TWIST2通過調(diào)控FGF21介導(dǎo)的AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡

盛連兵，劉皎婧，雷麗君，楊慧軍

(山東省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，濟(jì)南 250014)

TWIST相關(guān)蛋白2(TWIST2)屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic helix-loop-helix protein，bHLH)家族B類成員[1]，在骨發(fā)育、腫瘤發(fā)生與進(jìn)展和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用[2-3]。目前，關(guān)于TWIST2在卵巢癌中作用的研究報(bào)道較少，僅有報(bào)道其在卵巢癌患者癌細(xì)胞中的表達(dá)情況[4-5]，但其在卵巢癌細(xì)胞中的功能仍需要進(jìn)一步探究。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21 (FGF21)主要在肝臟中合成，被認(rèn)為是一種肝臟激素，在控制肝臟脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮一系列作用，但對(duì)其在癌癥中的研究較少[6-7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，TWIST2對(duì)FGF21的表達(dá)具有調(diào)控作用，當(dāng)TWIST2過表達(dá)時(shí)，可以通過調(diào)控FGF21進(jìn)而緩解肝細(xì)胞的脂肪變性、抑制炎癥、增加線粒體含量并改善其功能，從而在維持肝臟穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[8]。AMPK是一種異源三聚體蛋白質(zhì)激酶，缺氧應(yīng)激可激活細(xì)胞內(nèi)的AMPK，其在能量代謝和凋亡的調(diào)控中起到重要作用[9]。mTOR是一種絲氨酸蛋白質(zhì)激酶，可接受并整合細(xì)胞內(nèi)外的各種刺激，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、自噬、凋亡等生物行為。mTOR被認(rèn)為是AMPK的下游分子，細(xì)胞內(nèi)AMPK被激活后可通過調(diào)控mTOR磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。

本研究旨在探究TWIST2是否通過調(diào)控FGF21介導(dǎo)的AMPK/mTOR通路影響卵巢癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡以及其作用機(jī)制，從而為臨床上卵巢癌的治療提供新的理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料和主要試劑、儀器

1.組織樣本和細(xì)胞系：收集2018年6月至2019年10月在山東省婦幼保健院治療并經(jīng)病理確診的30例卵巢癌患者的癌組織和癌旁組織，樣本大小約500 mg，離體后20 min內(nèi)快速行冰凍病理檢查確認(rèn)，液氮中保存?zhèn)溆?。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均對(duì)研究知情并簽署知情同意書。研究所用卵巢癌細(xì)胞系(SK-OV-3、HO-8910、COC1和A2780)和正常卵巢上皮細(xì)胞(IOSE80)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。

2.試劑和儀器：Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；TWIST2兔抗鼠單克隆抗體、FGF21兔抗鼠單克隆抗體、NF-κB(p-p65)兔抗鼠磷酸化單克隆抗體、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)兔抗鼠單克隆抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)兔抗鼠單克隆抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)兔抗鼠單克隆抗體、p-AMPK兔抗鼠單克隆抗體、p-mTOR兔抗鼠單克隆抗體和GAPDH鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR引物、pcDNA3.1-TWIST2質(zhì)粒由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司；Bio-Rad T100熒光定量PCR儀和Bio-Rad iMark酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；WST-8、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK試劑、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；AMPK激活劑(A-769662)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；NAD+/NADH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio Vision公司；2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

二、研究方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清及100 U/ml雙抗)，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，隔天換液，細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)傳代，傳至第三代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：pcDNA3.1-TWIST2質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1及pcDNA3.1-FGF21質(zhì)粒均由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)、構(gòu)建。按照Lipofectamine3000說明書將pcDNA3.1-TWIST2質(zhì)粒、陰性對(duì)照pcDNA3.1質(zhì)粒及pcDNA3.1-FGF21質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞中，命名為TWIST2組、陰性對(duì)照組和FGF21組，空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，分別記錄細(xì)胞總數(shù)及綠色熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)。轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

3.qRT-PCR：取組織樣本200 mg，加入1 ml Trizol剪碎，加入1/5體積的氯仿，12 000g離心15 min，吸取上層無色水相移入新EP管中，加入等體積的異丙醇，12 000g離心后管底可見微量RNA沉淀，75%乙醇洗一遍，干燥后加入無RNase水溶解沉淀，即為組織總RNA，備用。將SK-OV-3、HO-8910、COC1、A2780四種卵巢癌細(xì)胞和正常卵巢上皮細(xì)胞(IOSE80)分別以1×105個(gè)/孔的密度接種于12孔板，培養(yǎng)24 h后吸去上清液，收集細(xì)胞，依照RNA提取試劑盒說明書中的方法提取細(xì)胞總RNA。然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR，引物序列如表1所示，反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 20 s，60℃ 1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。按照2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

4.細(xì)胞活力的檢測(cè)：pcDNA3.1-TWIST2質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，向培養(yǎng)板中加入不同濃度(5、10、20、40、80、160 μg/ml)的WST-8，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔并設(shè)空白對(duì)照，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔加入20 μl CCK溶液，孵育24 h；酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

5.細(xì)胞凋亡率的測(cè)定：pcDNA3.1-TWIST2或陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種在6孔板中。根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說明，用冷的PBS將細(xì)胞洗滌兩次，然后用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中的膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI染色。細(xì)胞凋亡率用流式細(xì)胞儀分析。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量：提取組織和細(xì)胞的總蛋白，BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白含量。分別從每個(gè)組織和細(xì)胞樣品取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；室溫5%脫脂奶粉封閉1 h，加入用3% BSA按1∶1 000稀釋的TWIST2、GAPDH一抗，按1∶500稀釋的FGF21、p-AMPK、p-mTOR一抗，4℃過夜；二抗按1∶10 000稀釋，室溫孵育2 h，TBST清洗后，ECL顯影，凝膠成像儀拍照(GAPDH為內(nèi)參)。

7.細(xì)胞氧化應(yīng)激的檢測(cè)：將pcDNA3.1-TWIST2、陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞中，用于以下實(shí)驗(yàn)：(1)ROS含量檢測(cè)：將各組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞；用濃度為10 μmol/L的DCFH-DA重懸細(xì)胞，根據(jù)ROS檢測(cè)試劑盒說明書操作，37℃避光孵育20 min，棄上清液，PBS清洗3遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。(2)SOD活性檢測(cè)：采用WST-8法檢測(cè)SOD活性，將各組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，48 h后收細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，按照SOD檢測(cè)試劑盒說明書操作，取20 μl樣品，依次加入150 μl WST-8/酶工作液和20 μl反應(yīng)啟動(dòng)液，37℃孵育20 min，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。(3)ATP含量檢測(cè)：按照ATP檢測(cè)試劑盒說明書配制ATP檢測(cè)工作液，各組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，48 h后收細(xì)胞提取蛋白質(zhì)；100 μl檢測(cè)工作液中加入50 μl樣本液，37℃避光孵育30 min，波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度值。(4)NAD+/NADH檢測(cè)：按照NAD+/NADH檢測(cè)試劑盒配制檢測(cè)液，細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，48 h后收細(xì)胞提取蛋白；將80 μl配置好的樣本液加入檢測(cè)液中，37℃避光孵育1 h，在波長(zhǎng)460 nm處測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、熒光顯微鏡和qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況

TWIST2組、陰性對(duì)照組和FGF21組的SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)了48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率均在50%以上，空白對(duì)照組未見綠色熒光(圖1)。

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA3.1-TWIST2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞后，TWIST2組的TWIST2 mRNA表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組(P<0.01)。pcDNA3.1-FGF21質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞后，F(xiàn)GF21組的FGF21 mRNA表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組(P<0.01)(圖2)。

A、E：空白對(duì)照組；B、F：陰性對(duì)照組；C、G：TWIST2組；D、H：FGF21組圖1 熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

A：TWIST2 mRNA表達(dá)水平；B：FGF21 mRNA表達(dá)水平。與TWIST2組或FGF21組比較，*P<0.01圖2 各組細(xì)胞中TWIST2與FGF21的mRNA表達(dá)水平

二、TWIST2在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)

利用qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組織和細(xì)胞中TWIST2的表達(dá)量。結(jié)果顯示，TWIST2在卵巢癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁組織(P<0.05)(圖3)。TWIST2在SK-OV-3、HO-8910、COC1和A2780卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)量均顯著低于人正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)量(P<0.05)(圖4)。

三、TWIST2對(duì)卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3和HO-8910凋亡的影響

在SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TWIST2質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照質(zhì)粒后，檢測(cè)細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，TWIST2 組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著提高(P<0.05)(圖5)。

A：TWIST2 mRNA的表達(dá)量；B：TWIST2 蛋白的表達(dá)量。與癌旁組織比較，*P<0.05圖3 TWIST2在卵巢癌組織和癌旁組織中mRNA和蛋白表達(dá)水平

A：TWIST2 mRNA的表達(dá)量；B：TWIST2蛋白的表達(dá)量。與正常卵巢上皮細(xì)胞比較，*P<0.05圖4 TWIST2在正常卵巢上皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平

A：卵巢癌細(xì)胞活力比較；B：卵巢癌細(xì)胞凋亡率比較。與TWIST2組比較，*P<0.05。C：流式細(xì)胞儀檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞凋亡圖5 TWIST2對(duì)SK-OV-3和HO-8910兩種卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞活力與細(xì)胞凋亡率的影響

與空白對(duì)照組相比，TWIST2組凋亡蛋白caspase-3、促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量顯著降低，因此Bax/Bcl-2的比值顯著增大(P<0.05)(圖6)。以上結(jié)果說明TWIST2促進(jìn)SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞的凋亡。

A：caspase-3蛋白表達(dá)量；B：Bax/Bcl-2比值。與TWIST2組比較，*P<0.05。C：Western blot檢測(cè)caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白條帶圖圖6 TWIST2對(duì)SK-OV-3和HO-8910兩種卵巢癌細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)量和Bax/Bcl-2比值的影響

四、TWIST2對(duì)卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3和HO-8910氧化應(yīng)激的影響

SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TWIST2質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照質(zhì)粒后，檢測(cè)不同處理組細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)因子的水平。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，TWIST2組ROS水平顯著增加(P<0.05)，NAD+/NADH及ATP水平顯著降低(P<0.05)；SOD的酶活力顯著降低(P<0.05)(圖7)。以上結(jié)果說明TWIST2對(duì)SK-OV-3和HO-8910細(xì)胞的氧化應(yīng)激起到促進(jìn)作用。

五、TWIST2對(duì)FGF21及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白的影響

在SK-OV-3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TWIST2質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照質(zhì)粒后檢測(cè)FGF21、p-AMPK和p-mTOR的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，TWIST2組中FGF21、p-AMPK、p-mTOR蛋白的表達(dá)量顯著降低(P均<0.05)(圖8)。

A：ROS水平比較；B：NAD+/NADH水平比較；C：ATP水平比較；D：SOD活力比較。與TWIST2組比較，*P<0.05圖7 TWIST2對(duì)SK-OV-3和HO-8910兩種卵巢癌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

A：Western blot檢測(cè)FGF21、p-AMPK和p-mTOR蛋白的條帶圖；B：FGF21蛋白表達(dá)量；C：p-AMPK蛋白表達(dá)量；D：p-mTOR蛋白表達(dá)量。與TWIST2組比較，*P<0.05圖8 TWIST2對(duì)卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3中FGF21、p-AMPK和p-mTOR蛋白表達(dá)量的影響

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21在卵巢癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織中的表達(dá)量(P<0.05)，且FGF21與TWIST2在卵巢癌組織中的表達(dá)量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.625 4，P<0.01)(圖9)。以上結(jié)果說明TWIST2可以抑制FGF21的表達(dá)，抑制AMPK/mTOR通路的激活。

六、FGF21介導(dǎo)的AMPK/mTOR通路參與TWIST2對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用機(jī)制

為了進(jìn)一步探究TWIST2對(duì)卵巢癌細(xì)胞作用的分子機(jī)制，在SK-OV-3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TWIST2質(zhì)粒、pcDNA3.1-FGF21質(zhì)?；駻MPK激活劑(A-769662)，檢測(cè)不同處理組的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞氧化應(yīng)激情況。結(jié)果顯示，與TWIST2組比較，轉(zhuǎn)染FGF21質(zhì)粒及AMPK激活劑后p-AMPK、p-mTOR蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和ROS的水平顯著降低(P<0.05)，逆轉(zhuǎn)了TWIST2的抑制作用(圖10)。以上結(jié)果表明FGF21介導(dǎo)的AMPK/mTOR通路參與TWIST2對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用途徑。

A：FGF21蛋白表達(dá)水平；與癌旁組織比較，*P<0.05。B：TWIST2和FGF21的相關(guān)性圖9 卵巢癌組織中FGF21蛋白表達(dá)水平及FGF21與TWIST2的相關(guān)性

A：Western blot檢測(cè)p-AMPK、p-mTOR的蛋白條帶圖；B：p-AMPK蛋白表達(dá)水平；C：p-mTOR蛋白表達(dá)水平；D：卵巢癌細(xì)胞凋亡率；E：ROS水平變化。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與TWIST2組比較，#P<0.05圖10 FGF21和AMPK激活劑對(duì)TWIST2組氧化應(yīng)激水平和凋亡率的影響

討 論

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌[11]。卵巢惡性腫瘤中以上皮癌最多見，其次是惡性生殖細(xì)胞腫瘤。卵巢上皮癌死亡率居各類婦科腫瘤的首位，對(duì)女性生命造成嚴(yán)重威脅[12]。由于卵巢位于盆腔深處、體積小，發(fā)生病變時(shí)缺乏典型臨床癥狀，所以很難早期發(fā)現(xiàn)。卵巢上皮癌患者手術(shù)中局限于原發(fā)灶的病例較少，大多數(shù)病例的癌細(xì)胞已擴(kuò)散到盆腹腔各個(gè)器官，所以早期診斷卵巢上皮癌是臨床難題之一，對(duì)卵巢上皮癌進(jìn)行更深層次的研究報(bào)道越來越多。

許多研究發(fā)現(xiàn)TWIST2在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了核心作用，其主要通過影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)從而改變腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力[13]。TWIST2在腫瘤發(fā)生中有雙重作用，該蛋白在多種人類腫瘤中均有高表達(dá)，具有致瘤作用，但在某些腫瘤中表達(dá)降低，具有抑瘤作用[14]。但是，TWIST2在卵巢癌中的報(bào)道較少，尤其是對(duì)TWIST2在腫瘤中所參與的信號(hào)通路和分子機(jī)制的研究較少。2016年Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TWIST2通過調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用途徑中整合素α6(ITGA6)和整合跨膜糖蛋白44(CD44)的表達(dá)，促進(jìn)了腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲，且與國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)合會(huì)(FIGO)確定的腎癌分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)。此外，相比于TWIST1，抑制TWIST2其表達(dá)后可以顯著上調(diào)E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)表達(dá)同時(shí)下調(diào)N-Cadherin表達(dá)，進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[16]。然而，TWIST2對(duì)癌癥淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機(jī)制和信號(hào)通路，仍有待進(jìn)一步探索。與上述結(jié)論一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)，TWIST2可以顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說明TWIST2在人類卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

FGF21是FGF家族中的一員，是一種主要介導(dǎo)糖脂代謝的內(nèi)分泌因子，在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)、保護(hù)肝臟、心臟、腎臟和皮膚免受損害以及癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。近年來，有證據(jù)表明FGF21在抗衰老過程中起著關(guān)鍵作用，F(xiàn)GF21治療方案可改善多種與年齡相關(guān)的代謝性疾病的進(jìn)程，包括肥胖、2型糖尿病、癌癥、腎臟和心血管疾病等[18]。且過表達(dá)FGF21的轉(zhuǎn)基因小鼠壽命比正常小鼠顯著延長(zhǎng)[19]。此外，F(xiàn)GF21通過調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)水平延緩內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)制衰老[20]。FGF21還可以通過調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生，抑制血管緊張素誘導(dǎo)的人類大腦血管平滑肌細(xì)胞衰老[21]。然而FGF21在癌癥發(fā)展過程中的研究報(bào)道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌患者組織中FGF21水平與癌癥分期呈正相關(guān)，且與復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，重組FGF21可以通過激活癌細(xì)胞中的FGFR信號(hào)軸和EMT信號(hào)導(dǎo)致腫瘤具有侵襲性[22]。在本研究中，我們深入探討了FGF21在卵巢癌中的表達(dá)水平和作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FGF21在卵巢癌組織中表達(dá)量顯著增加，且可以保護(hù)卵巢癌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，降低卵巢癌細(xì)胞的凋亡率，發(fā)揮促癌作用。

在本研究中，TWIST2在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)量均顯著低于癌旁組織和正常卵巢上皮細(xì)胞的表達(dá)量；過表達(dá)TWIST2可以顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡；此外，過表達(dá)TWIST2可以抑制FGF21蛋白及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；進(jìn)一步的研究結(jié)果表明FGF21介導(dǎo)的AMPK/mTOR通路參與TWIST2對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用途徑。

綜上所述，本研究證明TWIST2能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，其作用機(jī)制是通過調(diào)控FGF21介導(dǎo)的AMPK/mTOR通路來實(shí)現(xiàn)的，這為臨床上卵巢癌的診斷和治療提供了理論依據(jù)。