長江口中華絨螯蟹雌蟹洄游期的腸道菌群多樣性

徐靜靜　馮廣朋　陳建華　孫雪娜　黃曉榮

摘要：采集長江口生殖洄游期中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）雌蟹樣品，利用16SV4區(qū)高通量測序技術(shù)研究其抱卵前后腸道菌群的多樣性特征，探討腸道菌群結(jié)構(gòu)組成及與其食性特征的相關(guān)性。結(jié)果表明，雌蟹抱卵前和抱卵后的腸道樣品中共檢測出313個和376個OUT，特有OUT分別為112個和175個，占比分別為35.78%和46.54%。就門水平而言，柔膜菌門（Tenericutes）、變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）是其腸道的主要菌群;雌蟹抱卵前和抱卵后的腸道菌群具有顯著性差異，變形菌門和厚壁菌門的豐度抱卵后小于抱卵前，而柔膜菌門豐度抱卵后大于抱卵前。就屬水平而言，Candidatus_Bacilloplasma和Candidatus_Hepatoplasma是其腸道的主要菌群屬，抱卵前占比分別為26.54%和25.81%;抱卵后占比分別為30.29%和29.05%，2個屬的豐度在抱卵前后無顯著差異。與抱卵前相比較而言，抱卵后雌蟹腸道菌群Chao指數(shù)和ACE指數(shù)升高，豐度增加，而辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)保持穩(wěn)定，抱卵前后雌蟹腸道菌群的多樣性無顯著性變化。本研究揭示由于長江口中華絨螯蟹雌蟹的攝食習(xí)性和餌料組成在抱卵前后產(chǎn)生了變化，會對其腸道微生物多樣性產(chǎn)生一定的影響。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）;高通量測序;腸道菌群;多樣性

中圖分類號：S932.5+2文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0146-06

作者簡介：徐靜靜（1992—），女，河南周口人，碩士研究生，主要從事水生動物生理生態(tài)學(xué)研究。E-mail：65807898@163.com。

通信作者：馮廣朋，博士，研究員，主要從事漁業(yè)資源增殖養(yǎng)護與開發(fā)利用研究。E-mail：fgp7711@163.com。

中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）俗稱河蟹，廣泛分布于我國長江、黃河、甌江等流域[1]，屬于洄游性甲殼類動物，受精卵在河口淺海處孵化成幼體后，溯河洄游至長江中部的淡水湖泊中進行生長肥育，當(dāng)親蟹性腺發(fā)育成熟后，重新生殖洄游至長江口咸淡水處進行交配產(chǎn)卵，產(chǎn)卵場主要位于長江口崇明東灘及九段沙下游水域（121°58′～122°12′E、31°05′～31°22′N）[2]。胃含物形態(tài)學(xué)食性鑒定分析表明，洄游期的中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后餌料來源多樣，包括水生植物、藻類、甲殼類、多毛類、魚類、軟體動物、棘皮動物、卵、顆粒碎屑等，屬雜食性水生動物[3]。同哺乳動物一樣，水生動物腸道中亦擁有豐富多樣的微生物。經(jīng)過長期的適應(yīng)和自然選擇，腸道菌群和宿主最終可形成相互依賴的共生體系。一方面，腸道菌群依靠宿主養(yǎng)分賴以生存，另一方面，腸道菌群在代謝過程中產(chǎn)生的消化酶、維生素等產(chǎn)物可促進宿主機體的消化與營養(yǎng)吸收[4]。如朱曉燕等研究發(fā)現(xiàn)，魚類腸道中嗜水氣單胞菌分泌的胞外酶可促進淀粉和蛋白質(zhì)的消化[5]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，飼料中益生菌的添加可改善腸道菌群組成，抑制腸道內(nèi)有害菌群的繁殖，提高宿主的消化機能，對機體生長具有促進作用[6-8]。

16SrRNA高通量測序技術(shù)能夠深入分析腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，具有速度快、準(zhǔn)確率高、靈敏性強等特點，被越來越多的學(xué)者應(yīng)用于腸道菌群多樣性的研究[9-11]。目前，關(guān)于魚類和蝦類腸道微生物的研究較多，而對河蟹腸道菌群多樣性知之甚少，近年相關(guān)研究主要集中在河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)[12-16]，以及飼料添加物，如乳鐵蛋白[17]、果膠、木聚糖[18]以及恩諾沙星和皮質(zhì)醇[19]對河蟹腸道菌群的影響等。本研究以長江口抱卵前后的中華絨螯蟹雌蟹為研究對象，采用16SrRNA高通量測序技術(shù)研究其腸道菌群結(jié)構(gòu)，探討洄游期抱卵前后雌蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異性，進而揭示雌蟹食性與腸道菌群的相關(guān)性，從微生物菌群的角度為蟹類的養(yǎng)殖生產(chǎn)與疾病防控提供科學(xué)依據(jù)，同時為中華絨螯蟹益生菌的開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

在長江口崇明東灘（122°4′～122°11′E、31°20′～31°25′N）采用監(jiān)測船和刺網(wǎng)采集中華絨螯蟹，在11月采集抱卵前雌蟹，在翌年1月采集抱卵后雌蟹。選取健康活潑、大小規(guī)格相似的抱卵前雌蟹（DK組）和抱卵后雌蟹（BK組）各4只作為測定腸道微生物的樣本材料。雌蟹先用無菌水沖洗，然后采用75%乙醇對其體表進行消毒，在超凈工作臺上解剖取出其腸道，去除腸內(nèi)容物，用無菌水輕微沖洗后，立即置于-80℃冰箱凍存，用于后期提取DNA。

1.2樣本總DNA的提取與PCR擴增[JP3]

采用FastDNATMSpinKitForSoil（MPBiomedicals，USA）進行樣本腸道微生物DNA的提取。DNA樣品濃度和質(zhì)量利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格后稀釋至1ng/μL作為擴增模板，使用含有barcode特異性引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）來擴增16SrRNA基因的V4區(qū)域。PCR反應(yīng)體系為20μL：PhusionMasterMix15μL，引物515F1μL，引物806R1μL，DNA模板1μL，蒸餾水2μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性1min;95℃變性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30個循壞;72℃退火5min，4℃保存。利用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳來檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量。質(zhì)量合格后使用QiagenGelExtractionKit純化試劑盒進行純化，使用QubitVersion@2.0（Invitrogen，USA）儀器進行定量。隨后利用TruSeqDNAPCR-FreeSamplePreparationKit（Illumina，USA）試劑盒進行文庫的構(gòu)建。構(gòu)建測序文庫后利用IlluminaHiSeqPE250平臺進行微生物16SrRNA基因V4區(qū)的高通量測序（北京諾禾致源技術(shù)有限公司）。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用滑動窗口法去除測序所得原始序列中的引物和標(biāo)簽，用Flash軟件根據(jù)Overlap關(guān)系對序列進行拼接[20]，對于無法拼接的Reads數(shù)據(jù)進行丟棄，利用Qiime軟件對上述拼接后的序列進行過濾[21]，利用Mothur軟件中Uchime的方法把過濾后的數(shù)據(jù)嵌合體序列清除[22]，得到最終分析的有效序列。

利用Uparse軟件（Uparsev7.0.1001，http：//drive5.com/uparse/）[23]進行OUT聚類，得到OUT代表序列。有效序列均一化處理后匹配OTU代表序列，獲得OTU聚類結(jié)果。另外，利用Mothur軟件[24]基于均一化的OUT數(shù)據(jù)得到稀釋性曲線。對OTU序列利用RDPClassifier（貝葉斯算法）進行分類學(xué)分析，得到對應(yīng)的物種分類信息（Silva數(shù)據(jù)庫），并在各個水平上統(tǒng)計每個樣本的群落組成。使用Muscle軟件進行代表序列的系統(tǒng)進化關(guān)系分析，獲得腸道微生物在不同分類水平上的分類。使用Qiime（Version1.7.0）和R軟件進行α多樣性指數(shù)和β多樣性分析（主成分分析PCoA）。利用SPSS22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，當(dāng)P<0.05時表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1測序深度

在IlluminaHiSeqPE250平臺對8個樣品16SrRNA基因的V4區(qū)域測序，由表1可知，經(jīng)過初步過濾后，獲得80105～80290條有效序列，有效序列中，堿基質(zhì)量值大于20的堿基占有效序列的86%以上，有效序列數(shù)目占原始序列數(shù)目90%，樣本經(jīng)過均一化后獲得有效序列以97%的相似性聚類到251個OUT上。由圖1可知，隨著序列數(shù)的增長，OUT稀釋曲線趨于飽和，說明雌蟹腸道菌群16SrRNA基因的V4區(qū)數(shù)據(jù)量可反映樣本腸道菌群的關(guān)系。

由表2可知，DK組和BK組的平均OTU數(shù)目分別為313個和376個，其中，2組共有OUT數(shù)量為201個，特有OUT數(shù)目分別為112個和175個，分別占DK和BK2組樣品OTU總數(shù)的35.78%和46.54%。

2.2雌蟹抱卵前后腸道菌群的門分布

由圖2可知，在門水平，雌蟹抱卵前后腸道核心菌群沒有發(fā)生變化（除浮酶菌門外），均為柔膜菌門、變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和酸桿菌門。雌蟹抱卵前和抱卵后腸道中比例最高的優(yōu)勢門都是柔膜菌門。以上5種優(yōu)勢菌門在雌蟹抱卵前腸道菌群門中占比分別為39.84%、20.12%、15.52%、8.07%和9.01%;在抱卵后腸道菌群門中占比分別為58.00%、5.12%、13.07%、9.09%和7.01%。

由圖3可知，雌蟹發(fā)育成抱卵蟹的過程中，腸道菌群中柔膜菌門、變形菌門和厚壁菌門占比在雌蟹抱卵前后具有顯著差異，變形菌門和厚壁菌門的豐度抱卵后小于抱卵前，而柔膜菌門豐度抱卵后大于抱卵前。

2.3雌蟹抱卵前后腸道菌群的屬分布

由圖4可知，雌蟹抱卵前后的主導(dǎo)菌屬為Candidatus_Bacilloplasma和Candidatus_Hepatoplasma，這2種菌屬在雌蟹抱卵前腸道菌屬中占比分別為26.54%和25.81%，抱卵后的占比分別為30.29%和29.05%。Candidatus_Bacilloplasma和Candidatus_Hepatoplasma這2個屬的豐度在雌蟹抱卵前后無顯著性差異（P>0.05）?；【鷮伲╒ibrio）和氣單胞菌屬（Aeromonas）是雌蟹抱卵前后菌屬的重要組成部分，抱卵前占比分別為6.87%和8.03%;抱卵后占比分別為5.34%和7.77%?；【鷮俸蜌鈫伟鷮俚呢S度在雌蟹抱卵前后無顯著性差異（P>0.05）。乳桿菌屬（Lactobacillus）的豐度抱卵后大于抱卵前（P<0.05），棍狀厭氧菌（Anaerorhabdus）的豐度抱卵后小于抱卵前（P<0.05）。除上述菌屬外，雌蟹抱卵前后的腸道菌群屬另有擬桿菌屬、Prolixibacter、未辨認(rèn)的支原體屬、Dysgonomonas等。

通過對不同樣本組腸道微生物的方差分析（A-MOVA）表明，雌蟹抱卵前后的腸道微生物的P=0.041，表明雌蟹抱卵前后的腸道菌群差異顯著（P<0.05）。

2.4樣品α和β多樣性分析

由圖5可知，對DK和BK這2組8個樣本通過NMDS-weighted（NonmetricMultidimensionalScaling，非度量多維尺度）分析可知，雌蟹抱卵前后腸道微生物群落具有明顯差異。

采用Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、辛普森指數(shù)（Simpsonindex）和香農(nóng)指數(shù)（Shannonindex）對樣本菌群的豐富度和多樣性進行評估，由圖6可知，雌蟹在抱卵發(fā)育過程中Chao指數(shù)和ACE指數(shù)逐漸增加，表明腸道菌群豐度逐漸增加;辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)保持相對穩(wěn)定，表明腸道菌群的多樣性未發(fā)生顯著變化。

3討論

3.1雌蟹抱卵前后腸道菌群多樣性差異

生物體內(nèi)腸道微生物主要來源于周圍環(huán)境、土壤和食物[25-26]，并在生物體的不同生長發(fā)育階段往往會發(fā)生變化[27]。繁殖期作為生物體的關(guān)鍵時期，生物體的新陳代謝強度相對較高，體內(nèi)的腸道微生物亦會發(fā)生一定變化[28]。本研究結(jié)果表明，抱卵后雌蟹腸道微生物多樣性大于抱卵前（P<0.05），與暗黑鰓金龜（Holotrichiaparallela）性腺發(fā)育期腸道微生物多樣性逐漸增加的結(jié)果類似[29]，與胡亞強等對不同生長階段團水虱（Sphearoma）腸道微生物的研究結(jié)論[30]一致。目前，關(guān)于不同發(fā)育階段生物體腸道微生物的變動機制仍不清楚，推測與其性激素的分泌有一定關(guān)系[31-32]。

攝食亦是影響腸道群落結(jié)構(gòu)的重要因素之一[33-34]，Munro等發(fā)現(xiàn)，魚類攝取的活餌料是其腸道菌群的主要來源[35];郝耀彤等認(rèn)為食物的改變會對草魚腸道微生物菌群產(chǎn)生快速而顯著的影響[36]。另有研究表明，雌蟹動物性餌料占比抱卵前大于抱卵后，而藻類和水生植物占比抱卵前小于抱卵后[3]，推測本研究中抱卵前后雌蟹腸道微生物具有差異，亦與其攝食不同的餌料有關(guān)。Ley等研究發(fā)現(xiàn)，陸生動物腸道菌群多樣性與食性有關(guān)，從肉食性、雜食性到草食性表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢[37]。而Mrazek等研究發(fā)現(xiàn)蟑螂（Nauphoetacinereaoliv）的腸道菌群多樣性大于黃蜂（Vespulavulgaris）和蜜蜂（Apismellifera），認(rèn)為昆蟲腸道菌群多樣性從草食性到雜食性逐漸增加[39]。[JP3]本研究結(jié)果與陸生動物研究結(jié)果類似，但與昆蟲的研究結(jié)果相反，這可能是因為攝食對腸道菌群的影響具有一定的物種特異性，[JP3]另外不同的研究取樣部位也可能對菌群組成產(chǎn)生一定影響。

3.2雌蟹抱卵前后腸道菌門差異性

在雌蟹腸道菌群的類別分析中發(fā)現(xiàn)，柔膜菌門、變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為雌蟹腸道中的核心菌群，其中，柔膜菌門是腸道中的第一優(yōu)勢菌門，這一結(jié)果與金貝等對陽澄湖河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究[16]類似，表明柔膜菌門在其腸道中具有重要作用。柔膜菌門在腸道菌群中的占比抱卵后顯著大于抱卵前，抱卵后占比較高的原因可能與柔膜菌門是維持生物體胚胎健康生長發(fā)育的微生物有關(guān)[39]。除柔膜菌門外，變形菌門和厚壁菌門是雌蟹抱卵前的優(yōu)勢菌門;厚壁菌門和擬桿菌門是抱卵后的優(yōu)勢菌門，這表明雌蟹抱卵前后的腸道菌群存在一定差異，這與變形菌門和擬桿菌門在雌蟹腸道中發(fā)揮的不同作用有關(guān)。

本研究中，雌蟹抱卵前后浮霉菌門豐度也存在一定差異，抱卵后顯著大于抱卵前。研究表明，浮霉菌門多存在于厭氧環(huán)境下，并且包含多種厭氧氨氧化細(xì)菌，底泥中相對含量較高[40]。雌蟹抱卵后浮霉菌門含量較高的原因可能與抱卵后食性有關(guān)，雌蟹抱卵后行動能力弱，攝食種類受限，因此攝食比較多的顆粒碎屑和底泥，導(dǎo)致浮霉菌門在其腸道中比例增加。

3.3雌蟹抱卵前后腸道菌屬差異性

就屬水平而言，Candidatus_Bacilloplasma和Candidatus_Hepatoplasma在抱卵前后的雌蟹腸道菌群中均占較大比例，其中，Candidatus_Hepatoplasma被認(rèn)為是中華絨螯蟹雌蟹和雄蟹腸道中共有的優(yōu)勢菌[16]，揭示該菌群在中華絨螯蟹腸道內(nèi)發(fā)揮重要作用，而Candidatus_Bacilloplasma則可能是雌蟹腸道中的一種潛在優(yōu)勢菌。

棍狀厭氧細(xì)菌是一種腸桿菌，通常不會分解糖，多存在于肉食性生物腸道內(nèi)[41];乳桿菌（Lactobacillus）在食草動物腸道內(nèi)存在較多[42]。雌蟹腸道菌群中棍狀厭氧菌的占比抱卵前大于抱卵后（P<0.05），而乳桿菌占比抱卵前小于抱卵后（P<0.05），可能是由于雌蟹抱卵后行動力減弱，植物性餌料比重升高造成的。另外，氣單胞菌屬在雌蟹抱卵前后的腸道中廣泛存在，但由于其抗菌能力的強弱會根據(jù)宿主類型的不同而變化，因此氣單胞菌屬在中華絨螯蟹抗病性中是否如同在草魚中一樣發(fā)揮積極作用[43]，仍有待于進一步研究。

4小結(jié)

長江口中華絨螯蟹雌蟹腸道菌群多樣性豐富，柔膜菌門、變形菌門和厚壁菌門是其腸道的主要菌群，在雌蟹的生殖洄游期略有波動。結(jié)合中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后食性分析結(jié)果表明，由于抱卵前后中華絨螯蟹雌蟹的攝食習(xí)性和餌料組成不同，會對其腸道微生物多樣性產(chǎn)生一定影響，但并非唯一影響因素。目前來看，菌群在雌蟹腸道中發(fā)揮的作用不是十分明確，還需深入研究。

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