抗纖靈對(duì)慢性腎功能衰竭模型Smad2-KO小鼠心臟CoI、CoIII、AngII、TNF-α、IL-6 的影響*

夏 嘉，王 穎，劉銘潔，高雅嬋，陳文浩，何立群△

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海200071；2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；3 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；4 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是指在各種致病因素影響下產(chǎn)生持續(xù)三個(gè)月或三個(gè)月以上的腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，是現(xiàn)今發(fā)病率較高的一種疾病。如果CKD 不能被早發(fā)現(xiàn)、早治療將很快進(jìn)展至慢性腎功能衰竭（chro-nic renal failure，CRF），若腎單位和腎功能持續(xù)進(jìn)行性喪失，會(huì)引發(fā)心血管并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。即便在CKD 早期，心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）的患病率和死亡風(fēng)險(xiǎn)已明顯增加，有的患者在進(jìn)入終末期腎病之前就已死于CVD［1］。故而如何有效防治CKD 引起的CVD，減少全因死亡率，已逐漸成為近年來(lái)全球性的重要醫(yī)療課題。Smad2 基因作為T(mén)GFβ1/Smad 通路的重要成員，對(duì)心、腎纖維化起著不可忽視的作用。本研究旨在觀(guān)察抗纖靈對(duì)Smad2-KO的CRF小鼠心臟病變的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇59 只SPF 級(jí)腎臟上皮細(xì)胞Smad2-KO 小鼠，體質(zhì)量18～21 g，種鼠來(lái)自美國(guó)JACKSON實(shí)驗(yàn)室，由上海南方模式生物研究中心培育繁殖并分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2014-0002，小鼠在室溫26℃、相對(duì)濕度45%、人工12 h晝/夜循環(huán)照明環(huán)境中自由進(jìn)食飼料和飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物抗纖靈藥物組成：桃仁12 g，丹參15 g，當(dāng)歸12 g，酒大黃9 g，懷牛膝15 g，由曙光醫(yī)院中藥房提供，煎煮20～25 min。纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H20040217，規(guī)格：80 mg/粒）。

1.3 儀器與試劑AngII 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（武漢華美生物有限公司，批號(hào)：G11099685）；BCA蛋白定量試劑盒、兔抗小鼠CoⅠ、CoⅢ、TNF-α、IL-6多克隆抗體及二抗HRP標(biāo)記的IgG（武漢博士德生物技術(shù)公司，批號(hào)：24561、53940、78326、10517、81109、17813）；Mini Protean Cell 垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad 公司）；PVDF膜（美國(guó)Millipore 公司）；X 射線(xiàn)膠片（美國(guó)柯達(dá)公司）；Multiskan Ex 型酶標(biāo)儀（上?？埔纳锛夹g(shù)有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模及分組 1）假手術(shù)方法：打開(kāi)腎區(qū)皮膚肌肉并暴露腎臟后再縫合傷口。將18 只假手術(shù)Smad2-KO 小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、抗纖靈假手術(shù)組、纈沙坦假手術(shù)組，每組6 只。2）CRF 小鼠造模方法采用國(guó)際公認(rèn)的5/6 腎臟切除手術(shù)進(jìn)行（platt法）。41只Smad2-KO小鼠在第一次造模至造模2周測(cè)定血肌酐之前共死亡17只。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：2 周后小鼠眼眶取血測(cè)肌酐，若結(jié)果高于假手術(shù)組（P＜0.05）判定為造模成功，結(jié)果造模成功24 只。將24 只CRF 模型Smad2-KO 小鼠隨機(jī)分為模型組、抗纖靈模型組、纈沙坦模型組，每組8只。

1.4.2 給藥方法 根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中小鼠與人的體質(zhì)量計(jì)算比例，按照20 g/kg把抗纖靈復(fù)方配成水煎劑，灌胃前用蒸餾水將藥液稀釋成相應(yīng)的比例，抗纖靈假手術(shù)組、抗纖靈模型組小鼠分別予抗纖靈復(fù)方0.5 mL，每天灌胃。纈沙坦假手術(shù)組、纈沙坦模型組按照纈沙坦的劑量為20 mg/kg配制成混懸液，每天予0.5 mL纈沙坦灌胃。模型組、假手術(shù)組小鼠則每天分別予0.5 mL蒸餾水灌胃。

1.4.3 取材 六組小鼠灌胃8 周后取材。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，假手術(shù)各組Smad2-KO 小鼠未見(jiàn)死亡，模型組、抗纖靈模型組、纈沙坦模型組各有2 只小鼠死亡。各組小鼠眼球摘除取血后，迅速剪開(kāi)胸廓，取心臟，生理鹽水洗凈，吸干多余水分，剪取一部分左心室放入4%多聚甲醛中行HE染色，剩余部分心臟放入冷存管，存放于-80℃冰箱備用。

1.5 小鼠心臟AngⅡ的表達(dá)從-80℃度冰箱中取出心臟組織并加9倍的PBS，在冰水浴中用玻璃研磨器研制成10%的勻漿，以離心半徑：13.5 cm，3500 r/min，離心10 min，取上清液，根據(jù)血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）的Elisa 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

1.6 小鼠心臟CoⅠ、CoⅢ、TNF-α、IL-6的表達(dá)采用免疫印跡（Western blot）法測(cè)定I 型膠原（collagen I，CoI）、Ⅲ型膠原（collagen Ⅲ，CoⅢ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）的蛋白表達(dá)。-80℃低溫保存的心臟組織約20 mg，加入200 mL RIPA裂解液，勻漿研碎，離心半徑：16 cm，10 000 r/min，離心5 min，離心取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，制成含蛋白量相等的上樣液，行SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳。然后將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS 封閉，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜；然后TBST 洗膜5 min，3 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫下?lián)u床上孵育2 h；TBST 洗膜15 min，5次，按化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)顯影、定影，用Photo shop 測(cè)定各蛋白的相對(duì)光密度值（目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)或Tamhane，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心臟HE 染色假手術(shù)組、纈沙坦假手術(shù)組、抗纖靈假手術(shù)組的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)均正常，心肌排列整齊。模型組可見(jiàn)心肌細(xì)胞肥大，心肌排列紊亂、間質(zhì)結(jié)締組織增生；抗纖靈模型組、纈沙坦模型組心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂及間質(zhì)結(jié)締組織增生的情況均較模型組減輕；纈沙坦模型組心肌細(xì)胞肥大改善更明顯。見(jiàn)圖1。

2.2 小鼠心臟CoⅠ、CoⅢ、TNF-α 及IL-6 相對(duì)表達(dá)量Smad2-KO 小鼠假手術(shù)組、纈沙坦假手術(shù)組、抗纖靈假手術(shù)組組間比較，CoⅠ、CoⅢ、TNF-α、IL-6的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組與假手術(shù)組比較，Smad2-KO 小鼠模型組的CoⅠ、CoⅢ、TNF-α 及IL-6 的相對(duì)表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療后，抗纖靈模型組與纈沙坦模型組均能明顯改善Smad2-KO小鼠CoⅠ、CoⅢ、TNF-α 及IL-6 的相對(duì)表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1，圖2—3。

2.3 小鼠心臟AngⅡ含量與假手術(shù)組比較，抗纖靈假手術(shù)組的AngⅡ無(wú)顯著變化（P＞0.05），纈沙坦假手術(shù)組的AngⅡ下降（P＜0.05），模型組小鼠的AngⅡ含量則明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，抗纖靈模型組能改善Smad2-KO小鼠心臟AngⅡ的含量（P＜0.05），纈沙坦模型組能明顯改善Smad2-KO 小鼠心臟AngII 的含量（P＜0.01），纈沙坦模型組在改善AngII 方面優(yōu)于抗纖靈模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 各組小鼠心臟HE染色結(jié)果（HE×400）

表1 各組Smad2-KO小鼠心臟CoI、CoIII、TNF-α、IL-6的相對(duì)表達(dá)量及AngⅡ含量比較（χ±s）

圖2 Smad2-KO小鼠心臟CoⅠ、CoⅢ的相對(duì)表達(dá)量

圖3 Smad2-KO小鼠心臟TNF-α、IL-6相對(duì)表達(dá)量

3 討論

對(duì)中醫(yī)而言，“虛”是CRF 引起CVD 的總病機(jī)，與心、脾、腎三臟相關(guān)，病理因素多涉及瘀血、濕濁、毒邪等。上海市名中醫(yī)何立群教授認(rèn)為：CRF的中醫(yī)發(fā)病機(jī)制的根本在于久病及腎、久病多虛，而久病入絡(luò)、久病必瘀乃本病的標(biāo)實(shí)之所系。血液動(dòng)力學(xué)的改變、凝血機(jī)制的激活、纖溶系統(tǒng)以及體液和交感神經(jīng)系統(tǒng)的異常等都可導(dǎo)致血流不暢、瘀血內(nèi)生，從而引起或加重心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。據(jù)此，何教授提出了活血化瘀、補(bǔ)腎通絡(luò)為主治療本病的原則并創(chuàng)立了抗纖靈復(fù)方。

Smad2 蛋白同Smad3 蛋白相類(lèi)似，Smad2 被認(rèn)為是TGF-β 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的特定前體，它決定了血管平滑肌細(xì)胞是來(lái)源于中胚層或來(lái)源于神經(jīng)脊細(xì)胞的生理上差異［2-3］。Smad3是導(dǎo)致腎臟炎癥和纖維化的關(guān)鍵因子，Smad2 和Smad7 則具有腎臟保護(hù)作用，Smad2 可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制Smad3 磷酸化和核轉(zhuǎn)錄起到抗腎臟纖維化的作用。腎臟Smad2基因的缺失增加了TGF-β1/Smad3 介導(dǎo)的膠原基質(zhì)的表達(dá)和其它諸如腎素、AngⅡ、ACE等致纖維化因子［4-5］。通過(guò)多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)抗纖靈能抑制野生型和Smad2-KO 的CRF 模型小鼠腎組織RAS 及TGF-β1/Smad 通路的過(guò)度表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，抑制膠原纖維的增生，具有改善腎纖維化、保護(hù)腎功能的作用［6-7］。那么抗纖靈對(duì)于腎上皮細(xì)胞Smad2-KO小鼠的CRF心室重構(gòu)是否仍有作用，本研究結(jié)果顯示腎上皮細(xì)胞Smad2-KO 小鼠本身并沒(méi)有心臟結(jié)構(gòu)的變化，需進(jìn)行platt 法造模后才會(huì)出現(xiàn)心室重構(gòu)。對(duì)CRF 小鼠誘導(dǎo)的心室重構(gòu)模型進(jìn)行中藥干預(yù)后，抗纖靈能改善Smad2-KO 的CRF 小鼠心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂及間質(zhì)結(jié)締組織增生的情況，并能降低心臟CoⅠ、CoⅢ、AngⅡ、TNF-α 和IL-6 的表達(dá)，起到改善心室重構(gòu)的作用。

抗纖靈組成中丹參在藥理學(xué)上具有降低血黏度、改善血液流變學(xué)、抗血管硬化［8］及抗菌消炎、減輕心臟負(fù)荷、保護(hù)心肌細(xì)胞［9］、抗心律失常和抗氧化等方面的作用［10］。劉文舉等［11］用丹參酮ⅡA治療心腎綜合征患者，得出該藥可改善心腎綜合征患者全身炎癥狀態(tài)，降低血漿CRP、IL-6、TNF-α的水平，改善心腎功能的結(jié)論。大黃則有一定的強(qiáng)心、降血壓的作用［12］。秦志平［13］證實(shí)大黃水煎劑可改善心力衰竭患者的心功能、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，又可降低左心衰大鼠的BNP 并抑制其心臟擴(kuò)大、提高收縮力。池雪林等［14］報(bào)道，隨著牛膝多糖用藥濃度的增加牛蛙心肌收縮能力也隨之增強(qiáng)，二者的量效關(guān)系明顯。當(dāng)歸可以抗心律失常、抑制心肌細(xì)胞肥大［15-16］和降低血壓，其降壓作用可能通過(guò)抑制AT1R 基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)ERK1/2 的通路實(shí)現(xiàn)［17］。本研究結(jié)果表明，抗纖靈改善Smad2-KO CRF 小鼠心室重構(gòu)的機(jī)制可能與降低心臟CoⅠ、CoⅢ、AngⅡ和炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。