化濁抗纖保肝湯對肝纖維化大鼠的影響及其機制

李瑞東

(邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院，河北 邢臺 054000)

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化濁抗纖保肝湯對肝纖維化大鼠的影響及其機制

李瑞東

(邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院，河北 邢臺 054000)

目的探討化濁抗纖保肝湯對肝纖維化大鼠的影響及其作用機制。方法將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、膈下逐瘀湯組及化濁抗纖Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，每組10只。除正常組外，其余各組均采用豬血誘導(dǎo)大鼠肝纖維化。誘發(fā)肝纖維化同時，模型組給予蒸餾水灌胃至第9周，膈下逐瘀湯組和化濁抗纖Ⅰ組分別給予相應(yīng)藥物灌胃至第9周，化濁抗纖Ⅱ組自造模的第3周、化濁抗纖Ⅲ組自造模的第6周給予化濁抗纖保肝湯灌胃至第9周。檢測各組大鼠血清AST、ALT、HA、LN和PCⅢ水平；取肝組織行HE和Mallory染色，觀察大鼠肝組織病理學(xué)改變；采用免疫組化和Northern blot雜交技術(shù)檢測肝組織中TGF-β1、TIMP-1和MMP-1表達(dá)情況。結(jié)果各造模組大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ水平及肝組織中TGF-β1、TIMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，各給藥組上述指標(biāo)水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；各造模組大鼠肝組織中MMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯低于正常組(P均<0.05)，各給藥組大鼠肝組織中MMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組(P均<0.05)。膈下逐瘀湯組與化濁抗纖Ⅰ組各指標(biāo)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，化濁抗纖Ⅰ組與化濁抗纖Ⅱ組、化濁抗纖Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，化濁抗纖Ⅱ組與化濁抗纖Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論化濁抗纖保肝湯能明顯減輕肝纖維化大鼠肝功能損傷和肝纖維化程度，其可能通過下調(diào)大鼠TGF-β1的表達(dá)而減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，降低大鼠TIMP-1的水平而減輕對MMP-1的抑制作用進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解。

化濁抗纖保肝湯；肝纖維化；膈下逐瘀湯；大鼠

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由于多種原因引起的肝臟炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)肝臟纖維組織異常增生的病理過程，是各種慢性肝病的病理學(xué)基礎(chǔ)，是肝硬化的早期和必經(jīng)階段[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，肝硬化年發(fā)病率達(dá)100/10萬，且每年有3%～6%的人會進(jìn)展為肝癌[3]。因此，如何有效控制肝纖維化的進(jìn)展是防止晚期肝病形成的關(guān)鍵因素。目前西醫(yī)對肝纖維化的研究比較深入，但臨床治療上并無特效良藥；中藥治療肝纖維化的療效較好，顯示出廣泛地開發(fā)和應(yīng)用前景，但其作用機制尚不十分明確，探討中藥治療肝纖維化的機制，對研發(fā)新的抗肝纖維化藥物具有重要意義[4-5]。中藥化濁抗纖保肝湯能解毒化濁、行氣活血、滋陰柔肝，暢通瘀滯肝脈，在肝纖維化患者中具有較高應(yīng)用價值，但其作用機制尚不明確。本研究觀察了中藥化濁抗纖保肝湯對豬血誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型肝功能和肝纖維化指標(biāo)以及肝組織中TGF-β1、TIMP-1和MMP-1表達(dá)的影響，旨在探討化濁抗纖保肝湯對肝纖維化的影響及其可能的作用機制。

1　實驗資料

1.1實驗動物雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，購自中國科學(xué)院斯萊克實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(京)2011-0012。大鼠購回后飼養(yǎng)于本院實驗動物中心，維持室溫(20±2)℃，相對濕度60%，自由攝取固體全價飼料，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后使用。本實驗遵循《實驗動物保護(hù)條例》，對實驗動物進(jìn)行嚴(yán)格的檢驗檢疫和飼育管理。

1.2實驗藥物自擬化濁抗纖保肝湯，由紅景天12 g、田基黃15 g、絞股藍(lán)15 g、黃芩15 g、黃連12 g、三棱12 g、鱉甲15 g、茵陳15 g、虎杖15 g組成。膈下逐瘀湯，由靈脂6 g、當(dāng)歸9 g、川芎6 g、桃仁9 g、丹皮6 g、赤芍6 g、烏藥6 g、延胡索3 g、甘草9 g、香附4.5 g、紅花9 g、枳殼4.5 g組成。方劑經(jīng)2次水煎后，收集合并濾液，減壓濃縮至1.5 g生藥/mL，經(jīng)高壓滅菌后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3造模和給藥方法將60只SD大鼠隨機分為正常組，模型組，膈下逐瘀湯組及化濁抗纖Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，每組10只。除正常組外，其余各組均腹腔注射未經(jīng)滅活的豬血清誘發(fā)大鼠肝纖維化，0.5 mL/kg，每周2次，共6周。誘發(fā)肝纖維化同時，模型組給予蒸餾水灌胃至第9周，膈下逐瘀湯組給予膈下逐瘀湯0.5 mL/(kg·d)灌胃至第9周，化濁抗纖Ⅰ組給予化濁抗纖保肝湯0.5 mL/(kg·d)灌胃至第9周，化濁抗纖Ⅱ組自造模的第3周給予化濁抗纖保肝湯0.5 mL/(kg·d)灌胃至第9周，化濁抗纖Ⅲ組自造模的第6周給予化濁抗纖保肝湯0.5 mL/(kg·d)灌胃至第9周。正常組腹腔注射生理鹽水0.5 mL/只，每周2次，共6周，同時以蒸餾水灌胃至第9周。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1大鼠死亡情況末次灌胃后，統(tǒng)計各組大鼠死亡情況。

1.4.2大鼠肝功能及肝纖維化情況禁食24 h后，取血，分離血清，4 ℃保存?zhèn)溆?，以檢測肝功能(ALT、AST)及肝纖維化( HA、 LN和PCⅢ)指標(biāo)。

1.4.3大鼠肝組織HE和Mallory染色病理表現(xiàn)頸部離斷處死大鼠，暴露肝臟，取肝右葉，經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片后封固。HE染色：4 μm組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，蘇木素染色，1%的HCl乙醇溶液分化，0.2%的氨水返藍(lán)，伊紅染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片,10×10顯微鏡下觀察。Malloy染色：4 μm組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，0.25%高錳酸鉀溶液、2.5%草酸漂白，磷鎢酸蘇木素染色，95%乙醇分化，二甲苯透明，中性樹膠封片，20×20顯微鏡下觀察。

1.4.4大鼠肝組織中TGF-β1、TIMP-1、MMP-1蛋白表達(dá)情況采用免疫組化二步法檢測：4 μm組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)高壓抗原修復(fù)；滴加過氧化物酶阻斷液，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min；滴加10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min；滴加一抗，4 ℃下孵育過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察判定免疫組化結(jié)果。

1.4.5大鼠肝組織中TGF-β1、TIMP-1、MMP-1mRNA表達(dá)情況提取各組大鼠肝組織總RNA，通過Northern blot雜交法檢測各組大鼠TGF-β1、TIMP-1和MMP-1mRNA表達(dá)情況。

2　結(jié)　　果

2.1各組大鼠一般情況實驗結(jié)束時，模型組大鼠死亡3只，剩余7只；化濁抗纖Ⅱ組死亡2只，剩余8只；化濁抗纖Ⅲ組死亡1只，剩余9只。其他組大鼠無死亡。

2.2各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)

2.2.1HE染色表現(xiàn)正常組大鼠肝實質(zhì)細(xì)胞正常，肝小葉完整，條索狀的肝實質(zhì)細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列；模型組大鼠肝細(xì)胞嚴(yán)重腫脹，肝小葉破壞嚴(yán)重，大量肝細(xì)胞死亡，大量肝細(xì)胞脂肪變性呈空泡狀，肝臟匯管區(qū)擴大可見大量纖維結(jié)締組織增生，形成假小葉。膈下逐瘀湯組和化濁抗纖Ⅰ組大鼠肝小葉基本完整，肝細(xì)胞排列基本正常，未見各種明顯病變；化濁抗纖Ⅱ組大鼠肝小葉基本完整，肝細(xì)胞排列基本正常，部分肝細(xì)胞脂肪變性呈空泡狀；化濁抗纖Ⅲ組大鼠肝小葉尚正常，肝細(xì)胞排列尚整齊，許多肝細(xì)胞脂肪變性呈空泡狀，病變區(qū)域較模型組小、較其他各組大，中央靜脈周圍可見空泡樣變性。見圖1～6。

圖1　正常組大鼠肝組織HE染色病理表現(xiàn)(×100)

圖2　模型組大鼠肝組織HE染色病理表現(xiàn)(×100)

圖3　膈下逐瘀湯組大鼠肝組織HE染色病理表現(xiàn)(×100)

圖4　化濁抗纖Ⅰ組大鼠肝組織HE染色病理表現(xiàn)(×100)

2.2.2Malloy染色表現(xiàn)正常組大鼠僅在肝臟匯管區(qū)偶見極少量膠原纖維，但未見纖維結(jié)締組織增生，未形成假小葉；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，大量膠原纖維沉積，形成假小葉；膈下逐瘀湯組和化濁抗纖Ⅰ組大鼠肝小葉基本完整，匯管區(qū)可見極少量纖維細(xì)胞增生；化濁抗纖Ⅱ組大鼠肝小葉基本完整，可見膠原纖維沉積和纖維細(xì)胞增生；化濁抗纖Ⅲ組大鼠可見大量膠原纖維沉積和纖維結(jié)締組織增生。見圖7～12。

圖5　化濁抗纖Ⅱ組大鼠肝組織HE染色病理表現(xiàn)(×100)

圖6　化濁抗纖Ⅲ組大鼠肝組織HE染色病理表現(xiàn)(×100)

圖7　正常組大鼠肝組織Mallory染色病理表現(xiàn)(×400)

圖8　模型組大鼠肝組織Mallory染色病理表現(xiàn)(×400)

2.3各組大鼠血清ALT、AST水平比較模型組及各給藥組大鼠血清ALT、AST水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，各給藥組大鼠血清ALT、AST水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；膈下逐瘀湯組與化濁抗纖Ⅰ組各指標(biāo)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，化濁抗纖Ⅰ組與化濁抗纖Ⅱ組、化濁抗纖Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，化濁抗纖Ⅱ組與化濁抗纖Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

圖9　膈下逐瘀湯組大鼠肝組織Mallory染色病理表現(xiàn)(×400)

圖10　化濁抗纖Ⅰ組大鼠肝組織Mallory染色病理表現(xiàn)(×400)

圖11　化濁抗纖Ⅱ組大鼠肝組織Mallory染色病理表現(xiàn)(×400)

圖12　化濁抗纖Ⅲ組大鼠肝組織Mallory染色病理表現(xiàn)(×400)

表1　各組大鼠血清ALT、AST水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與化濁抗纖Ⅱ組比較，P<0.05；④與化濁抗纖Ⅱ組比較，P<0.05。

2.4各組大鼠血清HA、LN和PCⅢ水平比較模型組及各給藥組大鼠血清HA、LN和PCⅢ水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，各給藥組大鼠血清HA、LN和PCⅢ水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；膈下逐瘀湯組與化濁抗纖Ⅰ組各指標(biāo)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，化濁抗纖Ⅰ組與化濁抗纖Ⅱ組、化濁抗纖Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，化濁抗纖Ⅱ組與化濁抗纖Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

2.5各組大鼠TGF-β1、TIMP-1、MMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平比較模型組及各給藥組大鼠TGF-β1、TIMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，MMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯低于正常組(P均<0.05)。各給藥組TGF-β1、TIMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，MMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組(P均<0.05)。膈下逐瘀湯組與化濁抗纖Ⅰ組各指標(biāo)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，化濁抗纖Ⅰ組與化濁抗纖Ⅱ組、化濁抗纖Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，化濁抗纖Ⅱ組與化濁抗纖Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表3及圖13。

表2　各組大鼠血清HA、LN和PCⅢ水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與化濁抗纖Ⅰ組比較，P<0.05；④與化濁抗纖Ⅱ組比較，P<0.05。

3　討　　論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，肝細(xì)胞受到諸如病毒、乙醇等因素的刺激，導(dǎo)致肝枯否細(xì)胞分泌刺激因子，繼而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，引起細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，從而導(dǎo)致肝纖維化[6]。目前關(guān)于TGF-β1、TIMP-1、MMP-1和肝纖維化發(fā)生關(guān)系研究較多，其中TGF-β1屬于對肝星狀細(xì)胞具有廣泛促進(jìn)作用的活化因子之一，并且能夠在該過程發(fā)生早期對肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用，最終使得細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量沉積于肝臟中，誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生[7]；TIMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑中較為重要的組成部分，其過度表達(dá)可促進(jìn)血管壁和膽管壁周圍間質(zhì)細(xì)胞增生，誘導(dǎo)肝纖維化形成；MMP-1是人類膠原纖維降解的關(guān)鍵因子，其表達(dá)水平越低，ECM沉積越嚴(yán)重，肝纖維化發(fā)生風(fēng)險也越高[8]。由此可知，TGF-β1、TIMP-1過度表達(dá)和MMP-1表達(dá)受抑均在肝纖維化病理改變過程中具有重要推動作用。

表3　各組大鼠TGF-β1、TIMP-1、MMP-1蛋白表達(dá)水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與化濁抗纖Ⅰ組比較，P<0.05；④與化濁抗纖Ⅱ組比較，P<0.05。

A為正常組；B為模型組；C為膈下逐瘀湯組；D為化濁抗纖Ⅰ組；E為化濁抗纖Ⅱ組；F為化濁抗纖Ⅲ組

中醫(yī)理論認(rèn)為肝纖維化的病機為濁毒內(nèi)結(jié)，使肝絡(luò)瘀滯不通，氣血壅滯，肝失濡養(yǎng)，導(dǎo)致堅積形成[9]。故應(yīng)予化濁之法以斷病之根本，行氣活血以暢瘀滯肝脈，滋陰柔肝以滋耗傷之肝陰?；瘽峥估w保肝湯即由此而設(shè)立，方中紅景天益氣扶正，絞股藍(lán)、田基黃清熱毒，利濕化濁，三者共為君藥；黃芩、黃連苦寒燥濕濁，為臣藥；佐以三棱行氣破血，鱉甲滋養(yǎng)肝腎、養(yǎng)血生血；茵陳、虎杖活血、解熱毒、利濕濁，共為佐使?，F(xiàn)代藥理研究表明，田基黃具有增強免疫、抗病毒、抗菌、抗氧化以及保肝等作用，田基黃中的主要成分田基黃苷、槲皮苷、異槲皮苷具有保肝退黃之效[10]。紅景天具有清熱解毒、扶正固本、理氣養(yǎng)血和滋補強身及顯著抗肝纖維化作用[11]。黃芩提取物具有抗腎間質(zhì)纖維化作用[12]，而黃連具有改善糖尿病腎纖維化作用[13]。鱉甲提取物有較強的抗肝纖維化作用，能有效抑制肝炎肝纖維化，改善肝功能[14]。

本研究結(jié)果顯示，各造模組大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ水平及肝組織中TGF-β1、TIMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常組，各給藥組上述指標(biāo)水平均明顯低于模型組；各造模組大鼠肝組織中MMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯低于正常組，各給藥組大鼠肝組織中MMP-1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組。膈下逐瘀湯組與化濁抗纖Ⅰ組各指標(biāo)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，化濁抗纖Ⅰ組與化濁抗纖Ⅱ組、化濁抗纖Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，化濁抗纖Ⅱ組與化濁抗纖Ⅲ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示早期給予化濁抗纖保肝湯能明顯減輕肝纖維化大鼠肝功能損傷和肝纖維化程度，其可能通過下調(diào)大鼠TGF-β1的表達(dá)而減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，降低大鼠TIMP-1的水平而減輕TIMP-1對MMP-1的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解。

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Analysis of the effect and mechanisms of Huazhuo Kangxian decoction on liver fibrosis in rats with hepatitis

LI Ruidong

(The Second Affiliated Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei, China)

Objective It is to investigate the effect and mechanism of Huazhuo Kangxian decoction on hepatitis liver fibrosis in rats. Methods 60 SD rats were randomly divided into normal control group, model control group, positive control group, Huazhuo Kangxian Ⅰ group, Ⅱ group, Ⅲ group, each group had 10 rats. All the rats in every group except in normal group were used to induce liver fibrosis by pig blood. All the groups were treated for 9 weeks by different approach. Liver function (AST, ALT) and serum HA, LN and PCⅢ of the rats were determined ; HE and Mallory staining was used to observe the changes of liver histopathology; immunohistochemistry and Northern Blot hybridization were used to detect the expression of TGF-β1, TIMP-1 and MMP-1. Results The levels of ALT, AST, HA, LN, PCⅢ, TGF-β1had significant differences in each group (P<0.05), the levels in model control group, positive control group, Huazhuo Kangxian Ⅰ group, Ⅱ group and Ⅲ group were significantly higher than that in the control group (P<0.05), the levels in positive control group, Huazhuo Kangxian Ⅰ group, Ⅱ group and Ⅲ group were significantly lower than that in model group (P<0.05). Compared with the positive control group, there was no significant difference in Huazhuo Kangxian Ⅰ group (P>0.05), but the levels increased in Huazhuo Kangxian Ⅱ and Ⅲ group (P<0.05). There were significant differences among Huazhuo Kangxian groups, in group Ⅰ was the lowest, in Ⅱ group was lower, and in Ⅲ group was the highest(P<0.05). The level of MMP-1 had significant differences in each group (P<0.05), the level in model control group, positive control group, Huazhuo Kangxian Ⅰ group, Ⅱ group and Ⅲ group were significantly lower than that in the control group (P<0.05), the level in positive control group, Huazhuo Kangxian Ⅰ group, Ⅱ group and Ⅲ group were significantly higher than that in model group (P<0.05). Compared with the positive control group, there was no significant difference in Huazhuo Kangxian Ⅰ group (P>0.05), but the level increased in Huazhuo Kangxian Ⅱ and Ⅲ group (P<0.05). There were significant differences among Huazhuo Kangxian groups, in group Ⅰ was the highest, in Ⅱ group was higher, and in Ⅲ group was the lowest(P<0.05). Conclusion Huazhuo Kangxian decoction can significantly relieve liver injury and hepatic fibrosis in rat liver. It may be mainly through the following two aspects to improve liver fibrosis in rats: on the one hand, by down-regulating the expression of TGF-β1in rats, reducing extracellular matrix deposition; on the other hand, decreasing TIMP-1 levels in rats, reducing TIMP-1 pair of MMP-1 inhibition, promoting degradation of extracellular matrix.

Huazhuo Kangxian liver decoction; liver fibrosis;impact mechanism

李瑞東，女，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合診治消化系統(tǒng)疾病的研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.17.005

R-332

A

1008-8849(2016)17-1837-05

2015-06-05