Keap1-Nrf2信號通路在角膜急性紫外線損傷防治中的研究進(jìn)展

朱 雷綜述，薛春燕審校

0 引 言

紫外線損傷與多種眼表疾病相關(guān)[1]，電光性眼炎(雪盲)最具代表性，由于角膜上皮、間質(zhì)和內(nèi)皮受損而產(chǎn)生霧霾、水腫和渾濁，伴有強(qiáng)烈的異物感、刺痛、畏光、流淚及瞼痙攣等臨床特征。實驗研究表明，紫外線暴露會導(dǎo)致角膜抗氧化劑的大量減少，從而導(dǎo)致促氧化劑/抗氧化劑失衡。角膜抗氧化保護(hù)能力的降低導(dǎo)致角膜氧化損傷。大量研究討論了Nrf2信號通路在抗氧化損傷中扮演的角色，其激活后可以上調(diào)大量抗氧化基因的表達(dá)，在細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激中起重要作用[2]。目前尚無有關(guān)Nrf2氧化防御通路與紫外線角膜急性損傷防治的研究報道。本文就Nrf2氧化防御通路與角膜急性紫外線損傷發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行綜述，探討目前Nrf2在抗氧化損傷方面的作用以及在紫外線角膜急性損傷治療中的最新進(jìn)展和潛在可能。

1 紫外線角膜損傷

環(huán)境紫外線(ultraviolet, UV)輻射對角膜最常見的急性影響是電光性角膜炎。已有文獻(xiàn)報道，在高原行軍中，有較多發(fā)生雪盲癥的官兵[3]。紫外線損傷眼部主要原因之一為活性氧的生成。

1.1 活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)氧化應(yīng)激是機(jī)體氧化物質(zhì)產(chǎn)生和抗氧化防御之間的不平衡狀態(tài)[4]，引起氧化應(yīng)激的罪魁禍?zhǔn)讋t為ROS，UV暴露可使ROS生成水平高于抗氧化緩沖能力，從而破壞還原-氧化動態(tài)平衡，使細(xì)胞暴露于氧化應(yīng)激狀態(tài)。ROS主要來源于線粒體[5]，包括超氧陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)。線粒體氧化呼吸鏈中氧加電子形成O2·-，隨之兩分子O2·-和一分子H+在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)作用下轉(zhuǎn)換為H2O2和O2。未被正常機(jī)體清理的H2O2又被過渡金屬Fe2+通過Fenton反應(yīng)擊穿，生成高氧化活性的·OH[6]。

1.2 紫外線引起氧化應(yīng)激在健康的眼角膜中，吸收和抵抗紫外線輻射是由含有抗氧化劑(抗氧化酶)的組織液完成的。在低分子量抗氧化劑中，抗壞血酸和生育酚是活性氧的重要清除劑。在高分子量抗氧化劑中，SOD催化超氧化物自由基分解為H2O2和O2，H2O2被谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和過氧化氫酶有效清除。兔角膜細(xì)胞多次暴露于UVB射線后，GSH-Px和SOD活性顯著降低[7]。在Zernii等[8]的實驗中，紫外線照射后的兔角膜丙二醛含量遠(yuǎn)超基線水平，同時SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活性有所下降。上述研究可看出，紫外線暴露后，角膜抗氧化劑含量降低，促氧化劑和氧化劑水平增加，導(dǎo)致抗氧化/氧化失衡。

1.3 氧化應(yīng)激損傷的分子基礎(chǔ)ROS引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核和線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)氧化損傷被認(rèn)為是紫外線誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷角膜的主要分子機(jī)制。低水平的ROS對維持細(xì)胞正常功能有重要作用，包括基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、自我防御[9]。ROS超載影響這些生理進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡或壞死[10]。其以蛋白質(zhì)為主要靶點，通過氨基酸修飾、肽鏈斷裂、蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合等氧化損傷蛋白質(zhì)，尤其是破壞還原型半胱氨酸的結(jié)構(gòu)和功能。·OH和O2·2均可氧化細(xì)胞生物膜上多不飽和脂肪酸，破壞生物膜的完整性，降低膜流動性，阻礙生物膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起細(xì)胞及其內(nèi)在的亞細(xì)胞器廣泛功能障礙、結(jié)構(gòu)破壞。紫外線輻射和氧化產(chǎn)物(尤其是高活性·OH)均將導(dǎo)致DNA雙鏈結(jié)構(gòu)破壞[11]、DNA鏈斷裂，堿基替換等DNA損傷，從而引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，如細(xì)胞周期延遲和細(xì)胞凋亡壞死。mtDNA是獨立于核DNA的含有37個基因的功能基因組，編碼一組對氧化磷酸化至關(guān)重要的基因，其缺失或突變將導(dǎo)致線粒體功能障礙[12]。與核DNA相比，由于更接近線粒體內(nèi)膜，加之mtDNA對氧化應(yīng)激更敏感，因此大多數(shù)遺傳物質(zhì)損傷位于mtDNA中。胞內(nèi)mtDNA突變累積越多，線粒體對抗氧化應(yīng)激越敏感，氧化磷酸化過程越脆弱，產(chǎn)生更多ROS[13]，ROS超載轉(zhuǎn)而造成mtDNA突變不斷累積，形成惡性閉環(huán)。

2 Keap1-Nrf2-ARE信號通路

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核因子E2相關(guān)因子2 (Keap1-Nrf2)系統(tǒng)形成細(xì)胞生物抵御外源性和內(nèi)源性氧化應(yīng)激的主要節(jié)點。Nrf2是該系統(tǒng)順利運(yùn)行關(guān)鍵，上面受著Keap1蛋白的調(diào)控，下面誘導(dǎo)一系列保護(hù)性抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。這些抗氧化、解毒酶在增強(qiáng)機(jī)體抗氧化，抗炎方面起重要作用。通過調(diào)控該系統(tǒng)，增強(qiáng)下游Ⅱ相解毒酶表達(dá)，以期達(dá)到對抗或減輕紫外線氧化應(yīng)激角膜損傷的目的給科研工作者提供了良好的思路。

2.1 Keap1生理狀態(tài)下，Keap1與Nrf2蛋白結(jié)合，使Nrf2蛋白錨定于細(xì)胞質(zhì)，無法入核，此時Keap1與CUL3、多泛素化Nrf2形成泛素E3連接酶復(fù)合體[14]，協(xié)助Nrf2泛素化和降解，正是這種結(jié)構(gòu)性降解使胞內(nèi)Nrf2濃度和活性維持在較低水平，因此Keap1也被稱為Nrf2負(fù)調(diào)控蛋白。一旦細(xì)胞內(nèi)ROS或親電子體出現(xiàn)，與Keap1蛋白上半胱氨酸殘基結(jié)合，Keap1構(gòu)象改變，Nrf2降解減弱，半衰期延長，入核增加。此時經(jīng)過氧化應(yīng)激改變構(gòu)象的Keap1與此前截然相反，表現(xiàn)為抑制Nrf2泛素化，提高了胞質(zhì)內(nèi)Nrf2豐度。綜上所述，Keap1-CUL3泛素連接酶復(fù)合物的活性控制著Nrf2蛋白水平，Keap1充當(dāng)閘門角色[14]，當(dāng)閘門被修改和打開時，Nrf2才會進(jìn)入細(xì)胞核。

2.2 Nrf2Nrf2是一種氧化還原敏感的堿性亮氨酸拉鏈蛋白,屬于帽和領(lǐng)(cap‘n’collar, CNC)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，調(diào)節(jié)多種抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[15]。6個高保守的環(huán)氧氯丙烷同源結(jié)構(gòu)(Neh)在Nrf2功能中發(fā)揮不同作用[17]。Nrf2的存在對維持細(xì)胞正常生理功能至關(guān)重要，其誘導(dǎo)劑保護(hù)皮膚免受紫外線輻射引起的皮炎損害[16]，反之基因敲除Nrf2的細(xì)胞對外源性刺激敏感性增強(qiáng)[17]。一項對裸鼴鼠的研究表明較高的Nrf2活性與其最長壽命呈正相關(guān)[18]，由此研究人員分析裸鼴鼠長壽原因是Nrf2蛋白對氧化應(yīng)激作出的有效反應(yīng)，這一作用已經(jīng)在很多基因編輯的小鼠模型中得到證實，無論是Nrf2或是聯(lián)合其他基因敲除的小鼠，因此Nrf2被稱為是“健康的守護(hù)者和物種長壽的門衛(wèi)”。

2.3 抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)對誘導(dǎo)編碼Ⅱ相酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)起關(guān)鍵作用的順式作用元件被命名為ARE，包含特定堿基序列(5′-TTGACnnGC-3′)。Nrf2入核后必須通過與小Maf蛋白二聚化，才能與ARE結(jié)合激活Ⅱ相酶基因轉(zhuǎn)錄[19]，上調(diào)下游Ⅱ相酶包括NADPH 醌氧化還原酶1 (NADPH quinone oxidoreductase-1, NQO1)、血紅素加氧酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)的表達(dá)。

3 Keap1-Nrf2信號通路與紫外線角膜損傷

Nrf2信號通路是一個至關(guān)重要的抗氧化防御機(jī)制，通過消除ROS，以維持胞內(nèi)氧化還原平衡。近年來，Nrf2通路的各種激活劑不斷被報道，在眼表疾病中的氧化應(yīng)激保護(hù)作用也已在以下眼部疾病的研究中得到闡明:測流香煙煙霧(sidestream cigarette smoke, SCS)暴露引起的干眼[20]和翼狀胬肉[22-23]。但是在紫外線角膜急性損傷中，關(guān)于Nrf2介導(dǎo)的抗氧化防御機(jī)制和相關(guān)藥物實驗的報道很少。

3.1 Nrf2及其誘導(dǎo)劑與氧化應(yīng)激的對抗多年來，天然產(chǎn)物為潛在的治療藥物的發(fā)現(xiàn)提供了有效的資源。隨著天然產(chǎn)物單體組分分離純化技術(shù)的不斷完善，天然產(chǎn)物中特定的單個成分作為Nrf2激活劑，因其優(yōu)異的功效而備受關(guān)注。其中，許多天然多酚[21-23]抑制ROS的產(chǎn)生，增加Nrf2的核易位和DNA結(jié)合能力，干擾Keap1-Nrf2相互作用，促進(jìn)Keap1泛素化，最終維持機(jī)體的生理平衡。在Ma等[17]的實驗中，用H2O2處理人白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞(human vitiligo melanocytes, HVMs)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位顯著降低、mtDNA累積增多、ROS水平以及細(xì)胞凋亡率增加，這與之前探討的紫外線通過氧化應(yīng)激引起細(xì)胞損傷的分子機(jī)制近乎相同。在上述實驗組中加入黃岑素后，發(fā)現(xiàn)黃芩素促進(jìn)了Nrf2從胞漿向細(xì)胞核的移位，并增加了HVMs細(xì)胞中Nrf2及其下游基因HO-1的表達(dá)。在Nrf2基因敲除組中，HVMs細(xì)胞更易受到H2O2的刺激，并且用黃芩素去處理Nrf2基因敲除細(xì)胞組后，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并未受到明顯抑制。這些結(jié)果表明，黃芩素對H2O2誘導(dǎo)的HVMs細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用是通過Nrf2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)的。

白藜蘆醇(resveratrol, RSV)廣泛分布于各種食品中，特別是葡萄，具有抗氧化性能。Liu等[24]發(fā)現(xiàn)RSV能有效提高紫外線A(ultraviolet A, UVA)暴露后人角質(zhì)形成細(xì)胞(human keratinocytes, HaCaT)的活性，保護(hù)HaCaT細(xì)胞免受UVA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。此外，Palsamy等[25]研究證實RSV將糖尿病大鼠腎臟中Nrf2/Keap1及其下游調(diào)控蛋白的表達(dá)正?；?，可有效保護(hù)腎臟免受高血糖介導(dǎo)的氧化損傷。對天然產(chǎn)物的深入研究，可能為Keap1-Nrf2抗氧化應(yīng)激的新型治療藥物的設(shè)計提供指導(dǎo)。

3.2 Nrf2修復(fù)角膜急性紫外線損傷

3.2.1 Nrf2促進(jìn)角膜自愈大量的暴露于紫外線，引起角膜鱗狀上皮細(xì)胞脫落，角膜上皮層變薄，嚴(yán)重者角膜上皮層完全脫落[26]。研究人員在角膜損傷模型鼠中用Nrf2特異性siRNA敲除Nrf2基因，發(fā)現(xiàn)敲除組角膜上皮細(xì)胞的遷移明顯延遲，角膜愈合緩慢[27]。相反，用Keap1特異性siRNA敲除Keap1基因，角膜上皮細(xì)胞遷移加快，HO-1和NQO1表達(dá)增加。同樣，大量研究表明Nrf2激活劑促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，加快角膜傷口愈合[28,29]。因活性氧延遲角膜上皮細(xì)胞修復(fù)[30]，Nrf2調(diào)控角膜上皮細(xì)胞遷移促進(jìn)角膜愈合的機(jī)制可能主要還是因為其獨特的抗氧化性。

圓錐角膜(keratoconus，KC)是一種常見的退行性角膜擴(kuò)張疾病，其特征為雙側(cè)角膜進(jìn)行性變薄和擴(kuò)張，表現(xiàn)為圓錐形凸起。諸多研究表明ROS的過度產(chǎn)生是KC病的關(guān)鍵因素[31-32]，在Liu等[33]的實驗中同樣得到證實。通過對KC兔模型眼新鮮角膜進(jìn)行了檢測，與對照組相比，KC角膜ROS顯著增加，中央角膜厚度顯著變薄，而這些變化可通過蘿卜硫素(Sulforaphane, SFN)處理中和或逆轉(zhuǎn)。在SFN處理組中，KC角膜中NADPH氧化酶水平下降，Nrf2和HO-1表達(dá)增多，如若加入HO-1抑制劑(鋅原卟啉IX)可抑制SF對KC角膜的保護(hù)作用，因此，該研究證明SF對KC角膜的修復(fù)作用至少部分是通過Nrf2抗氧化途徑實現(xiàn)的。

3.2.2 Nrf2治療紫外線角膜損傷潛能越來越多的證據(jù)表明，Nrf2在保護(hù)角膜免受紫外線氧化應(yīng)激損傷中扮演不可或缺的角色?？紤]到Nrf2在氧化損傷中的作用以及在角膜損傷過程中的調(diào)節(jié)改變，因此認(rèn)為Nrf2可成為一個潛在的靶點來保護(hù)角膜免受紫外線的損傷。

研究人員用紫外線照射兔角膜8～10 h后立即取下角膜進(jìn)行評估以觀測角膜對UV的早期反應(yīng)[34]，通過測量氧化線粒體黃素(oxidized mitochondrial flavins, ox-Fvm)來量化細(xì)胞內(nèi)氧化水平，暴露組角膜上皮ox-Fvm信號約是對照組4.5倍，證實UV暴露增加了角膜氧化壓力。通過對8-OHdG(DNA氧化損傷主要標(biāo)志物)測量發(fā)現(xiàn)，紫外線照射的眼睛角膜上皮細(xì)胞線粒體內(nèi)8-OHdG的水平顯著低于未受照射組2倍，這似乎與之前提到的線粒體DNA對氧化應(yīng)激更敏感相悖。研究人員分析，UV暴露確可引起上皮細(xì)胞內(nèi)顯著氧化，但在線粒體中，這種氧化損傷被線粒體內(nèi)增加了3.3倍的NADPH所抵消。NADPH是維持胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(G-SH)水平所必須的，G-SH積聚使得角膜對氧化還原狀態(tài)動態(tài)波動具有高度敏感性，給予細(xì)胞以快速反應(yīng)能力。作者認(rèn)為，在UV照射早期，NADPH濃度增加、G-SH積聚從而調(diào)節(jié)了抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而有效限制了UV對角膜的毒性進(jìn)展。

以上實驗證明了紫外線輻射早期階段，細(xì)胞內(nèi)驚人的抗氧化能力，表現(xiàn)為還原產(chǎn)物多于氧化產(chǎn)物，但在紫外線損傷后期，氧化大于還原的情況最是常見。Nrf2通過嚴(yán)格控制G-SH水平，確保細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的水平保持不變，以及上調(diào)生成NADPH的關(guān)鍵酶的表達(dá)，如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶1，增加NADPH含量[35]，來緩解甚至逆轉(zhuǎn)后期細(xì)胞氧化超載的狀態(tài)。通過誘導(dǎo)劑喚醒Nrf2-ARE信號通路激發(fā)細(xì)胞抗氧化潛力，使細(xì)胞提前進(jìn)入紫外線輻射早期階段或者將后期的糟糕處境逆轉(zhuǎn)為早期強(qiáng)還原狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防或者治療電光性眼炎的目的，這仍然需要我們進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 語

氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)變性、DNA損傷、脂質(zhì)過氧化和隨之而來的細(xì)胞凋亡和脫落是紫外線角膜損傷的主要特征。紫外線損傷角膜的機(jī)制有待得到全面闡述，本文主要探討了氧化應(yīng)激損傷機(jī)制。Nrf2是對抗氧化應(yīng)激的內(nèi)在防御機(jī)制，在氧化條件下被激活，導(dǎo)致大量細(xì)胞保護(hù)和解毒基因的表達(dá)，因此Nrf2信號通路有望在紫外線角膜損傷預(yù)防和治療上產(chǎn)生重大影響。綜上所述，Nrf2-Keap1-ARE信號通路是一個有前途的抗紫外線氧化應(yīng)激靶點，研制以Nrf2-ARE信號通路為靶點的藥物，以更方便、安全、快速、高效的方式緩解乃至及早修復(fù)紫外線給角膜帶來的損傷，為進(jìn)行高原等強(qiáng)度紫外線環(huán)境訓(xùn)練提供強(qiáng)有力的保障。