白細(xì)胞介素-33及其受體sST2在分泌性中耳炎中的表達(dá)及意義

顧瀟怡 馬兆鑫 王衛(wèi)華 鄭炯 崔佳文 胡炯炯 朱正華 張茹

(1.同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 上海 200120；2.浙江省海寧市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 海寧 314400)

分泌性中耳炎(secretory otitis media ,SOM)是指以中耳積液(middle ear effusion ,MEE)及聽力下降為主要特征的中耳非化膿性疾病,不伴有發(fā)熱、耳痛等急性感染征象[1]。SOM的病因及發(fā)病機制多樣且復(fù)雜，至今尚未完全闡明。作為發(fā)病機制之一的免疫炎癥性反應(yīng)學(xué)說已成為當(dāng)今研究的熱點，因此探究SOM的免疫炎癥反應(yīng)機制、完善相關(guān)理論依據(jù)具有重要意義。本研究通過測定SOM患者M(jìn)EE中白細(xì)胞介素-33(interleukin-33，IL-33)及sST2(homolog of sulfotransferase)含量，探討IL-33/ST2信號通路在SOM慢性遷延過程中可能發(fā)揮的重要作用。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2015年9月～2017年11月同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院耳鼻喉科門診和病房收治的SOM患者。根據(jù)SOM分期，病程以3個月為界，≥3個月為慢性期組，＜3個月為急性期組。隨訪以3個月為界，每2周門診復(fù)查1次。根據(jù)患者治療效果分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組。復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為痊愈后3個月內(nèi)出現(xiàn)耳悶、聽力下降癥狀，且復(fù)查耳鏡和聲導(dǎo)抗提示中耳腔內(nèi)有積液。共收集到58例MEE標(biāo)本，其中男性31例、女性27例；年齡14～88歲，平均(52.7±16.9)歲，均為單耳。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①主訴耳悶、聽力下降、耳鳴或伴輕微耳痛，無發(fā)熱或耳漏；②耳鏡檢查發(fā)現(xiàn)鼓膜內(nèi)陷或膨隆，鼓膜不透明、色澤改變(橙色、淡黃、琥珀色等)，可有液平或氣液平、氣泡，鼓膜活動受限；③純音測聽表現(xiàn)為傳導(dǎo)性或混合性耳聾，聲導(dǎo)抗為B型或C型鼓室圖，鐙骨肌反射消失。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有鼻咽癌、糖尿病、結(jié)核等嚴(yán)重全身性疾病。本研究已獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意，所有研究對象均已簽署書面知情同意書。

1.2 檢測方法 全部受檢者行鼓膜穿刺術(shù)或鼓膜切開術(shù)抽取MEE，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測 定IL-33和sST2含量。試劑盒分別由BioLegend公司和R&D公司提供。

2 結(jié)果

IL-33在MEE標(biāo)本中的陽性表達(dá)率為65.52%(38/58)。在陽性表達(dá)的38例中，急性期19例、慢性期19例；隨訪33例，失訪5例；隨訪3個月內(nèi)無復(fù)發(fā)23例、復(fù)發(fā)10例。

選取45例MEE標(biāo)本用于檢測sST2含量，陽性表達(dá)率為100%。急性期26例、慢性期19例。隨訪45例，失訪12例；隨訪3個月內(nèi)無復(fù)發(fā)25例、復(fù)發(fā)8例。

慢性期組IL-33的平均濃度為(30.54±14.63)pg/mL, 急性期組為(20.43±12.89)pg/mL，慢性期組高于急性期組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.26，P=0.03)。慢性期組sST2平均濃度為(323.86±208.40)pg/mL,急性期組為(544.94±214.77)pg/mL，急性期組明顯高于慢性期組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.398，P=0.01)。

未復(fù)發(fā)組IL-33的平均濃度為(24.52±13.46)pg/mL，復(fù)發(fā)組為(30.51±17.25)pg/mL，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.079，P=0.289)。未復(fù)發(fā)組sST2的平均濃度為(410.61±181.09)pg/mL，復(fù)發(fā)組為(399.41±306.92)pg/mL，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.126，P=0.90)。提示IL-33、sST2的濃度與SOM是否復(fù)發(fā)無關(guān)。

3 討論

SOM是耳鼻咽喉科的常見疾病之一。患者可出現(xiàn)耳悶、聽力下降、耳鳴等癥狀，影響其感官體驗，降低其生活質(zhì)量。早期SOM通過改善咽鼓管功能、治療上呼吸道感染、鼓膜穿刺等可得到有效治療，但部分患者常規(guī)治療無效，遷延不愈發(fā)展成為慢性SOM，則需行鼓膜通氣管置入和(或)咽鼓管球囊擴張。SOM遷延成慢性增加了患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。部分患者病程反復(fù)遷延，最終發(fā)展為粘連性中耳炎、鼓室硬化等不可逆性改變，導(dǎo)致永久性聽力下降。因此研究SOM發(fā)病機制具有重要意義。

IL-33具有抗炎和致炎雙重作用[2]。IL-33轉(zhuǎn)錄合成后通過自分泌的方式進(jìn)入細(xì)胞核中結(jié)合相關(guān)核染色體下調(diào)相應(yīng)炎性因子基因的表達(dá)，抑制IL-33/ST2 信號通路的傳遞，但這僅局限于體外研究發(fā)現(xiàn)[3]。同時IL-33又是一種分泌蛋白，以分泌泡的形式分泌到細(xì)胞外，結(jié)合到周圍細(xì)胞或分泌細(xì)胞自身的受體分子，發(fā)揮炎癥因子作用，促進(jìn)進(jìn)一步的免疫炎癥反應(yīng)。近年來IL-33/ST2信號通路被認(rèn)為是上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)平衡的關(guān)鍵，IL-33又是促進(jìn)Th2細(xì)胞反應(yīng)的主要因素之一。既往研究[4]證實SOM慢性化與Th1/Th2細(xì)胞失衡相關(guān)，并且Th2細(xì)胞免疫偏極化會進(jìn)一步造成黏膜上皮的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-33在MEE標(biāo)本中的陽性表達(dá)率為65.52%，證明SOM患者M(jìn)EE內(nèi)存在IL-33。分析樣本出現(xiàn)陰性結(jié)果的原因如下：①臨床采集的一部分MEE量過少，因此未進(jìn)行sST2的檢測；②MEE內(nèi)IL-33濃度較低，部分樣本內(nèi)IL-33低于試劑盒可檢測的最低濃度，因此不能被檢測出。我們在慢性期組和急性期組IL-33的含量對比中發(fā)現(xiàn)，慢性期組MEE內(nèi)IL-33含量明顯高于急性期組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果證明在SOM發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在IL-33大量合成后分泌至細(xì)胞外發(fā)揮相關(guān)炎癥活性作用。慢性期各種致病因素持續(xù)存在，長期刺激中耳腔黏膜屏障系統(tǒng)，中耳局部黏膜屏障受損較重，IL-33/ST2信號通路持續(xù)處于高激活狀態(tài)，不斷分泌炎癥因子IL-33，從而導(dǎo)致Th1/Th2等細(xì)胞免疫及體液免疫紊亂，下游炎癥信號通路激活，促使SOM病程遷延不愈。因此我們認(rèn)為IL-33與SOM遷延不愈密切相關(guān)。

sST2(homolog of sulfotransferase 2)屬于IL-1/TLRs受體超家族，1989年Tommaga等[5]在BALB/c-3T3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ST2基因。隨后證實ST2基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共4個亞型：ST2L、sST2、ST2LV和ST2V，其中ST2L和sST2含量最多。ST2L是一種跨膜形式蛋白，sST2是一種可分泌到細(xì)胞外的可溶性ST2。sST2是IL-33刺激Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子過程中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，當(dāng)其與IL-33形成復(fù)合物后不能結(jié)合到ST2L，使得相關(guān)炎癥細(xì)胞(如Th2細(xì)胞)不能產(chǎn)生炎癥因子，抑制了相關(guān)炎癥免疫反應(yīng)的發(fā)展[6]。但是阻斷IL-33/ST2信號傳導(dǎo)通路的因子不僅有sST2，單一免疫球蛋白IL-1受體相關(guān)分子Toll/IL-1R8(TIR8)通過與ST2L緊密結(jié)合也可阻斷該傳導(dǎo)通路[7]。2014年Lee等[8]研究發(fā)現(xiàn)，IL-33／ST2L信號通路可增強哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)，而sST2對IL-33／ST2L介導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。2016年車娟等[9]檢測變應(yīng)性鼻炎患者外周血IL-33和sST2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)變應(yīng)性鼻炎患者血清IL-33較正常人顯著增多，而sST2明顯低于正常人。同年Nygaard等[10]研究發(fā)現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)性皮炎患者血清中IL-33高于正常人，但sST2水平低于正常人，IL-33和sST2呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)sST2在MEE內(nèi)的陽性表達(dá)率為100%，證明SOM患者M(jìn)EE內(nèi)存在sST2。我們在慢性期組和急性期組sST2的含量對比中發(fā)現(xiàn)，急性期組MEE內(nèi)sST2含量明顯高于慢性期組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果證明在SOM急性期sST2可能被大量釋放到細(xì)胞外與IL-33結(jié)合，從而阻斷 IL-33與相應(yīng)受體結(jié)合，抑制IL-33/ST2信號通路激活，抑制免疫炎癥反應(yīng)的加重。因此，我們認(rèn)為SOM慢性化及疾病遷延不愈與sST2含量下降密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組IL-33含量高于未復(fù)發(fā)組，而復(fù)發(fā)組sST2含量低于未復(fù)發(fā)組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。考慮到本試驗后期失訪人數(shù)較多、試驗樣本量較少，以及個體偏移較大等原因，故不能完全否定IL-33／ST2L信號通路的激活狀態(tài)和sST2濃度與SOM的轉(zhuǎn)歸無相關(guān)性，因此后期試驗需增大樣本量進(jìn)一步證實。但SOM患者的預(yù)后還可能與MEE的性狀、不同的治療干預(yù)措施以及后期是否有誘發(fā)因素等相關(guān)，故后期試驗應(yīng)細(xì)化分組，進(jìn)一步探究。

對于SOM是否在初期的固有免疫遭到破壞后釋放前炎癥因子IL-33，IL-33/ST2信號通路的激活是否與Th1/Th2失衡相關(guān)，從而導(dǎo)致其病程遷延等問題還有待于進(jìn)一步研究，本研究為后續(xù)研究指明了方向。