染色體結構異常PGT周期中囊胚評估參數與其整倍體率的相關性

孫慶云，杜元杰，王躍，朱序理，周亮，曹金鳳，趙志明，郝桂敏

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科，石家莊 050000)

染色體結構異常包括染色體平衡易位、羅氏易位、倒位，夫婦一方或雙方攜帶染色體結構異常時往往會發(fā)生反復的孕早期流產，給患者帶來很大的困擾。胚胎植入前遺傳學檢測(Preimplantation genetic test，PGT)是在胚胎植入著床之前對早期胚胎進行染色體數目、結構異常以及某些單基因病的檢測，挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低流產率，預防出生缺陷。對于患者而言，活檢囊胚的數量和質量決定了其可移植囊胚的數量和最終的妊娠結局。有研究顯示，囊胚的整倍體率和囊胚的評估參數有一定的相關性，但結論不一[1-2]。如何在降低患者花費的前提下最大限度的提高囊胚的利用率是我們面對的難題，本文對我中心因染色體結構異常行PGT檢測的囊胚分別采用周期特征性分析、廣義評估方程GEE模型和分類決策樹模型來分析囊胚的整倍體率，以探討囊胚評估參數與其整倍體率的相關性。

資料與方法

一、研究對象

選取2019年1月至2020年6月在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科因夫婦雙方或一方染色體結構異常行PGT的83例患者(共97個周期)為研究對象，對其所檢測囊胚的PGT數據進行回顧性分析。將所有患者按照一般情況、周期基本情況以及活檢囊胚情況進行逐層分組，比較各亞組囊胚的PGT檢測結果。納入標準：(1)夫婦雙方或一方染色體結構異常行PGT的周期；(2)本周期至少有1枚可活檢囊胚；(3)書面簽署PGT知情同意書。排除標準：(1)因單基因病行PGT的周期；(2)夫婦一方或雙方染色體結構異常但未行囊胚活檢的周期。

二、研究方法

1.體外受精與胚胎培養(yǎng)：所有患者采用我中心常規(guī)促排卵方案[3]，取卵日采用超聲引導下經陰道穿刺取卵。所有周期采用卵胞漿內單精子注射(ICSI)方式授精，ICSI后置于卵裂期培養(yǎng)液(G-1plus，Vitrolife，瑞典)進行常規(guī)胚胎培養(yǎng)及觀察，第3天(D3)觀察胚胎情況并將可利用胚胎轉移至囊胚培養(yǎng)液(G-2plus，Vitrolife，瑞典)繼續(xù)培養(yǎng)至D5或D6。

2.囊胚評級：囊胚評價采用Gardner囊胚評分系統(tǒng)[4]，根據囊胚擴張和孵出程度將囊胚分為1～6期：1期為早期囊胚，囊胚腔體積小于囊胚的二分之一；2期囊胚的囊胚腔體積大于囊胚的二分之一；3期為完全擴張囊胚，囊胚腔占據整個囊胚；4期為擴張后囊胚，囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴大，透明帶變薄；5期為正在孵化的囊胚，囊胚正在從透明帶破裂口孵出；6期為孵化出的囊胚，囊胚完全從透明帶中脫出。內細胞團(Inner cell mass，ICM)和滋養(yǎng)層細胞(Trophoblast cell，TE)評級根據細胞數目和緊湊程度評為A、B、C級：A級為細胞數目多，結合緊密；B級為細胞數目較少，結合較松散；C級為細胞數目極少。

3.囊胚活檢：活檢囊胚標準：囊胚發(fā)育至D5、D6或D7，擴張程度為3期及以上，囊胚ICM與TE評級不同時為C級?；顧z時使用激光在透明帶遠離ICM的位置打孔，使用30 μm內徑的活檢針吸取滋養(yǎng)層細胞5～10個，將活檢的細胞轉移至裝有2 μl PBS的PCR管內，短暫離心后置于-20℃凍存待檢?；顧z后囊胚采用玻璃化冷凍方法(KITAZATO Vitrofaction KIT，加藤，日本)冷凍后置于液氮罐保存。

4.PGT檢測：活檢細胞樣本采用SurePlex DNA Amplification System試劑盒(Illumina，美國)進行全基因組擴增，擴增后進行文庫構建及純化，然后通過MISEQ平臺對擴增產物進行測序，pgxcloud分析系統(tǒng)進行分析并比對hg19數據庫出具PGT報告，檢出范圍：23對染色體非整倍體、4 Mb及以上的片段缺失/重復、30%及以上的嵌合，其中片段缺失/重復以及嵌合體囊胚均按非整倍體計算[5]。

5.觀察指標：記錄各組活檢囊胚的評估參數，分析囊胚的整倍體率與女方年齡、男方年齡、女方基礎FSH/LH比值、女方體重指數(BMI)、PGT指征、染色體結構異常來源男方/女方、獲卵數、促排方案、Gn總量、活檢囊胚數以及囊胚活檢時的發(fā)育天數、囊胚擴張程度、ICM級別、TE級別的相關性。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、活檢囊胚檢測結果

本次研究共納入83例患者(97個PGT周期)。共活檢371枚囊胚，其中整倍體囊胚154枚(41.51%)，非整倍體囊胚217枚(58.49%)。

二、活檢囊胚整倍體率單因素分析

1.患者基本情況與整倍體率：將所有患者按照一般情況逐層分組，研究結果顯示，女方18.5≤BMI<24 kg/m2組囊胚整倍體率(48.37%)顯著高于BMI<18.5 kg/m2組(23.81%)和BMI≥24 kg/m2組(36.44%)(P<0.05)；而女方年齡、男方年齡、女方基礎FSH/LH比值與囊胚整倍體率均無顯著相關性。

表1 活檢囊胚整倍體率單因素分析(%)

2.PGT指征與整倍體率：根據患者進行PGT周期的指征進行逐層分組，結果顯示：染色體結構異常行PGT的周期中，平衡易位組囊胚整倍體率(31.88%)顯著低于羅氏易位組(52.85%)和倒位組(56.10%)(P<0.05)；而按性別不同將染色體結構異常來源分成女方、男方兩組時，兩組囊胚整倍體率無顯著差異(P>0.05)。

3.促排卵周期與整倍體率：根據患者周期基本情況進行逐層分組，結果顯示，促排周期中Gn總量<2 250 U組囊胚整倍體率(50.00%)顯著高于Gn總量2 250～3 000 U組(38.06%)和Gn總量>3 000 U組(34.15%)(P<0.05)；而促排卵方案、獲卵數、每周期可活檢囊胚個數與囊胚整倍體率均無顯著相關性(P<0.05)。

4.活檢囊胚情況與整倍體率：根據患者活檢囊胚情況進行逐層分組，研究顯示，D5活檢囊胚的整倍體率(53.53%)顯著高于D6(31.96%)和D7(14.29%)(P<0.05)；囊胚的整倍體率隨活檢囊胚的擴張程度升高呈現增加的趨勢，但尚無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；活檢囊胚的ICM評級為A級的囊胚整倍體率(67.74%)均顯著高于B級(39.02%)和C級(39.62%)(P<0.05)；活檢囊胚的TE評級為A級的囊胚整倍體率(70.00%)高于B級(46.98%)和C級(36.32%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

三、囊胚整倍體率相關因素的廣義評估方程GEE模型分析

納入女方年齡、男方年齡、女方BMI、基礎激素水平(FSH、LH、E2)、促排情況(Gn總量、Gn天數)、獲卵數、MⅡ卵數、染色體異常類型及來源、每周期活檢囊胚個數以及活檢囊胚的評估參數(發(fā)育天數、擴張程度、ICM/TE評級)等可能與囊胚整倍體率相關的因素進行GEE模型分析。結果顯示，活檢囊胚發(fā)育天數及擴張程度與囊胚整倍體率均具有顯著相關性(P<0.05)，OR值分別為4.400[95%CI(1.553，12.465)]、0.344[95%CI(0.128，0.928)]；而女方年齡、男方年齡、女方BMI、獲卵數、MⅡ卵數、基礎激素水平(FSH、LH、E2)、促排情況(Gn總量、Gn天數)、囊胚ICM、TE評級均與其整倍體率無顯著相關性(P>0.05)(表2)。

表2 囊胚整倍體率相關因素的廣義評估方程GEE模型分析

四、SPSS分類決策樹模型

采用SPSS 22.0分類決策樹以整倍體率增加(生長法)分析囊胚參數相關性指標。指定項：以囊胚是否為整倍體為因變量；以PGT指征、染色體結構異常來源于男方/女方、活檢囊胚發(fā)育天數、期別、ICM和TE評級作為自變量，女方年齡為影響變量，使用生長法生成兩個分區(qū)；在每個分區(qū)中執(zhí)行相同的過程，直到沒有變量向樹添加值為止，結果顯示共生成3組節(jié)點：第1組節(jié)點為PGT指征：倒位及羅氏易位患者的整倍體率顯著高于平衡易位患者(χ2=19.164，P=0.000)(P<0.05)；第2組節(jié)點為囊胚發(fā)育天數，活檢時發(fā)育天數為D5的囊胚整倍體率顯著高于D6和D7囊胚(χ2=10.824，P=0.003)(P<0.05)；第3組節(jié)點為染色體結構異常來源于男方/女方：在倒位及羅氏易位患者中，男方核型異常患者其囊胚整倍體率顯著高于女方核型異?；颊?χ2=5.552，P=0.018)(P<0.05)，但是在平衡易位患者中，女方核型異?；颊咂淠遗哒扼w率顯著高于男方核型異?；颊?χ2=5.320，P=0.021)(P<0.05)，交叉驗證正確百分比64.2%(圖1)。

討 論

隨著囊胚活檢和二代測序技術日趨成熟，很多染色體結構異常的患者可以通過PGT技術得到整倍體的囊胚進行移植，避免了反復流產和出生畸形兒的風險，但是PGT檢測費用仍然相對較高，為了更好地提高患者的囊胚利用效率和節(jié)省費用，活檢囊胚的選擇就顯得很重要。目前，各中心通常采用Gardner囊胚評分方法，囊胚發(fā)育天數、擴張程度、ICM、TE這四者之間具有相對獨立性，而各參數與囊胚整倍體率的相關性，國內外文獻報道也存在爭議[5-7]。

本文使用3種分析方法即周期特征性分析、分類決策樹模型和廣義評估方程GEE模型對數據進行統(tǒng)計分析。周期特征性分析是將周期各個指標作為囊胚整倍體率的獨立因素，進行t檢驗、方差分析或χ2檢驗，簡單易行，得出的數據比較直觀，但是這種統(tǒng)計方法忽略了各指標之間的相互影響，忽略了本實驗數據實質為重復測量數據的特性；分類決策樹模型實質是從多個指標中挖掘出有意義的指標并按相關程度排序生成節(jié)點，得出的結論比較直觀，易于理解和解釋，可以清晰的看出哪些字段比較重要，但是在樣本量較少的情況下，有可能篩選排除掉一些有意義的指標；廣義評估方程GEE模型是將囊胚數據屬于重復測量這一特性考慮其中，比如1名平衡易位的患者活檢了6枚囊胚，而另1名羅氏易位的患者活檢了2枚囊胚，這些囊胚并不是完全獨立的，GEE模型在分析的時候可以將不同患者之間的基礎數據進行分析并校正，這樣得出的結論才更有代表性。

ICM和TE評級與其整倍體率的相關性尚未確定，由于活檢操作是吸取TE，所以考慮TE與其整倍體率密切相關，但從生理學角度來看，TE和ICM并不是孤立存在的，而是作為一個有機整體共存具有相互作用的[8]。前期有些學者的研究結果也顯示囊胚的擴張程度、ICM及TE評級均與其整倍體率相關，但這些指標在提示囊胚的整倍體性的過程中重要性如何報道并不一致[9-11]。本研究周期特征性分析統(tǒng)計結果顯示，ICM和TE的不同評級其整倍體率不同，差異有統(tǒng)計學意義；但廣義評估方程GEE模型和分類決策樹模型結果則顯示，ICM和TE評級與囊胚整倍體率無顯著相關性，考慮可能由于ICM和TE評級這兩個指標并不能完全獨立。我們的活檢標準是ICM和TE不能同時為C級，所以有一項指標為C級時另一個指標必須為A或B級，這樣兩項評級就會相互影響；再者ICM和TE評級主觀性較強，這也可能會影響最終的分析結果，即便如此，從結果中我們也可以看到ICM和TE為A級的囊胚整倍體率是高于B、C級的。

相對于ICM和TE評級來說，對囊胚的發(fā)育天數和擴張程度的評估是比較客觀的。囊胚發(fā)育速度被認為是評估囊胚質量的重要指標，發(fā)育速度不同的囊胚整倍體率是否存在差異仍然存在爭議，Munné等[12]的研究認為，不同中心由于促排卵方案以及培養(yǎng)體系的不同其囊胚的整倍體率也有所不同，但與培養(yǎng)天數無關。Kaing等[13]研究發(fā)現，D5活檢的囊胚其整倍體率顯著高于D6活檢的囊胚，而且Irani等[14]進行回顧性分析結果顯示，移植D5囊胚的著床率及活產率均顯著高于D6囊胚。本研究3種分析方法結果都發(fā)現，發(fā)育天數D5囊胚的整倍體率顯著高于D6、D7囊胚，囊胚發(fā)育天數與其整倍體率具有顯著相關性；本研究只有GEE模型結果顯示囊胚擴張程度與其整倍體率密切相關，5～6期囊胚整倍體率高于4期和3期囊胚，這與既往一致[15]。因為囊胚發(fā)育天數與擴張程度共同體現了囊胚的發(fā)育速度，由此我們得出發(fā)育速度較快的囊胚整倍體率相對較高。

囊胚的整倍體率與患者染色體的異常類型密切相關，染色體平衡易位患者其囊胚整倍體率顯著低于羅氏易位患者[16]，這與不同的結構異常其配子形成機制不同有關。比如染色體平衡易位患者在形成配子過程中共可產生18種類型的配子，其中1種完全正常，1種為攜帶，其余16種均為異常；而羅氏易位患者可產生6種類型的配子，其中1種完全正常，1種為攜帶，其余4種均為異常。有文獻報道，相互易位攜帶者的異常胚胎比例約為68%，羅氏易位攜帶者異常胚胎比例約為48%[17]，這是由于易位患者其每種配子產生的幾率并不完全一致，而且由于我們培養(yǎng)囊胚的過程中胚胎也經過了優(yōu)勝劣汰，所以胚胎的整倍體率比理論上高的多。我們的周期特征性分析和分類決策樹模型都顯示染色體平衡易位患者囊胚的整倍體率顯著低于染色體羅氏易位患者和倒位患者。另一方面，男方或女方核型異常行PGT時，其囊胚整倍體率有無差別，文獻報道不一。Zhang等[18]的研究認為，男性和女性相互易位攜帶者其減數分裂時四價體不同分離模式的發(fā)生率是不一致的，男性攜帶者鄰近-1模式分離顯著高于女性攜帶者，而女性攜帶者鄰近-2和3∶1模式分離顯著高于男性。Idowu等[19]報道，相互易位和羅氏易位患者行PGT檢測的結果顯示，女性攜帶者其囊胚發(fā)生易位相關的非整倍體率顯著高于男性攜帶者，但總體的囊胚非整倍體率在男性和女性攜帶者之間無顯著差異。國內學者關于易位攜帶者性別與囊胚整倍體率的相關性也不一致。肖卓妮等[20]研究結果顯示，相互易位男性攜帶者其囊胚整倍體率顯著高于女性攜帶者；而劉靜文等[21]則報道，染色體結構異常患者的性別與囊胚整倍體率無顯著相關性。我們的研究中只有分類決策樹模型顯示囊胚整倍體率與染色體結構異常患者的性別具有相關性。在羅氏易位和倒位患者中，男性核型異常的患者囊胚整倍體率較高，而在平衡易位患者中，女方核型異常的患者囊胚整倍體率較高。這與之前的報道并不一致，考慮可能由于羅氏易位、倒位與相互易位減數分裂的分離模式不同，不同分離模式的發(fā)生概率也不同，進而導致最終囊胚整倍體率在男性和女性攜帶者之間產生了差別，這還需要進一步擴大樣本量進行驗證。

我們的3種分析方法結果都顯示，女方年齡、男方年齡、女方基礎FSH、促排卵方案以及獲卵數和活檢囊胚數與其囊胚整倍體率均無顯著相關性。Marca等[22]報道，在行胚胎植入前非整倍體篩查的患者中，女方年齡增大其囊胚整倍體率下降；孫寶剛等[23]報道，在對D3廢棄胚胎進行整倍體檢測時，發(fā)現男方年齡≥40歲時其胚胎整倍體率下降顯著。但這兩篇報道都是夫婦染色體正常行植入前非整倍體篩查的研究與我們所分析的染色體結構異?；颊哂兴煌?。我們的數據顯示，女方和男方年齡≥35歲時，囊胚整倍體率有下降趨勢，由于我中心染色體結構異?；颊叨嘁驗榉磸土鳟a檢查而得知，這部分患者年齡普遍偏低，高齡的患者例數較少，所以差異不顯著，如需分析在結構異?；颊咧心挲g是否為相關因素還需加大樣本量進一步研究。我們的周期特征性分析結果還提示，女方BMI和促排的Gn總量與其囊胚整倍體率相關，BMI偏高或偏低都會使其囊胚整倍體率降低，使用Gn總量較少的患者其囊胚整倍體率較高，但分類決策樹模型與廣義評估方程GEE模型結果顯示女方BMI和促排的Gn總量與其囊胚整倍體率沒有顯著相關性，所以考慮這兩個指標為混雜因素，在校正之后結果顯示并不是影響囊胚整倍體率的相關因素。張晉寧等[24]也報道，Gn的累積使用量以及促排卵方案與其囊胚的整倍體率沒有顯著相關性。

綜上所述，PGT周期進行囊胚活檢時，建議優(yōu)先考慮囊胚的發(fā)育天數。D5活檢囊胚的整倍體率最高，而D7囊胚的整倍體率僅約14%。也有報道雖然D7囊胚整倍體率較低但其種植率與D5、D6相差不大[25]，認為不應輕易放棄，這時候我們就要綜合患者的經濟情況決定是否進行D7囊胚的非整倍體檢測；其次應考慮囊胚的擴張程度，這也是囊胚發(fā)育速度的一個重要指標；ICM和TE等級也是我們應該考慮的因素，這兩個指標直接關系到冷凍解凍的復蘇率和復蘇后囊胚移植的妊娠率。因此，我們應建立適當的活檢囊胚標準，提高患者囊胚利用率，提高患者的經濟效益，縮短獲得妊娠的時間。