間充質(zhì)干細胞在肝纖維化治療中的研究進展

康艷敏，葉俊松，鄒征偉，張敏鴻，劉書畫，李 藝，何正義，葉軍明

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2018級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；3.贛南醫(yī)學(xué)院干細胞臨床轉(zhuǎn)化分中心；4.贛南醫(yī)學(xué)院2019級碩士研究生；5.贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000）

肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF）是酒精、藥物、化學(xué)毒性或肝炎病毒感染等有害因素的作用下導(dǎo)致肝硬化、肝癌、肝衰竭的一個中間病理過程［1］，炎癥反應(yīng)增強和細胞外基質(zhì)（Extra cellular matrix，ECM）過度堆積是肝纖維化形成過程中主要病理特征，如果沒有采取積極正確的處理，肝纖維化可發(fā)展為肝硬化等終末期肝病，導(dǎo)致患者需要肝移植。目前，肝移植是終末期肝病患者唯一可行的治療選擇，但其應(yīng)用受到醫(yī)療費用昂貴、供體資源短缺、需要終生免疫抑制治療和移植排斥反應(yīng)等后遺癥的限制［2］。因此，尋找新的行之有效的治療策略改善肝纖維化患者癥狀，抑制其進一步向終末期肝病的發(fā)生發(fā)展，具有十分重要的意義。

間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是一類具有自我更新和分化潛能的成體干細胞。MSCs 因其具有多向分化潛能、增殖能力強、免疫調(diào)節(jié)和自我復(fù)制等特點［3］，成為治療肝纖維化最有前途的候選細胞。間充質(zhì)干細胞可以從多種組織中獲得，包括骨髓、脂肪組織、臍帶組織、胎盤、臍帶血、羊水、外周血、肝、肺、牙髓、骨骼肌和毛囊。國際細胞治療學(xué)會提出了以下定義MSCs 的最低標(biāo)準(zhǔn)：（1）貼壁生長；（2）存在特定的細胞表面抗原標(biāo)記物CD73、CD90、CD105，同時不存在CD14、CD34、CD45 和HLA-DR 等其他標(biāo)記物；（3）在體外有分化為脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞的能力［4］。

1 肝纖維化發(fā)生的分子機制

肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF）是嚴(yán)重慢性肝損傷的常見結(jié)果，其特征是細胞外基質(zhì)（ECM）的產(chǎn)生和降解失衡。通常由病毒、酒精、濫用藥物和自身免疫力觸發(fā)［5］。在肝纖維化的早期階段，ECM 的沉積可以被蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶水解。然而，持續(xù)的損傷會導(dǎo)致基質(zhì)成分的積累，如Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，導(dǎo)致瘢痕組織沉積和炎癥過程的開始［6］。

肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSCs）位于肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞之間的Disse竇周間隙，是儲存維生素A 的細胞。越來越多的研究表明HSCs 是合成和分泌細胞外基質(zhì)成分的主要細胞，在肝纖維化中起關(guān)鍵作用。在物理、化學(xué)或生物因素對肝臟造成損傷時，HSCs 被激活并迅速增殖；HSCs 的活化是肝纖維化的重要因素。轉(zhuǎn)化生長因子-β 是肝纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)，它觸發(fā)HSCs 的激活，誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)合成，增加肝細胞凋亡［7］。活化的HSCs通過旁分泌和自分泌方式促進外周靜止性HSCs 的活化，在各種細胞因子的作用下轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞，獲得了收縮和纖維化的特性，分泌細胞因子，表達α平滑肌肌動蛋白（Alpha-smooth muscle actin，α-SMA），α-SMA 不僅是門靜脈肌成纖維細胞的標(biāo)志，也是HSCs活化的標(biāo)志。

研究發(fā)現(xiàn)［8］多種細胞因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、干擾素和瘦素，通過多種信號通路如TGF-β/Smad、JINK/ERK、Notch 和Wnt/β-catenin 參 與HSCs 的 激活。其中TGF-β/Smad 通路是與肝纖維化相關(guān)的最重要的信號通路之一［9］，Smad 蛋白家族參與TGF-β下游信號通路，激活受體的蛋白包括Smad3，可以將信號從胞漿傳遞到細胞核，從而促進肝纖維化的發(fā)生；而發(fā)揮抑制功能的蛋白Smad7，可以阻止Smad復(fù)合物的形成及由此產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而抑制纖維化的起始。另外，肝kuppfer 細胞是體內(nèi)固定型巨噬細胞中最大的細胞群體，肝臟受損后，kuppfer 細胞和血液系統(tǒng)中的單核細胞會趨化到局部的肝損傷區(qū)域，清除異物及細胞碎片，同時分泌大量的炎性因子如TNF-α、TGF-β、IL-1，激活鄰近的HSCs，促進HF（圖1）。綜上所述，HF 與多種細胞因子、多種細胞類型和多種信號通路有關(guān)。如果沒有得到有效的治療，可能會發(fā)生肝硬化或肝功能衰竭，并增加患肝細胞癌的風(fēng)險［6］。

圖1 肝纖維化的過程

2 間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性及修復(fù)肝纖維化的可能機制

2.1 骨髓來源的間充質(zhì)干細胞

2.1.1 骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）首先在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，胞體呈紡錘形、梭狀，漩渦狀生長，排列緊密、形態(tài)均一，具有廣泛的自我更新和分化為多種細胞系的能力，包括成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞［10］。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞有分化肝細胞以替代受損肝細胞的能力，并抑制肝星狀細胞活化和促進肝星狀細胞凋亡進而修復(fù)受損的肝臟［11］。BMSCs 能夠分化為肝細胞樣細胞，并分泌多種細胞因子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，表明它們具有強大的抗氧化特性。這些能力使BMSCs 能夠?qū)垢卫w維化，而不受病因的影響［12］。BMSCs 作為最早發(fā)現(xiàn)的MSCs 被廣泛、深入研究，并有取自患者自身的BMSCs用于臨床實踐研究。

2.1.2 骨髓間充質(zhì)干細胞修復(fù)肝纖維化的機制研究表明，激活的Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)途徑可以促進包括WISP1 和Cyclin D1 基因的轉(zhuǎn)錄，它們在HSCs 增殖、轉(zhuǎn)移和ECM 形成中起重要作用［13］。另外，α-SMA 在肝組織中的表達作為肝星狀細胞活化的指標(biāo)，它的上調(diào)是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的特異性標(biāo)志［14-15］。研究人員發(fā)現(xiàn)BMSCs在體內(nèi)和體外實驗中均可顯著降低α-SMA 表達，抑制HSCs 增殖和活化并隨后抑制肌成纖維樣細胞，導(dǎo)致膠原蛋白降解并 減 少 肝 纖 維 化。JANG 等［16］通 過 對BMSCs 和HSCs 體外直接共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)α-SMA 極度下降，HSCs 活性大幅降低，證明BMSCs 自分泌可誘導(dǎo)HSCs 凋亡，降低HSCs 活化的準(zhǔn)確性；通過BMSCs和HSCs 體內(nèi)間接共同培養(yǎng)模擬旁分泌，導(dǎo)致可刺激HSCs 活化的TGF-β1、IL-6 減少，抑制HSCs 活化的肝細胞生長因子（HGF）、IL-10 增加，證明BMSCs可通過旁分泌來抑制HSCs 的活性。另有研究發(fā)現(xiàn)BMSCs 和HSCs 在體外共培養(yǎng)抑制HSCs 增殖的內(nèi)在分子機制是BMSCs 通過增加HSCs 的Notch1 表達水平，繼而通過PI3K/Akt 信號通路對話下調(diào)Akt 磷酸化而抑制肝星狀細胞增殖［17］。當(dāng)BMSCs 作用于HSCs 后，誘導(dǎo)HSCs Dlk-1 下調(diào)，而Dlk-1 下調(diào)誘發(fā)Nothch1信號通路激活、表達增加，抑制HSCs的增殖從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生［18］（表1）。即Dlk1/Notch信號通路可能是BMSCs 作用于HSCs 逆轉(zhuǎn)肝纖維化的另一機制。

2.2 臍帶來源的間充質(zhì)干細胞

2.2.1 臍帶間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性臍帶間充質(zhì)干細（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）是一類從臍帶組織中分離獲得的原始類型的干細胞，表型介于成體干細胞和胚胎干細胞之間，表達各種胚胎干細胞的獨特分子標(biāo)記，如OCT4、SOX2 和NANOG［19-20］。UC-MSCs 不 僅 具 有MSCs 的共同特性，而且具有更穩(wěn)定的生物學(xué)特性。UC-MSCs 可以從羊膜、羊膜下、血管周圍、華通膠和臍帶血中獲得，目前華通膠已經(jīng)成為UC-MSCs 的主要來源［21-22］。UC-MSCs 可以在嬰兒出生后獲得，對產(chǎn)婦和嬰兒無影響，這種相對方便和容易獲得使UC-MSCs 成為MSCs 的理想來源［23-24］。UC-MSCs 除表達其他MSCs 的標(biāo)志外，還特異性表達主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ［25］，并結(jié)構(gòu)性地表達T 細胞激活的負調(diào)節(jié)因子B7 同系物1，不表達主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ或共刺激分子CD80 和CD86，這可能促進UC-MSCs的同種和異種移植。

2.2.2 臍帶間充質(zhì)干細胞修復(fù)肝纖維化的機制UC-MSCs 具有多項分化潛能，可以分化為內(nèi)胚層細胞類型以及大多數(shù)中胚層和外胚層細胞類型［26］。多項研究表明，UC-MSCs在體外可以分化為肝細胞樣細胞。趙勤軍等［27］加入細胞因子獲得的hUC-MSCs具有較高的肝細胞分化能力和肝細胞特異性功能。UC-MSCs 可以分泌多種細胞因子、HGF 和IL-10［28］，促進肝臟修復(fù)、抑制肝硬化的發(fā)生發(fā)展。UC-MSCs的旁分泌作用可能是通過抑制TGF-β、Smad1 和Smad3 的表達，增強Smad7 蛋白的表達，從而抑制HSCs 的增殖［29］。研究人員［30］研究了UC-MSCs 在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中的抗纖維化潛力，UC-MSCs 可以運送GPX1，通過降解CCl4和H2O2，減少肝細胞的氧化應(yīng)激和凋亡，從而發(fā)揮肝細胞保護作用［31］（表1）。UC-MSCs 干預(yù)組大鼠血清ALT、AST、丙二醛、羥脯氨酸、層粘連蛋白、TGF-β1和INF-α水平明顯降低，反之谷胱甘肽水平顯著升高，提示UC-MCSCs 可能通過減少氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)進而減輕肝纖維化［30］。

2.3 脂肪來源的間充質(zhì)干細胞

2.3.1 脂肪間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性脂肪間充質(zhì)干細胞（Adipose tissue derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）是一種來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細胞，因其來源廣泛、易于采集、含量豐富、分化能力強和低免疫源性等優(yōu)越的特性，在臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，有望成為治療肝病領(lǐng)域極具潛力的種子細胞［32］。AD-MSCs 細胞呈紡錘形、增長迅速，常呈旋渦狀排列，在特定誘導(dǎo)因子的作用下，可以分化為多種細胞，包括脂肪細胞，成骨細胞，軟骨細胞，肌細胞和肝細胞［33］。AD-MSCs 作為一種成體干細胞，具有特異性的細胞表面抗原標(biāo)記物，CD44、CD73、CD105、CD90 陽性表達，CD14、CD34、CD45陰性表達［34-35］，這些特異性的細胞表面抗原標(biāo)記物常作為細胞篩選和細胞鑒定的理論依據(jù)。

2.3.2 脂肪間充質(zhì)干細胞修復(fù)肝纖維化的機制AD-MSCs 移植治療肝臟疾病的作用是通過分化為肝細胞樣細胞或（和）通過旁分泌的方式分泌細胞因子，進而促進殘存肝細胞生長并修復(fù)受損組織［36］。JNK激酶通路的激活被認為是介導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵信號通路，JNK 在HSCs 的表達顯著增加，其下游分子p53 也被磷酸化，隨后抑制了效應(yīng)因子caspase-3，從而誘導(dǎo)了HSCs 凋亡，并抑制了α-SMA的表達。JNK的持續(xù)激活與抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）有關(guān)，這表明ERK 和JNK 激活之間的動態(tài)平衡在細胞存活或細胞凋亡中可能具有重要作用［37］。研究發(fā)現(xiàn)肝細胞生長因子介導(dǎo)了一條bax 非依賴性的凋亡通路，該通路降低了NF-κB 的活性，激活了JNK1。HGF 和EGF 誘導(dǎo)的JNK1 激活表現(xiàn)出相似的動力學(xué)，提示HGF和EGF 受體信號通路之間可能存在關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，AD-MSCs 移植后血清透明質(zhì)酸水平降低，肝纖維化相關(guān)因子α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、膠原和金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP1）表達減少，肝纖維化程度明顯改善，其主要分子機制是通過抑制JNK、NF-κB和Smad2/3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而實現(xiàn)的［38］（表1）。

表1 間充質(zhì)干細胞修復(fù)肝纖維化的分子機制總結(jié)

3 間充質(zhì)干細胞治療肝纖維化的新技術(shù)

3.1 uPA 基因修飾的BMSCs 下調(diào)Wnt 信號通路減輕大鼠肝纖維化Wnt信號通路由高度保守的分泌糖蛋白家族組成，它們在器官發(fā)生、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和許多人類疾病的發(fā)病機制等多種生物過程中發(fā)揮重要作用［39］。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt 信號通路明顯參與HSCs活化，導(dǎo)致肝纖維化。在典型的Wnt信號通路中，β-catenin 是介導(dǎo)Wnt 信號從細胞膜到細胞質(zhì)的主要下游效應(yīng)器［40］。尿激酶纖維蛋白原溶酶原激活劑（Urokinase plasminogen activator，uPA）是一種特殊的絲氨酸蛋白酶，能將失活的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為活性的纖溶酶，從而直接降解細胞外基質(zhì)并催化潛伏期基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的激活［41］。馬志剛等［42］的研究發(fā)現(xiàn)uPA 基因修飾的BMSCs 通過增強uPA 表達以改善ECM 降解、下調(diào)Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子mRNA 和蛋白表達，干擾下游的β-連環(huán)蛋白由細胞膜轉(zhuǎn)入細胞質(zhì)過程，從而抑制HSCs 的激活，顯著改善了肝功能并減弱CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化，從而提供了一種新的有效抗肝纖維化治療方法。

3.2 UC-MSCs 來源的外泌體抗肝臟纖維化作用外泌體（Exosomes，Ex）即MSCs分泌的直徑40～100 nm雙層膜細胞外小泡（Extracellular vesicles，EVS）［43］，表達CD9 和CD81，是一種新的細胞間通訊機制［44］。Ex 優(yōu)于其親本細胞，體積比其親本細胞小、結(jié)構(gòu)簡單，無細胞活性、不存在腫瘤形成的風(fēng)險、膜結(jié)合蛋白的含量較低、免疫原性比其親本細胞低等［45］。從UC-MSCs 獲得的富含MIR-455-3P 的Ex 可以減輕巨噬細胞的浸潤和局部肝損傷，降低血清炎癥因子水平，從而改善肝臟組織學(xué)和全身疾?。?6］。hUC-MSC-Ex通過失活TGF-β1/Smad 信號通路，抑制肝細胞EMT，從而減輕肝損傷。研究發(fā)現(xiàn)，hUC-MSC-Ex移植減輕了四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化中的肝臟炎癥和膠原沉積，減少了肝臟表面纖維包膜并能明顯恢復(fù)ALT、AST 活性，降低Ⅰ型和Ⅲ型膠原、TGF-β1和磷酸化Smad2的表達。

3.3 AD-MSCs 聯(lián)合EUG 通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad提高大鼠抗纖維化活性丁香酚（Eugenol，EUG）是丁香精油的活性成分，在體內(nèi)通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶途徑來發(fā)揮抗纖維化作用。據(jù)研究報道［47］AD-MSCs 和EUG 聯(lián)合治療可顯著提高纖維化大鼠血漿纖維蛋白原濃度、抗炎細胞因子水平和增殖細胞核抗原表達，并顯著降低血清肝酶（ALT 和AST）、炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）、纖維化標(biāo)志物（Ⅲ型膠原、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸）和TGF-β的水平。此外，聯(lián)合治療比單獨使用AD-MSCs 明顯降低肝纖維化標(biāo)志物（COL-I 和α-SMA）和蛋白（α-SMA、TGF-β1、smad3）的表達，聯(lián)合治療較單用AD-MSCs 有更強的抗纖維化作用，提示AD-MSCs 與EUG 有協(xié)同作用。聯(lián)合治療組血清HGF 水平明顯升高，提示肝組織修復(fù)和組織重塑。有報道稱，在纖維化模型中，MSCs降低TIMP-1的表達或增加MMPs的表達，在纖維化的消退過程中發(fā)揮作用［48］。EUG可能通過不同機制提高AD-MSCs 的抗纖維化、抑制炎癥啟動的能力，并促進AD-MSCs與肝細胞的融合，有助于微環(huán)境的改變和向肝細胞分化，從而增加組織再生，抑制肝纖維化的發(fā)展。此外，EUG 可增加AD-MSCs 對損傷肝臟的歸巢能力，誘導(dǎo)肝細胞更多分化，導(dǎo)致AD-MSCs和EUG處理的纖維化大鼠肝細胞PCNA 表達增加，且高于單獨應(yīng)用AD-MSCs 的大鼠。

4 總結(jié)和展望

肝臟是一個儲存糖原、清除毒素、參與蛋白質(zhì)合成以維持代謝穩(wěn)態(tài)的重要消化器官。由于與外界毒素直接接觸，肝臟在應(yīng)激條件下很容易受到損傷。肝硬化在全球范圍內(nèi)是一個沉重的健康負擔(dān)，每年約有280 萬人受到影響，并導(dǎo)致130 萬人死亡［49］。肝纖維化是多種原因?qū)е碌穆愿螕p傷的一個中間病理環(huán)節(jié)，以肝組織彌漫性纖維化、再生結(jié)節(jié)和假小葉為特點，其機制至今仍不完全明確。目前，雖然有多種藥物可用于恢復(fù)患者的肝功能，但幾乎沒有有效的藥物來逆轉(zhuǎn)先前存在的肌成纖維細胞和細胞外基質(zhì)的積聚。

MSCs 是源于中胚層間充質(zhì)的干細胞，擁有自我復(fù)制和多向分化潛能，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥反應(yīng)和外分泌營養(yǎng)等功能。MSCs 已被用于治療多種疾病，如神經(jīng)、心臟、肝臟、腸道和肺部疾病，根據(jù)ClinicalTrials.gov 的數(shù)據(jù)，在各個領(lǐng)域已經(jīng)注冊了900 多項臨床試驗，其中與肝纖維化相關(guān)的臨床試驗在進行的就有49 項。MSCs 以其獨特的優(yōu)勢在臨床應(yīng)用方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，然而其在治療肝纖維化疾病的機制還未完全闡明，甚至有完全相反的結(jié)果呈現(xiàn)，未來需要更多基礎(chǔ)機制研究來確定治療特定肝病的最有效的細胞來源、培養(yǎng)條件、細胞數(shù)量、給藥頻率和給藥途徑，以期在人類肝臟疾病治療方面發(fā)揮巨大的作用。