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    淚液特異性IgA檢測診斷單純皰疹病毒性角膜炎的初步研究△

    2021-03-26 11:06:22王朱健黃霏霏龔一帆湯荔曹文俊張朝然
    中國眼耳鼻喉科雜志 2021年2期
    關(guān)鍵詞:淚液上皮角膜

    王朱健 黃霏霏 龔一帆 湯荔 曹文俊 張朝然

    (1.復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院檢驗科 上海 200031;2. 復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031)

    單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是當今世界上危害最嚴重的感染性眼病之一,由單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)感染所引起,因其致盲的病例數(shù)可占角膜病致盲的63.2%,而且近年來由于抗生素、激素及其他免疫抑制劑的廣泛應用,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1-2]。目前臨床上對HSK主要還是依靠病史、典型癥狀和角膜病變的形態(tài)特征來進行診斷,但HSK的臨床表現(xiàn)復雜多樣,常不典型,與其他一些角膜炎相混淆,容易造成誤診或漏診。因此需要一種無創(chuàng)、快速、靈敏、經(jīng)濟的檢測方法來為HSK提供實驗室輔助診斷。

    聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)檢測淚液中HSV DNA來診斷HSK國內(nèi)外已有報道[3-5],然而陽性率并不高,且容易受HSK臨床類型及抗病毒治療影響,需要淚液HSV特異性抗體檢測作為補充。目前淚液HSV特異性抗體的研究較少,且缺少臨床判斷標準及系統(tǒng)性的診斷性能評估。我們檢測了105例HSK患者淚液中的HSV特異性免疫球蛋白A(HSV-IgA)濃度,評估淚液HSV-IgA檢測對HSK診斷的臨床價值。

    1 資料與方法

    1.1 資料 病例組淚液標本來自2013年9月~2019年3月本院就診患者,其中臨床診斷為單眼HSK患者105例,成功收集患眼淚液標本105份(作為患眼組),健眼淚液89份(作為健眼組)。在HSK患者中根據(jù)患眼角膜上皮熒光染色情況又分為上皮染色組(77例)及上皮完好組(28例)。另收集73例患有其他眼表疾病(瞼緣炎相關(guān)性角結(jié)膜病變、真菌性角膜炎、角膜白斑、翼狀胬肉等)的淚液73份,作為對照組。所有患者進入研究隊列前了解本研究的過程和目的,并簽署知情同意書。

    1.2 方法

    1.2.1 淚液的采集與保存 用直徑0.5 mm的聚乙烯塑料毛細管置于下穹隆部結(jié)膜囊,利用虹吸作用采得雙眼淚液5~20 μL,分別打入eppendorf管,放置-80 ℃冰箱保存待檢。

    1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗 HSV-IgA檢測試劑盒購自Virion/ Serion (德國)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA) classic,試驗嚴格按照試劑說明書進行操作。淚液中的HSV-IgA水平以試驗結(jié)果的OD值根據(jù)試劑盒提供的標準曲線計算得出,單位為U/mL。

    1.2.3 主要儀器 TECAN sunrise酶標儀(TECAN公司,瑞士)。

    1.3 統(tǒng)計學處理 應用MedCalc 15.8統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析,采用Kolmogorov-Smirnov 法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗,并使用Mann-Whitney U 非參數(shù)檢驗比較2組間差異,2組間分類變量比較采用四格表χ2檢驗,通過受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve,ROC 曲線)對檢測指標進行診斷性能分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

    2 結(jié)果

    105例HSK患者,年齡8~83歲,平均年齡53歲,中位年齡57歲,其中男性72例、女性33例;73例對照組年齡7~74歲,平均年齡43歲,中位年齡46歲,其中男性42例、女性31例。病例與對照組間年齡(Z=1.308,P=0.190 9)和性別(χ2=1.824,P=0.176 8)差異均無統(tǒng)計學意義。

    HSK患者患眼、健眼以及對照組的淚液HSV-IgA水平比較及檢測結(jié)果見表1。患眼組淚液中的HSV-IgA水平要明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(Z=6.521,P<0.000 1),也顯著高于健眼組(Z=5.226,P<0.000 1)。健眼組淚液HSV-IgA水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.317,P=0.1880 )。

    淚液HSV-IgA的ROC曲線分析見圖1。通過ROC曲線分析,當淚液HSV-IgA臨床判斷值為9 U/mL時,可獲得最大約登指數(shù)0.573 1,敏感度為72.38%,特異度為84.93%,曲 線 下 面 積(area under curve,AUC)為0.788(P<0.000 1,95%CI:0.720~ 0.845)。

    表1 患者患眼、健眼、對照組淚液中HSV-IgA的檢測結(jié)果

    圖1 HSK患者淚液HSV-IgA的ROC曲線

    HSK患者按角膜上皮完整性分為上皮完好組及上皮染色組2組,上皮染色組HSV-IgA水平為(182.78±636.36)U/mL,明顯高于上皮完好組的(21.33± 31.18),差異有統(tǒng)計學意義(Z=3.000,P=0.002 7)。以>9 U/mL作為陽性判斷值,上皮染色組陽性率為77.92%,上皮完好組陽性率為57.14%,經(jīng)χ2檢驗陽性率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.456,P=0.063 0)。上皮染色組的陽性預測值(positive predict value,PPV)及陰性預測值(negative predict value,NPV)分別為84.51%和78.48%,而上皮完好組的PPV及NPV分別為59.26%和83.78%。上皮完好及上皮染色的2類HSK分別進行ROC分析,獲得最優(yōu)臨床判斷值均為9 U/mL,曲線下面積分別為0.664和0.833。

    3 討論

    角膜上皮刮片進行病毒分離培養(yǎng)是HSV檢測的金標準,但細胞培養(yǎng)費時、費事,角膜刮片取材困難且有風險,故在臨床應用上受到限制。隨著現(xiàn)代分子生物學及免疫學檢測技術(shù)的發(fā)展,淚液檢測逐漸成為輔助眼表疾病診療的有效方法,具有采樣安全、操作簡便、患者依從性好、可多次采集、便于隨訪等優(yōu)點。HSK患者角膜上皮中的HSV可復制并釋放到淚液中,淚腺中的漿細胞受HSV刺激可合成大量的抗HSV的IgA,在發(fā)作的3~5 d內(nèi)達到峰值,產(chǎn)生的IgA通過上皮細胞的免疫球蛋白受體分泌到淚液中,構(gòu)成了眼免疫中一個非常重要的抗感染機制[6]。Pedersen等[7]最早提出淚液中的HSV-IgA可作為HSK一個診斷參考指標,隨后的研究[8-11]報道也支持淚液的HSV-IgA檢測在HSK中的診斷價值。

    Shoji等[9]采用Schirmer試紙條法采集淚液檢測HSVsIgA,靈敏度和特異度分別為49.2%和82.6%。我們的檢測方法靈敏度為72.38%,特異度為84.93%,靈敏度要稍高于Shoji等的結(jié)果,可能與淚液采集及處理方法、陽性判斷值的選擇、病例數(shù)或病例的臨床類型有關(guān)。Schirmer試紙和毛細管采集淚液以及樣本保存和處理方法對檢測結(jié)果的影響有待于我們后續(xù)的研究結(jié)果。ROC曲線顯示AUC為0.788,說明通過檢測淚液中HSV-IgA的水平可有效區(qū)別HSK及非HSK角膜炎。淚液中HSV-IgA的顯著升高可高度提示HSK風險,為HSK的診斷及鑒別診斷提供依據(jù)。我們通過HSK病例及對照病例的ROC曲線分析得出淚液中HSV-IgA的最優(yōu)臨床界定值為9 U/mL,可為后續(xù)臨床快速診斷試紙條的研發(fā)提供參考。此外,淚液HSV-IgA的檢測經(jīng)濟、簡便,也更適合在臨床推廣應用。

    本研究結(jié)果的特異度為84.93%,即對照組有15.07%比例的眼表現(xiàn)淚液HSV-IgA陽性,這些眼中的HSV-IgA可能來源于外周血。有研究[10]顯示淚液中的HSV-IgA水平與血清HSV-IgA水平存在著正相關(guān),可能與M細胞的轉(zhuǎn)運有關(guān)。當外周血中存在著較高的HSV-IgA濃度時,則有可能引起淚液中IgA的相應增高,從而影響淚液HSV-IgA診斷性能。如何通過淚液/血清的比例校正公式來判斷淚液中HSV-IgA的局部增生,進一步提高診斷效率也是需要研究的問題。

    試驗結(jié)果中上皮染色組的HSV-IgA要顯著高于上皮完好組,說明上皮損傷的HSK有更強烈的局部黏膜免疫反應,可能是由于上皮損傷的角膜中存在著更活躍的病毒復制,產(chǎn)生更多的病毒抗原刺激淚腺分泌IgA。這提示淚液中HSV-IgA這一指標不僅能用于診斷,抗體水平的高低可能與疾病進展、預后相關(guān),對HSK療效及復發(fā)預測的臨床價值有待更多病例及時間隨訪觀察。

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