修復(Base excision repair，BER)主要發(fā)生在細胞核中。POLB位于BER修復過程的中心位置，起關鍵作用。POLB功能性研究結果顯示，細胞內POLB表達量下降以及其表達產物活性降低，都將致使BER效率減弱，隨著BER效率的減弱細胞對DNA損傷試劑的敏感性也越來越大，進而導致細胞凋亡。POLB的主要功能是擁有DNA 聚合酶活性，除此之外，POLB還可以切除被APE1切割而形成的5′-d RP基團，這是其發(fā)揮了 5′-d RP裂合酶活性的作用。但是，POLB沒有 3′-5′位點的核酸外切酶活性，這導致DNA的突變率大大增加，其原因是其無法及時矯正錯配的堿基[12]。POLB基因缺失、突變或功能的異常往往導致 DNA 損傷修復功能缺失[13-14]。進而細胞內受損傷的 DNA 來不及被修復，基因的不穩(wěn)定性也將提高，從而致使細胞毒性以及突變產生[15]。另外，POLB能跨堿基AP位點(無嘌呤或無嘧啶位點)修復導致缺失及堿基置換型突變，成為保真度最低的DNA聚合酶。P53依賴性DNA的修復或凋亡的觸發(fā)取決于受損DNA積累的程度[16]，P53之所以能夠直接識別DNA損傷位點(包括BER位點)信號并與其結合，那是因為P53與含有1個或4個核苷酸缺失的DNA親和力最強。P53蛋白結構的核心位置和其N-末端都能對BER產生影響，P53通過其N-末端與POLB蛋白相互作用。

2.2 POLB蛋白與支架蛋白結合發(fā)揮功能

參與BER 過程中的修復酶類，只能和DNA受損傷位點結合方能發(fā)揮其修復功能，而支架蛋白能夠將這些修復酶類送到DNA受損傷的位點，并為酶促反應提供條件。增殖細胞核抗原(proliferative cell nuclera antigen，PCNA)是一種重要的支架蛋白，其與DNA合成和細胞增殖息息相關，在細胞有絲分裂周期中，PCNA在細胞分裂的G1后期(第一間隙期)和S期(DNA合成期)被合成，所以PCNA的表達量與細胞增殖關系密切，并能夠在客觀上反映細胞的增殖特性[17]。然而近年來，大量的證據(jù)表明 PCNA 蛋白能夠和多種蛋白結合并且還能夠參與到多條細胞代謝通路過程中去，其中包括細胞周期調控、DNA甲基化、DNA損傷修復等[18]。若POLB上的第137位精氨酸突變，PCNA與POLB的結合能力明顯降低且影響DNA的修復能力[19]。轉基因小鼠研究表明，有R137Q突變體的小鼠細胞其BER 效率會下降且對外源DNA損傷劑抵抗力下降[20]。隨后 Wilson[21]團隊發(fā)現(xiàn)多聚核糖基化聚合酶1( Poly (ADP-ribose) polymerase 1 ,PAPR1)，并發(fā)現(xiàn)其與POLB結合成復合物直接影響 BER。另外研究發(fā)現(xiàn)，PAPR1 與POLB結合后，還能夠通過改變POLB的聚合酶活性也能影響 BER[22]。

2.3 POLB蛋白被翻譯修飾后的功能

POLB被PKC磷酸化會造成POLB聚合酶活性喪失[23]。蛋白質精氨酸甲基轉移酶6 (protein arginine methyltransferases 6,PRMT6)與蛋白質精氨酸甲基轉移酶 1 (protein arginine methyltransferases 1,PRMT1) 都會對POLB進行甲基化修飾，然而，兩者對POLB修飾的位點和影響的功能有所不同。PRMT6 對POLB甲基化修飾能夠顯著提高POLB聚合酶活性，其甲基化的位點為POLB蛋白第 83 位和 152 位的精氨酸[24]。PRMT1對POLB甲基化修飾后，并不能改變POLB自身的 dRP 活力和聚合酶活力，而是阻礙了 PCNA 和POLB的結合，從而降低了DNA的修復能力，其甲基化位點在POLB第 137 位[25]。

2.4 POLB基因參與生長發(fā)育的調控機制

腫瘤細胞之所以能夠無限增殖，其原因是刺激細胞生長信號通路異常，導致信號分子過度表達或誘導凋亡的通路失活，從而引起細胞的轉化、增殖、抵抗細胞凋亡、促進細胞存活。人類、牛和嚙齒動物POLB基因的啟動子似乎主要是由與cAMP反應元件(Cycli-AMP response element,CRE)結合的蛋白質調控的，其中CREB/ATF家族(包括CREB、ATF1/2、CRèME-1等)能與CRE識別，促進POLB表達[26]。CREB的轉錄活性受多種信號轉導通路的調控，經典的調控通路有cAMP-PKA-磷酸化CREB、有絲分裂原激活的蛋白激酶通路(Ras-Raf-MAPK)、P38通路等[27]，CREB可促進基因轉錄表達，這與細胞的增殖、生長和分化等密切相關[28]。蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)在細胞信號傳遞中扮演者重要角色，其能夠調節(jié)細胞的生長和增殖，cAMP反應元件結合蛋白就是PKA重要的下游轉錄因子。研究發(fā)現(xiàn)在食管癌細胞EC9706中PKA-CREB信號通路和p38MAPK-ATF2信號通路處于激活狀態(tài)，兩者共同促進POLB的表達，如果PKA和p38MAPK信號傳導途徑被抑制劑干擾或阻斷，細胞中POLB表達量同樣也會受到抑制，從而導致細胞的增殖受阻、細胞的凋亡數(shù)量增加，對化療藥順鉑的敏感性也增強[29]。朱艷艷[30]利用甲基芐基亞硝胺(n-nitroso methylbenzylamine，NMBA)分別誘導POLB敲除與對照組的小鼠食管上皮組織，經mRNA轉錄組芯片以及差異基因富集分析結果顯示，有33個基因與細胞增殖調控相關，有27個基因與細胞周期調控相關，其中涉及到PI3K-AKT、MAPK-ERK、PLK1/CENP-A[31-32]等信號通路。任瀟毅等[33]采用RNA干擾技術抑制乳癌細胞MC F-7細胞中的POLB的表達，細胞的增殖和侵襲能力均受到顯著抑制。這與沈亮[34]的研究結果一致，其還認為POLB可能通過P13K/Akt信號通路對乳腺癌細胞的增殖和遷移進行調控。

小RNA(microRNA, miRNA)是一類單鏈非編碼 RNA分子,長度通常僅有18～24 bp，其可以與靶信使RNA特異性結合,進而影響基因在轉錄和翻譯水平過程中的表達,發(fā)揮其生物學效應[35]。POLB能夠通過調控miRNA進而調節(jié)細胞周期。李嘉欣[36]研究發(fā)現(xiàn)，POLB通過調控miR-10b和miR-181b進而調節(jié)cyclinA/CDK2影響細胞周期。王媛媛[37]研究表明，POLB可能是miR-499的作用靶點且miR-499與POLB結合，對EC9706和人食管癌細胞系KYSE30細胞有增殖抑制、凋亡促進作用。張滿[38]等研究顯示，上調食管癌細胞 EC9706 中 miR-149 的表達可下調POLB的表達。上調 miR-149-5p 的表達還可抑制腎癌細胞的增殖和遷移,并促進細胞凋亡[39]。

3 POLB基因在動物方面的研究進展

目前關于POLB在動物方面上的研究國內外鮮有報道。Pan等[20]通過POLB基因Rl37Q位點突變的轉基因小鼠與正常同種的小鼠對比，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，POLB基因含有突變的胚胎發(fā)育至15.5 d、17.5 d和19.5 d的體型和體重都顯著低于對照組野生型小鼠的胚胎，同時，利用胚胎成纖維細胞(MEFs)進行細胞水平上的驗證，結果顯示POLB基因含有R137Q位點突變的細胞存在更高的凋亡比例。也有專家研究發(fā)現(xiàn)，POLB基因在MyoD缺失小鼠與正常小鼠的肢體肌肉中差異表達，表明POLB基因可能與的表達與肌肉發(fā)育相關[40]。但是POLB基因通過什么生物學途徑影響牛肌肉發(fā)育仍然需要進一步研究。

4 展望

綜上所述，POLB基因在癌癥中研究的較多，但其與細胞的周期調控息息相關，推測其與動物的生長發(fā)育有一定聯(lián)系，其在肌肉細胞中的調控機制尚不清楚。POLB基因也是近期我們實驗組利用選擇性清除從郟縣紅牛和安格斯牛篩選出來的在生長發(fā)育差異顯著的候選基因，目前正在進行細胞驗證。希望能為郟縣紅?？焖贁U繁提供理論基礎。