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    縫隙連接蛋白43在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用

    2022-01-01 10:03:38石瑤瑤崔玉雙高宏程陳晨
    中國眼耳鼻喉科雜志 2021年2期
    關(guān)鍵詞:縫隙連接星形膠質(zhì)

    石瑤瑤 崔玉雙 高宏程 陳晨

    [1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)研究生院 濟(jì)南 250117;2.臨沂市人民醫(yī)院眼科 臨沂 276000;3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 濰坊 261000]

    糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,一直以來都是研究熱點(diǎn)。DR通常被認(rèn)為是視網(wǎng)膜的微血管病變,它涉及血管壁的變化、毛細(xì)血管阻塞,從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜滲漏、缺血、視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡、炎癥和新生血管形成??p隙連接蛋白(connexin,Cx)廣泛存在于視網(wǎng)膜細(xì)胞中,2個(gè)相鄰細(xì)胞通過Cx形成縫隙連接通道,允許細(xì)胞之間直接信號交流,對維持細(xì)胞正常的生理功能意義重大。Cx43通道特性的破壞被認(rèn)為是視網(wǎng)膜疾病病理生理學(xué)的一部分[1]。有研究發(fā)現(xiàn),包括視網(wǎng)膜疾病在內(nèi),大多數(shù)易受Cx43介導(dǎo)損傷的疾病,有2個(gè)共同的病理特征:慢性炎癥和血管破裂。然而,目前還不清楚通過Cx43通道介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊和細(xì)胞間微環(huán)境的改變是如何與DR的發(fā)展聯(lián)系在一起的。現(xiàn)將近年來有關(guān)Cx43在DR發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展綜述如下。

    1 Cx和縫隙連接通道

    Cx是一個(gè)多基因蛋白質(zhì)家族,相對分子質(zhì)量為26~70 kDa。已在哺乳動物中鑒定出各種縫隙連接蛋白基因,這些基因分為2個(gè)主要譜系:i類或β類(例如Cx 26、30、31、31.1和32);和ii類 或α組(例 如Cx 33、37、40、43和46)。人類基因組中有21種不同的連接蛋白同種型,每種Cx都是根據(jù)其分子量命名的。6個(gè)Cx亞單位寡聚成六聚體,稱為半通道或連接子。1個(gè)完整的縫隙連接通道由2個(gè)相鄰細(xì)胞的半通道對接產(chǎn)生,允許細(xì)胞之間直接信號交流,稱為細(xì)胞間縫隙連接通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)??p隙連接以“斑塊”的形式存在,在幾個(gè)到幾千個(gè)單獨(dú)的縫隙連接通道之間形成聚集體。形成半通道的連接蛋白可以是相同或不同類型的亞基。此外,對接在一起形成縫隙連接的2個(gè)半通道可以是相同或不同類型的六聚體。

    縫隙連接通道可透過直徑約1 kDa 或1.5 nm的分子,并允許離子、代謝物和信號分子的快速交換。這些通道可以通過各種生理刺激和實(shí)驗(yàn)干預(yù)來打開和關(guān)閉。幾個(gè)連接蛋白基因的靶向敲除模型也被用來證明這些通道對正常細(xì)胞生理學(xué)的功能意義。研究[1]表明,縫隙連接對許多細(xì)胞過程都很重要,包括細(xì)胞間的電耦合,并且能夠在多個(gè)細(xì)胞間傳達(dá)協(xié)同反應(yīng)信號。在不同的連接蛋白同種類型中,Cx43在人體中最常見。它由包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和心臟細(xì)胞在內(nèi)的不同細(xì)胞類型表達(dá),并與影響不同器官系統(tǒng)的疾病有關(guān)。Cx43縫隙連接通道已被證明在炎癥、細(xì)胞遷移和組織收縮中發(fā)揮作用[2]。

    2 高糖環(huán)境下對視網(wǎng)膜細(xì)胞中Cx43表達(dá)及其介導(dǎo)GJIC的影響

    2.1 高糖下視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞中Cx43的表達(dá) 高糖(high glucose,HG)條件可顯著降低Cx43的表達(dá)和GJIC活性,同時(shí)降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中閉鎖連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)和閉合蛋白(OCCLUDIN)的表達(dá)[3]。此外,在正常葡萄糖濃度培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞中使用siRNA下調(diào)Cx43表達(dá),降低ZO-1和OCCLUDIN表達(dá),并增加細(xì)胞單層通透性。重要的是,當(dāng)在HG條件下生長的細(xì)胞用Cx43質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí),可以消除HG誘導(dǎo)的Cx43下調(diào),并將Cx43表達(dá)提高到接近正常水平,觀察到細(xì)胞單層通透性顯著降低。當(dāng)周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí),與在正常葡萄糖濃度培養(yǎng)基中生長的斑塊相比,在HG條件下Cx43斑塊的數(shù)量減少。此外,視網(wǎng)膜周細(xì)胞中Cx43水平降低顯示出GJIC活性降低。Huang等[4]發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠房水和HG處理的視網(wǎng)膜母細(xì)胞培養(yǎng)基中的ADMA水平升高,通過增加周細(xì)胞的通透性和凋亡、Cx43的下調(diào)和GJIC的抑制而導(dǎo)致DR中血視網(wǎng)膜屏障(blood retinal barrier,BRB)的破壞。Cx43下調(diào)可能通過損害緊密連接蛋白的表達(dá)來促進(jìn)血管通透性的發(fā)展。連接蛋白這種非傳統(tǒng)功能的異常行為獨(dú)立于GJIC,可能會導(dǎo)致DR中視網(wǎng)膜血管的通透性增加。這些結(jié)果表明HG條件下調(diào)Cx43表達(dá),并損害周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的GJIC活性在DR中發(fā)揮作用。

    2.2 HG下視網(wǎng)膜müller細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43的表達(dá) 在HG培養(yǎng)條件下,müller細(xì)胞的單一培養(yǎng)物以及müller細(xì)胞和周細(xì)胞的共培養(yǎng)物中GJIC活性均顯著降低[5]。這些結(jié)果提供了müller細(xì)胞之間以及müller細(xì)胞和周細(xì)胞之間的溝通在HG條件下受到損害的證據(jù)。此外,GJIC活性降低促進(jìn)了這些細(xì)胞的凋亡,類似于以前關(guān)于視網(wǎng)膜血管細(xì)胞的報(bào)道。因此,HG誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜müller細(xì)胞中Cx43異常下調(diào)可能促進(jìn)DR相關(guān)的神經(jīng)、血管穩(wěn)態(tài)的破壞。

    Cx43在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),將過量的細(xì)胞外K+通過細(xì)胞質(zhì)重新分配到由縫隙連接的邊緣星形膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中,有助于維持局部穩(wěn)態(tài)。HG和糖尿病至少部分通過下調(diào)Cx43的表達(dá)來削弱腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的GJIC[6]。這表明,糖尿病介導(dǎo)的Cx43通道下調(diào)損害了星形膠質(zhì)細(xì)胞之間縫隙連接的形成,阻礙了細(xì)胞間的交流,從而抑制了細(xì)胞存活,最終導(dǎo)致糖尿病早期可見的星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失。此外,研究[7]表明,星形膠質(zhì)細(xì)胞可能在早期DR血管系統(tǒng)和視網(wǎng)膜內(nèi)部功能障礙的變化中起著關(guān)鍵的作用。

    2.3 HG下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中Cx43的表達(dá) 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮形成內(nèi)部BRB,視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞形成外部BRB。在慢性高血糖應(yīng)激中,RPE細(xì)胞可能經(jīng)歷緩慢和漸進(jìn)的降解,導(dǎo)致外部BRB受損和中樞視力喪失。RPE細(xì)胞頂端的緊密連接在調(diào)節(jié)屏障中十分重要。然而,糖尿病損害了RPE細(xì)胞中緊密連接的超微結(jié)構(gòu)完整性,導(dǎo)致血管過度滲漏。有趣的是,大多數(shù)縫隙連接位于RPE細(xì)胞的緊密連接中,這表明縫隙連接與緊密連接的相互作用在RPE中可能很重要。HG顯著降低了大鼠RPE細(xì)胞中總細(xì)胞Cx43水平,并損害了GJIC活性。有趣的是,一種叫作反式白藜蘆醇的化合物被發(fā)現(xiàn)可以保護(hù)RPE細(xì)胞免受HG誘導(dǎo)的炎癥、Cx43下調(diào)和GJIC降解[8]。因此,靶向阻止RPE細(xì)胞中Cx43下調(diào)可能對維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)外BRB具有治療價(jià)值。

    2.4 血管內(nèi)皮生長因子激活Cx43的磷酸化 Cx的生物合成是一個(gè)復(fù)雜過程,涉及特定Cx基因的轉(zhuǎn)錄、運(yùn)輸、組裝以及縫隙連接從細(xì)胞表面的形成和去除。Cx43特定位點(diǎn)的磷酸化可能在Cx43通道內(nèi)化和降解中起調(diào)節(jié)作用,從而影響GJIC。此外,連接蛋白磷酸化的作用可能因細(xì)胞類型、細(xì)胞周期階段、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和其他功能而異[9]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是已知在DR中驅(qū)動血管通透性的主要血管生成細(xì)胞因子,也參與改變連接復(fù)合體,如縫隙連接或緊密連接。幾種視網(wǎng)膜細(xì)胞類型,包括內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和RPE細(xì)胞,在缺氧時(shí)釋放VEGF,導(dǎo)致血管生成和血管通透性增高。有趣的是,VEGF通過激活內(nèi)皮細(xì)胞中的促分裂素原活化激酶磷酸化Cx43來破壞GJIC[10]。具體來說,糖尿病引起的VEGF升高可導(dǎo)致蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的活化,PKC隨后可增加Cx43、ZO-1和OCCLUDIN的磷酸化。ZO-1和OCCLUDIN磷酸化的增加可以促進(jìn)血管通透性,而磷酸化的Cx43可以使GJIC降低,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

    3 Cx43半通道與DR

    3.1 Cx半通道 Cx半通道已被證明與縫隙連接功能無關(guān)的特定作用,這些半通道介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外微環(huán)境之間分子的通過。與GJIC相比,連接蛋白半通道在“靜止”條件下對細(xì)胞中的小分子(<1 kDa ) (例如ATP、NAD+、前列腺素和小熒光染料)和離子顯示出非常低的打開概率和(或)低的膜滲透性。然而,這些通道的激活或開放涉及自分泌/旁分泌信號,這提供了ATP、谷氨酸釋放的途徑。NAD+和前列腺素可介導(dǎo)細(xì)胞信號和功能的各個(gè)方面。半通道活性通過連接蛋白亞基的翻譯后修飾來調(diào)節(jié),例如S-亞硝基化、磷酸化和去磷酸化;膜物理化學(xué)條件,例如膜電壓、pH值、機(jī)械刺激和單價(jià)和二價(jià)陽離子的濃度;通過細(xì)胞外信號分子,例如ATP和親脂性分子來調(diào)節(jié)[11-12]。盡管在正常生理?xiàng)l件下,連接蛋白半通道的開放概率很低,但在某些刺激條件下,包括組織損傷、炎癥和病理?xiàng)l件下,例如在缺血或缺氧應(yīng)激下,半通道打開,形成病理膜孔[13],半通道被過度激活。半通道的異常活動與繼發(fā)性組織損傷有關(guān),包括水腫、血管完整性受損和神經(jīng)元死亡[1]。因此,病理狀態(tài)下過度激活連接蛋白半通道主要導(dǎo)致正常穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞功能的破壞。

    3.2 視網(wǎng)膜缺血再灌模型中Cx43半通道的異常開放 視網(wǎng)膜缺血是DR的一個(gè)重要病理特征,導(dǎo)致血管完整性的喪失。視網(wǎng)膜缺血再灌注被認(rèn)為是研究動物DR的主要模型之一。在體外模擬缺氧、缺糖、缺血過程中,研究Cx43半通道在缺血再灌注損傷中的作用。Kerr等[14]研究表明,Wistar大鼠單側(cè)視網(wǎng)膜缺血性損傷顯著增加了缺血性和對側(cè)視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞、müller細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43的表達(dá),但損傷的假對照中沒有。Danesh-Meyer等[1]解釋說,隨著Cx43的增加,細(xì)胞表面半通道募集增加,導(dǎo)致質(zhì)膜中未連接的半通道增加,這可能與細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境之間的旁分泌和自分泌信號有關(guān)。在視網(wǎng)膜中細(xì)胞損傷期間,視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43表達(dá)的增加與細(xì)胞間鈣波和死亡信號的增加相關(guān)[1]。鈣信號已被證明參與局部血流調(diào)節(jié)和細(xì)胞因子釋放的誘導(dǎo),這導(dǎo)致BRB分解。血管內(nèi)皮細(xì)胞Cx43的增加也已被證明通過半通道介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞破裂直接影響B(tài)RB功能,導(dǎo)致體內(nèi)血管滲漏[1],這與其他炎癥損傷和典型的血管完整性喪失疾病一致。在眼壓升高以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜缺血的體內(nèi)研究中,損傷后1 h就觀察到內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43表達(dá)升高,并且在再灌注后4 h觀察到明顯的血管回流和滲漏[15]。這些變化也與膠質(zhì)增生有關(guān),其特征是星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)增加。因此,Cx43半通道上調(diào)似乎是缺血的早期過程,可能引發(fā)血管滲漏的炎癥機(jī)制,并在慢性炎癥條件下持續(xù)存在。

    在體外內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中,缺氧后再灌注導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡,應(yīng)用Cx43半通道阻滯劑可防止內(nèi)皮細(xì)胞死亡[16]。應(yīng)用Cx43模擬肽,即阻斷半通道的肽5,可減少缺血再灌注損傷引起的血管滲漏,提高星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率[15]。由于天然肽穩(wěn)定性差、遞送困難,為了增強(qiáng)天然肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性,肽5被化學(xué)修飾成C12-C12-肽5,用這種修飾的肽治療可以減少血管滲漏、炎癥,并保護(hù)缺血損傷后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[17-18]。最近有研究[19]發(fā)現(xiàn),在缺氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠模型中,星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43的條件性缺失維持了缺氧視網(wǎng)膜中星形膠質(zhì)細(xì)胞的較高密度,并促進(jìn)了血管恢復(fù)。因此,Cx43半通道開放與缺血中發(fā)生的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損失有關(guān)[16]。

    3.3 DR中炎癥與Cx43半通道的異常開放 Mugisho等[20]最近發(fā)現(xiàn),DR的臨床癥狀僅出現(xiàn)在玻璃體內(nèi)注射促炎細(xì)胞因子的糖尿病小鼠中,而注射鹽水的糖尿病小鼠沒有血管損傷的跡象。此外,他們將糖尿病性Akita小鼠和晚期DR的Akimba小鼠的Cx43表達(dá)與人類DR患者供體視網(wǎng)膜進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比,在確診為DR的人供體視網(wǎng)膜中Cx43的表達(dá)顯著增加。僅當(dāng)高血糖和炎癥過程相結(jié)合時(shí),在人體組織中觀察到的Cx43表達(dá)模式與體外RPE細(xì)胞數(shù)據(jù)以及體內(nèi)Akimba小鼠結(jié)果相關(guān)。有趣的是,在無炎癥的Akita小鼠中Cx43的表達(dá)呈現(xiàn)降低的趨勢,這可能支持其他研究結(jié)果,這些結(jié)果報(bào)告了僅使用HG模型而不是具有炎癥成分的DR中Cx43病理學(xué)的降低。此外,在確診為DR的Akimba小鼠和人類供體視網(wǎng)膜中,Cx43表達(dá)的增加與血管滲漏和受損相關(guān),這表明Cx43可能在疾病中出現(xiàn)的血管破裂發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。

    3.4 Cx43半通道阻斷劑在DR治療中的前景 體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明,阻斷Cx43半通道可通過阻斷激活NLRP3炎癥體所必需的自分泌三磷酸腺苷反饋環(huán),有效地減少炎癥[22]。此外,阻斷NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)炎 癥 體 可 阻 止VEGF的釋放,這表明Cx43半通道阻斷劑可在當(dāng)前抗VEGF治療的上游發(fā)揮作用。這些發(fā)現(xiàn)得到了最近其他體內(nèi)研究的支持,其中發(fā)現(xiàn)Akimba小鼠的NLRP3炎癥體蛋白升高,但Akita和野生型小鼠沒有升高[23]。炎癥過程中,核因子κβ(nuclear factor-kappa β,NF-κβ)通路的激活導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子前體的產(chǎn)生。為了將這些細(xì)胞因子從它們的前體形式轉(zhuǎn)化為活性形式,前半胱天冬酶1必須被切割成活性半胱天冬酶1,這發(fā)生在NLRP3聚集(炎癥體復(fù)合裝配)期間。因此,NF-κβ與受Cx43半通道阻滯調(diào)控的NLRP3通路有直接關(guān)系。因此,抑制Cx43半通道有可能在疾病過程早期干預(yù),首先預(yù)防炎癥,然后在慢性疾病中打破NLRP3炎癥體途徑中的自我延續(xù)反饋回路,這是DR的一個(gè)關(guān)鍵特征[22-24]。這些阻斷劑在視網(wǎng)膜疾病(如視網(wǎng)膜缺血[15]、年齡相關(guān)性黃斑變性[25]、DR[26])的嚙齒類動物模型中能夠有效減少炎癥和血管滲漏。Cx43半通道阻斷劑能夠阻斷促炎細(xì)胞因子釋放和血管完整性喪失引起的免疫系統(tǒng)激活[22]。以這種方式,Cx43半通道阻斷劑在抗VEGF藥物的上游起作用,先減少炎癥體的活化和炎癥,有可能防止新血管形成,最終防止糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)的發(fā)生。

    4 討論

    臨床上DR分為非增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(nonproliferative diabetic retinopathy,NPDR)和增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)。糖尿病早期可能主要是由于高糖引起視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、müller細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和RPE細(xì)胞中Cx43的表達(dá)下降,從而影響其介導(dǎo)的GJIC活性,GJIC活性降低可能造成毛細(xì)血管基底膜增厚、血管滲漏、視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡和炎癥。

    DR早期血流變化可導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的慢性炎癥,從而導(dǎo)致進(jìn)行性不可逆缺血、缺氧的發(fā)展,引起特征性微血管變化。氧化應(yīng)激以及炎癥都會使機(jī)體產(chǎn)生VEGF,VEGF升高可導(dǎo)致PKC的活化,PKC的活化可增加Cx43、ZO-1和OCCLUDIN的磷酸化,從而促進(jìn)血管通透性增加,進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

    隨著DR病情的發(fā)展,正常的Cx43及其Cx通道表達(dá)繼續(xù)下降,此時(shí)機(jī)體可能代償增加Cx43的合成。隨著Cx43的表達(dá)及其導(dǎo)致的細(xì)胞表面半通道募集,引起質(zhì)膜中未連接的半通道增加,這可能與細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境間的旁分泌和自分泌信號有關(guān)。

    DME是NPDR視力喪失的最主要原因。組織損傷、炎癥和缺血、缺氧應(yīng)激下Cx43半通道異常表達(dá)增加,進(jìn)一步激活NLRP3炎癥體所必需的自分泌三磷酸腺苷反饋環(huán),加重炎癥并促進(jìn)VEGF的釋放,視網(wǎng)膜血管通透性進(jìn)一步增加,從而導(dǎo)致DME的發(fā)生。

    DR早期癥狀不易察覺,當(dāng)病情進(jìn)一步發(fā)展進(jìn)入PDR,新生血管形成、視網(wǎng)膜前纖維血管膜增生及牽拉性視網(wǎng)膜脫離,導(dǎo)致不可逆的視力喪失。因此,探究DR的發(fā)生機(jī)制和早期防治意義重大。研究Cx43在DR的發(fā)病機(jī)制中的作用,旨在探討預(yù)防、控制DR發(fā)生及發(fā)展,尋求降低該病致盲率的有效途徑。

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