腫瘤微環(huán)境在腫瘤血管生成的研究進(jìn)展

肖劍波，鐘佳寧，陳 斌

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2018級(jí)碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，江西 贛州 341000）

腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment，TME）最早由IOANNIDES 和WHITESIDE［1］提出，在腫瘤血管生成起著關(guān)鍵作用，而腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TME 主要由腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（Extracellular matrix，ECM）、血管、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cells，ECs）、神經(jīng)和細(xì)胞因子組成［2］。有文獻(xiàn)報(bào)道在沒有腫瘤血管生成的情況下，腫瘤生長直徑不會(huì)超過2 mm［3］。雖然一代和二代抗腫瘤血管靶向藥物已投入臨床應(yīng)用，然而我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)阻斷血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）對(duì)某些癌癥患者沒有明顯的益處。這給我們啟示，腫瘤血管生成不是簡單的分子信號(hào)通路串聯(lián)總和，可能是多通路廣泛聯(lián)系、相互影響的生物事件綜合效應(yīng)。隨著研究進(jìn)展，我們?cè)絹碓疥P(guān)注將腫瘤作為一個(gè)生態(tài)環(huán)境來探討包括腫瘤血管生成在內(nèi)的生物事件。

1 腫瘤微環(huán)境特點(diǎn)

在各種致癌誘因下，腫瘤細(xì)胞獲得持續(xù)增殖和抗凋亡的能力并不斷生長，腫瘤快速生長而血管生成滯后及血管功能異常，常導(dǎo)致腫瘤缺氧。缺氧是公認(rèn)的TME 特點(diǎn)，在低氧環(huán)境下作為廣譜轉(zhuǎn)錄因子HIFα 在胞質(zhì)穩(wěn)定性增加，最終轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核與HIFβ結(jié)合，增加包括促血管生成因子在內(nèi)的眾多靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)［4］。這些靶基因的表達(dá)改變了腫瘤代謝方式與分泌譜，其中最為經(jīng)典的是有氧糖酵解，使TME 呈低氧、酸性、高滲特點(diǎn)；TME 中基因譜表達(dá)的改變產(chǎn)生了不同于正常組織的趨化因子，招募大量骨髓和鄰近組織來源的干細(xì)胞及免疫細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行選擇性分化，加重腫瘤炎性改變和免疫耐受。上述過程導(dǎo)致血管生成抑制因子下調(diào)，促血管生成因子表達(dá)增加，打開血管生成“開關(guān)”，啟動(dòng)血管生成。不斷演進(jìn)的TME 反過來又對(duì)各種細(xì)胞產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，包括遺傳改變和表觀修飾及分子表達(dá)調(diào)節(jié)，形成更加有利于腫瘤進(jìn)展的炎性、免疫耐受和藥物屏障等局部環(huán)境，在所有腫瘤成員細(xì)胞的“努力”下，腫瘤血管快速畸形生成。然而，低氧和酸性等“惡劣”環(huán)境也對(duì)腫瘤細(xì)胞有害，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行“優(yōu)勢選擇”，經(jīng)過選擇的腫瘤細(xì)胞更具惡性表型，使腫瘤侵襲力和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增加。

2 癌細(xì)胞刺激血管生成

癌細(xì)胞在TME 處于核心地位，是腫瘤缺氧的始動(dòng)者，直接或間接參與腫瘤血管生成。在缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factor，HIF）直接上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）［5］、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR1/2）［6］、血管生成素（Angiopoietin-1/2，Ang1/2）［7］，血小板源性生長因子-B（PDGF-B）［8］，血管生成素受體（Tie-2）［9］以及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）［10］等促血管生成因子基因表達(dá)。MARJON PL 等［11］在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)觀察到，當(dāng)周圍環(huán)境的氧水平從21%降低到0.3%時(shí)，VEGF mRNA 水平增加了約10至50倍。在人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，壞死和缺乏血管的焦化區(qū)VEGF mRNA 表達(dá)最高。癌細(xì)胞間接誘導(dǎo)血管生成主要通過對(duì)招募細(xì)胞進(jìn)行極化形成腫瘤相關(guān)間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)促血管生成因子的表達(dá)。當(dāng)然，除了缺氧，某些癌基因、抑癌基因也會(huì)直接影響HIF 的表達(dá)或者活性調(diào)控，例如：野生型P53蛋白參與抑制HIF-1 的活性調(diào)節(jié)而P53 基因突變或缺失導(dǎo)致HIF-1增加［12］；抑癌基因PTEN 失活會(huì)通過PI3K/Akt途徑增加HIF穩(wěn)定性，而PTEN的恢復(fù)又會(huì)抑制HIF 的表達(dá)［13］。HIF 的表達(dá)或穩(wěn)定性增加，HIF依賴的促血管生成因子表達(dá)也增加，作為VEGF 的受體，VEGFR 除了在血管內(nèi)皮表達(dá)，也在間質(zhì)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞表達(dá)，從而形成了更加復(fù)雜的血管生成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。VEGF/VEGFR 結(jié)合使受體二聚化，從而激活受體和下游PI3K-Akt、PLC-ERK 等信號(hào)級(jí)聯(lián)［14］。實(shí)驗(yàn)表明，VEGFR-1 阻斷抗體可阻止人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）對(duì)VEGF-A 遷移但不影響其增殖，提示VEGFR-1 主要參與了內(nèi)皮細(xì)胞遷移［15］，VEGFR-1 還參與單核-巨噬細(xì)胞和造血干細(xì)胞招募，與TME的重建相關(guān)。VEGR2是一個(gè)高親和力受體，是參與腫瘤相關(guān)血管有絲分裂、趨化和血管通透性作用的主要受體。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道VEGF-A 激活VEGFR-2導(dǎo)致整合素的PI3K/Akt依賴性激活，導(dǎo)致細(xì)胞粘附和遷移增強(qiáng)，這種與整合素的協(xié)同作用是VEGFR-2產(chǎn)生信號(hào)所必需的［16］。

3 間質(zhì)細(xì)胞參與腫瘤血管生成

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancer-associated fibro?blasts，CAFs）是最豐富的腫瘤間質(zhì)細(xì)胞，OLUMI 等首次證明腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞促進(jìn)前列腺癌生長［17］，后來相繼在乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤證明與腫瘤進(jìn)展和血管生成相關(guān)。成纖維細(xì)胞除了直接產(chǎn)生VEGF外，更重要的是分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1/CXCL12），CXCL12 通過腫瘤細(xì)胞CXCR4 受體刺激腫瘤細(xì)胞的生長，并將內(nèi)皮祖細(xì)胞募集到TME［18］和直接趨化血管內(nèi)皮細(xì)胞［19］，促進(jìn)血管生成。此外CXCL12 能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF-A 通過自分泌促進(jìn)血管生成［20］。腫瘤相關(guān)的免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境最復(fù)雜的間質(zhì)細(xì)胞群，引起腫瘤微環(huán)境呈慢性炎性和免疫耐受特點(diǎn)，對(duì)腫瘤血管生成等腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有重大貢獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TEMs）與腫瘤血管生成密切相關(guān)［21］，且TEMs 功能缺失抑制血管生成和腫瘤生長［22］。在腫瘤進(jìn)展過程中，TMEs 產(chǎn)生TFGβ、TNFα、IL-1α、花生四烯酸等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)IL-8 和VEGF-A，誘導(dǎo)血管生成［23］。近年來發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在腫瘤血管生成也起著重大作用，肥大細(xì)胞c-Kit受體激活后分泌類胰蛋白酶激活PAR-2 受體，啟動(dòng)非經(jīng)典促血管生成途徑［24］。在粘液纖維肉瘤患者中，中性粒細(xì)胞數(shù)量增加與腫瘤微血管密度（MVD）增加相關(guān)［25］，研究發(fā)現(xiàn)在ras癌基因驅(qū)動(dòng)的腫瘤進(jìn)展模型中，腫瘤相關(guān)的中性粒細(xì)胞（TANs）介導(dǎo)IL-8等炎性介質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)血管生成［26］，此外中性粒細(xì)胞還通過分泌MMPs 等蛋白酶或調(diào)節(jié)其活性誘導(dǎo)血管生成［23］。目前對(duì)骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial progenitor cells ，EPCs）在腫瘤相關(guān)血管生成的作用存在爭議，有研究顯示EPCs在腫瘤組織內(nèi)血管形成的參與程度高于一般肉芽組織。有文獻(xiàn)報(bào)道EPCs可以占腫瘤脈管系統(tǒng)的50%～100%［27-28］，而另一些文獻(xiàn)表明腫瘤血管內(nèi)皮很少檢測到EPCs［29-30］，另外，有文獻(xiàn)指出，EPCs以25%～30%直接參與腫瘤早期血管生成，而4 周后EPCs 的比例降至1%［31］。在淋巴瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞部分來源于惡性細(xì)胞［32-33］。WANG R［34］和RICCI-VITIANI L［35］等用惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在體外轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞并在體內(nèi)證明其與血管生成有關(guān)。而CHENG L等的實(shí)驗(yàn)證明惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞只能轉(zhuǎn)化為血管周細(xì)胞，而不能轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細(xì)胞［36］。血管周細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、血管形成和通透性都有關(guān)鍵影響，血管周細(xì)胞分泌VEGF 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生［37］，血管周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均可表達(dá)Ang1和Ang2。Ang1/Tie2 介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞存活和成熟信號(hào)，Ang2/Tie2介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞不穩(wěn)定，從而促進(jìn)毛細(xì)血管出芽，形成新的血管［38］。

4 腫瘤酸性環(huán)境在腫瘤血管生成的作用

有報(bào)道指出酸性環(huán)境誘導(dǎo)骨髓來源的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡，抑制血管生成［39］，酸性環(huán)境通過G蛋白偶聯(lián)受體-4（GPR4）激活人血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急通路，增加內(nèi)皮細(xì)胞的死亡［40］。然而有文獻(xiàn)報(bào)道乳酸可以通過單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（MCT1）受體進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，通過KB/IL-8 通路促進(jìn)腫瘤血管生成［41］，內(nèi)皮細(xì)胞中乳酸在常氧條件下也能促進(jìn)血管生成［42］。有趣的是，乳酸誘導(dǎo)的VEGF 表達(dá)需要酸性pH，然而僅酸性pH 不能穩(wěn)定HIF-1α，腫瘤表達(dá)VEGF 減弱［41］。胞外酸性環(huán)境更多是通過癌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和基質(zhì)理化性質(zhì)的改變間接促進(jìn)血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)胞外低pH 通過胞外信號(hào)激酶、P38絲裂原活化蛋白激酶、NF-κB 信號(hào)通路激活間充質(zhì)干細(xì)胞，分泌促血管生成物CXCL8［43］。酸性細(xì)胞外環(huán)境也通過ERK1/2 MAPK 信號(hào)通路誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞VEGF 表達(dá)［44］。酸性環(huán)境還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞MMP9、PDGF、VEGF、IL-8 等促血管生成基因的表達(dá)。此外，酸性環(huán)境能夠增加MMP9/2等蛋白酶活性，從而促進(jìn)血管生成。

5 神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)腫瘤血管生成的作用

神經(jīng)在腫瘤中的作用一直被忽視，現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)在腫瘤血管生成方面具有不可或缺的作用。神經(jīng)系統(tǒng)與前列腺癌［45］、胃癌［46］、胰腺癌［47］、乳腺癌［48］、卵巢癌［49］等相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷患者前列腺癌發(fā)病率較低［50］。FAULKNER S 等研究表明，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移與TME中神經(jīng)密度相關(guān)［51］。ZAHALKA一項(xiàng)研究表明，腫瘤交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素通過血管內(nèi)皮受體促進(jìn)腫瘤血管生成［45］，這與之前報(bào)道交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活可以刺激癌癥的發(fā)展吻合［52］。有研究表明，β受體阻滯劑對(duì)黑色素瘤［53］、非小細(xì)胞肺癌［54］、乳腺癌［55］、卵巢癌［56］及多發(fā)性骨髓瘤［57］進(jìn)展有積極影響。一個(gè)簡單事實(shí)：癌癥相關(guān)的疼痛能為大腦皮層所感受，表明腫瘤微環(huán)境與大腦皮層相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道壓力［58］和社會(huì)條件［59］可以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，壓力可能通過腫瘤微環(huán)境內(nèi)交感神經(jīng)的激活直接刺激血管生成［45］。應(yīng)激釋放的兒茶酚胺可激活卵巢癌細(xì)胞上腎上腺素β2受體（ADRB2），使VEGF基因表達(dá)增加，使腫瘤血管化增強(qiáng)［60］，也有報(bào)道社會(huì)壓力通過腫瘤細(xì)胞β 受體上調(diào)炎性基因的表達(dá)［61］，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。此外，神經(jīng)系統(tǒng)與腫瘤間質(zhì)細(xì)胞尤其是免疫細(xì)胞關(guān)系密切，在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移起重要作用［62-63］。

6 外泌體/囊泡對(duì)腫瘤血管生成的作用

外泌體來源于細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜泡，大小約30～100 nm［64］，內(nèi)含各種非編碼RNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)［65］，主要攜帶親代細(xì)胞的各種生物信息，并在受體細(xì)胞中誘導(dǎo)多種信號(hào)反應(yīng)。外泌體在多種腫瘤TME 中分泌增加并廣泛參與腫瘤血管生成，乳腺癌細(xì)胞的胞外囊泡攜帶的VEGF 激活內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR促進(jìn)腫瘤血管生成［66］，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的外泌體富含Dll-4，抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Notch 信號(hào)傳導(dǎo)，增加腫瘤血管密度［67］，在結(jié)直腸癌中，腫瘤來源外泌體囊泡中miR-9 通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞SOCS5 的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成作用［64］。外泌體也是腫瘤酸性環(huán)境的主要貢獻(xiàn)者［68］，而低氧和酸性環(huán)境反過來又誘導(dǎo)外泌體分泌增加，且酸性環(huán)境增加受體細(xì)胞融合外泌體的能力，有利于腫瘤血管生成效能［69-70］。實(shí)驗(yàn)表明，缺氧誘導(dǎo)癌細(xì)胞富含miR210的外泌體分泌，轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)皮細(xì)胞，抑制Ephrin A3和PTP1B的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成［71］。來源于缺氧肺癌外泌體的miR23a，轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)皮細(xì)胞抑制PHD1/PHD2和ZO-1，導(dǎo)致HIF 在胞內(nèi)穩(wěn)定性增加，增加腫瘤血管生成和血管通透性［72］。事實(shí)上從缺氧腫瘤細(xì)胞分離出的囊泡在體內(nèi)外促進(jìn)血管生成和腫瘤生長的作用比常氧情況下更強(qiáng)［72］。也有報(bào)道證明間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的miRNA 對(duì)血管生成起著廣泛作用［73］，癌細(xì)胞來源的外泌體還可作用于間質(zhì)細(xì)胞間接促進(jìn)腫瘤相關(guān)血管生成。有文獻(xiàn)報(bào)道黑色素瘤細(xì)胞分泌的外泌體miR155-5p作用于腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞，靶向抑制SOCS1，從而下調(diào)JAK2/STAT3信號(hào)通路和增加VEGFα、FGF2、MMP9 等促血管生成因子的表達(dá)［74］。施曉雷等研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞來源的外泌體miR-21轉(zhuǎn)入造血干細(xì)胞，下調(diào)其靶蛋白PTEN 而激活PDK1/Akt 信號(hào)通路，將造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CAFs，促血管生成因子IL-6 和IL-8 分泌而增加，加速腫瘤進(jìn)展［75］。當(dāng)然，腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞外泌體也能反作用影響腫瘤細(xì)胞［76-77］，在這里不再概述，但不得不強(qiáng)調(diào)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的外泌體參與腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［78］，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換后的腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體更具有促進(jìn)腫瘤血管生成的能力［79］。目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤相關(guān)的免疫細(xì)胞外泌體直接參與血管內(nèi)皮調(diào)節(jié)，但我們觀察到腫瘤來源的外泌體可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的M2/PD1+極化［80-81］，極化的巨噬細(xì)胞能促進(jìn)血管生成。腫瘤分泌的miR-21和miR-29a在腫瘤免疫細(xì)胞中作為配體直接與toll 樣受體（TLR）家族的受體結(jié)合，從而觸發(fā)TLR 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［82］，而腫瘤的炎癥環(huán)境有利于腫瘤血管生成。目前關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體通過旁分泌或自分泌促進(jìn)血管的生成尚未見報(bào)道。

7 結(jié)論與展望

腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等多種過程離不開腫瘤血管生成，而腫瘤血管生成是TME 中所有細(xì)胞共同作用的結(jié)果。盡管TME 對(duì)腫瘤血管生成的的研究取得了不少的成果，但就目前而言，更加深入的信號(hào)關(guān)聯(lián)及作用機(jī)制并把這些策略轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐還是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。未來，我們?cè)赥ME 對(duì)腫瘤血管生成的研究重點(diǎn)依然在TME 的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)調(diào)節(jié)，關(guān)鍵在炎性和免疫方向，從而對(duì)TME 中細(xì)胞和分子在治療血管生成的作用進(jìn)行精確評(píng)估，為抗腫瘤血管靶向治療提供精準(zhǔn)方案。