考氏科薩克氏菌產(chǎn)阿魏酸酯酶條件優(yōu)化、酶學性質(zhì)及其初步應用

章宇丹，溫雪瓶，李 麗*，劉 軍，劉雪嬌，馮潔雅

（四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644005）

阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase，F(xiàn)AE）E.C.3.1.1.73又名肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶，可以水解阿魏酸酯、多糖阿魏酸酯和低聚糖阿魏酸酯，屬于羧酸酯水解酶的一個亞類[1]。該酶能夠水解植物細胞壁中阿魏酸或相關肉桂酸與多糖如阿拉伯木聚糖、果膠之間的酯鍵，釋放出游離的阿魏酸或阿魏酸二聚體[2]，從而對植物細胞壁起到降解作用[3]。阿魏酸酯酶還可以與木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素內(nèi)酯酶等協(xié)同作用更加徹底的降解植物細胞壁[4]。由于FAE的作用功能使得其在食品、飼料、紡織、造紙、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、生物能源等領域均有廣泛的應用[5-8]。

阿魏酸又名4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是一種存在于許多植物細胞壁中的一種重要的酚酸物質(zhì)，如高粱、蘆根、麥稈、麥麩、米糠、玉米皮、洋蔥皮、發(fā)酵茶等植物細胞壁中，具有抗氧化、抗血栓、抗輻射、抗血小板凝集、改善心腦血管健康、對老年人具有恢復和改善記憶等功能[9-13]。阿魏酸可作為特定保健用食品素材，也可作為有益于人體健康的益生元功能配料應用于食品飲料和膳食補充劑[14-15]。酒中阿魏酸的產(chǎn)生可以是在制曲和發(fā)酵過程中被微生物釋放出來，也可以是在制曲和發(fā)酵過程中形成中間產(chǎn)物，再由微生物轉(zhuǎn)化成阿魏酸，阿魏酸酯酶可以打破植物細胞壁中的酯鍵，進而釋放阿魏酸[16-20]。據(jù)目前研究表明釀酒原料中的阿魏酸釋放率很低，研究提高釀造過程中阿魏酸的釋放量是很有必要的[21]。

國外沒有固態(tài)發(fā)酵的釀制白酒方式，因此對白酒中阿魏酸的研究較少。國內(nèi)目前對阿魏酸的研究主要集中在飼料、紡織、造紙、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、生物能源等領域。隨著我國國民收入水平的提高，人們對生活質(zhì)量的要求也越來越高，在保障白酒安全生產(chǎn)的同時還要讓白酒有益于消費者的健康，健康飲酒已經(jīng)成為中國白酒的新趨勢。利用科技力量，剖析傳統(tǒng)工藝白酒中的成分以及找尋天然植物中的健康成分。

本試驗以前期從濃香型白酒釀造過程中篩選出的一株產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株考氏科薩克氏菌（Kosakonia cowanii）為研究對象，對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，并研究該菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活性質(zhì)及在麩皮、糟醅和大曲中的發(fā)酵應用。本研究旨在為之后研究提高白酒中的阿魏酸含量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和材料

考氏科薩克氏菌（Kosakonia cowanii）：本實驗室保存；大曲、糟醅：瀘州某酒廠；麩皮：市售。

1.1.2 化學試劑

NaCl、瓊脂粉、（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O、C6H8O7·H2O、甲醇、Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；二甲基甲酰胺、FeCl3（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；阿魏酸乙酯、阿魏酸甲酯（均為分析純）：阿拉丁控股集團有限公司；醋酸（分析純）：賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.3 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO40.37 g，CaCl2·2H2O 0.07 g，F(xiàn)eCl30.02 g，酵母粉1.0 g，5 mL阿魏酸乙酯溶液（含10%的二甲基甲酞胺，V/V），水1 L。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LS-28HD立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；TGL-16M離心機：湘儀離心機儀器有限公司；SWCJ-1FD超凈工作臺：上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；HWS-260A恒溫恒濕培養(yǎng)箱：杭州綠博儀器有限公司；SPH-1102恒溫搖床：上海世平試驗設備有限公司；T6新世紀紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；1200型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備[22]

菌株Kosakonia cowanii以1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于180 r/min、32 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)72 h，發(fā)酵完后取9 mL發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，保留上清液，即獲得粗酶液。

1.3.2 酶學特性的研究

（1）酶的最適溫度及穩(wěn)定性

取2 mL緩沖液（pH 6.0）于試管中，加入2 mL 1 mmol/L阿魏酸甲酯溶液，分別放置于溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的水浴鍋中反應5 min，再分別加入1 mL酶液，水浴20 min，沸水滅酶終止反應，混勻后以對照組為空白（失活的酶液）測定波長320 nm處的吸光度值，以酶活最高者為100%，計算相對酶活性[23]。

將粗酶液分別放置于溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃的水浴鍋中保溫50 min，每隔10 min檢測一次酶活性，統(tǒng)一在50 ℃水浴鍋中反應。以各溫度的初始酶活為100%，計算相對酶活性。

（2）酶的最適pH及穩(wěn)定性

取2 mL緩沖液（pH 2.6、3.2、3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0）于試管中，加入2 mL 1 mmol/L阿魏酸甲酯溶液，置于50 ℃水浴鍋中反應5 min，再分別加入1 mL酶液，在50 ℃水浴鍋中反應20 min，沸水終止反應，混勻后以對照組為空白（失活的酶液）測定波長320 nm處的吸光度值，以酶活最高者為100%，計算相對酶活性。配制不同pH（3.2、3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0）緩沖液，與粗酶液等量混合，在4 ℃冰箱中放置2 h，測定剩余酶活，以各pH值的初始酶活為100%，計算相對酶活。

1.3.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

（1）單因素試驗

菌株Kosakonia cowanii預先進行活化，以接種量分別為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%接種到培養(yǎng)基中，裝液量分別為30 mL/250 mL、60 mL/250 mL、90 mL/250 mL、120 mL/250 mL、150 mL/250 mL，初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0，分別置于溫度為28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃的搖床中，180 r/min培養(yǎng)72 h，檢測酶活，考察不同接種量、裝液量、初始pH值、溫度對酶活的影響，每個試驗設置3個平行樣。

1.3.4 分析檢測

（1）阿魏酸酯酶酶活檢測

檢測方法：取9 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清液，即獲得粗酶液。取2 mL阿魏酸甲酯溶液和2 mL檸檬酸緩沖液（pH 6.0）在溫度為50 ℃水浴鍋中水浴5 min，再加入1 mL粗酶液，反應20 min，沸水滅酶終止反應，以煮沸失活的酶液為空白，在波長320 nm條件下測定溶液吸光度值。

阿魏酸酯酶酶活定義：1 mL酶液在50 ℃、pH 6.0條件下，每分鐘酯解阿魏酸甲酯，生成1 μmol阿魏酸所需酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）。

（2）阿魏酸檢測

檢測方法：在糟醅、大曲和麩皮三角瓶中加入體積分數(shù)70%甲醇，所加體積分別為45 mL、55 mL、80 mL，放置于溫度為30 ℃、180 r/min的搖床中搖30 min，然后10 000 r/min離心10 min，獲得上清液，將上清液用0.22 μm濾膜過濾，進行HPLC分析。并按照標準曲線回歸方程y=-8.633 3+53.960 4x（R2=0.999 95）計算阿魏酸含量[24]。

色譜條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外檢測器，檢測波長320 nm，柱溫25 ℃，流動相為甲醇和5%醋酸（25∶75，V/V），流速1 mL/min，進樣量10 μL[25]。

1.3.5 菌株初步應用探究

（1）麩皮發(fā)酵

麩皮與水的料液比為1∶1（g∶mL），將稱好的麩皮放入盆中，加水拌勻，稱取40 g裝入三角瓶中，共8瓶，滅菌。將菌株進行活化，以3%的接種量接種到滅菌的麩皮中，放置于溫度為34 ℃的培養(yǎng)箱中進行有氧發(fā)酵，每天檢測阿魏酸含量，空白組為不加菌的麩皮。設置3個平行。

（2）糟醅發(fā)酵

稱取45 g糟醅加入已滅菌的三角瓶中，用保鮮膜封口，共15瓶，分為兩組，一組為實驗組，共7瓶，一組為對照組，每組8瓶。將菌株進行活化，以3%的接種量接種到實驗組中，將實驗組和對照組都放置于溫度為34 ℃的培養(yǎng)箱中進行厭氧發(fā)酵，每天檢測阿魏酸含量，對照組不加菌。設置3個平行。

（3）大曲發(fā)酵

稱取35 g大曲加入已滅菌的三角瓶中，共15瓶，分為兩組，一組為實驗組，共7瓶，一組為對照組，每組8瓶。將菌株進行活化，以3%的接種量接種到實驗組中，將實驗組和對照組都放置于溫度為34 ℃的培養(yǎng)箱中進行有氧發(fā)酵，每天檢測阿魏酸含量，對照組不加菌。設置3個平行。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用平均值±標注誤差表示，使用SPSS 22.0進行單因素方差分析，并采用Duncan檢驗法進行多重比較，以P＜0.05作為差異性顯著判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.1.1 裝液量對產(chǎn)酶的影響

由圖1可知，培養(yǎng)基裝液量對酶活是有影響的，當裝液量為30～90 mL/250 mL時，隨著裝液量的增加而增加；裝液量達到90 mL/250 mL時，酶活最大，為28.27 U/L；當裝液量＞90 mL/250 mL后酶活逐漸減小。因此，最適裝液量為90 mL/250 mL。

圖1 裝液量對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of liquid medium volume on enzyme production

2.1.2 培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，培養(yǎng)基的初始pH值對于微生物的生長和產(chǎn)酶都有一定的影響。不同的初始pH對菌株產(chǎn)酶是有影響的，該菌株在初始pH值為5.0～8.0范圍下均能產(chǎn)酶，在初始pH值為5.5時，酶活最大，約為27.34 U/L。隨著初始pH值的增大，酶活呈遞減趨勢。因此，最適初始pH值為5.5。

圖2 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of medium initial pH value on enzyme production

2.1.3 接種量對于產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，不同的接種量對酶活是有影響的，隨著接種量在0.5%～4.0%范圍內(nèi)的提高，酶活隨之增高，當接種量為4%，酶活最高，為27.12 U/L；當接種量＞4%后，酶活減少。

圖3 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inoculum on enzyme production

2.1.4 溫度對產(chǎn)酶的影響

由圖4可知，溫度的變化影響酶活的大小，隨著溫度在28～34 ℃范圍內(nèi)的升高，酶活呈遞增趨勢，當溫度為34 ℃時，酶活最高；當溫度＞34 ℃后隨著溫度的升高，酶活呈遞減趨。

圖4 溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme production

2.1.5 優(yōu)化后產(chǎn)酶情況

根據(jù)前面的研究，將菌株以4%接種量接種到培養(yǎng)基中，裝液量為90 mL/250 mL，初始pH為5.5，在溫度為34 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3 d，檢測酶活。結(jié)果表明，優(yōu)化后酶活為28.27 U/L，比優(yōu)化前提高了20.92%。

2.2 酶學特性的研究

2.2.1 酶最適溫度及熱穩(wěn)定性

阿魏酸酯酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性，最適pH值及pH穩(wěn)定性分別見圖5和圖6。

圖5 阿魏酸酯酶的最適溫度（A）及熱穩(wěn)定性（B）Fig.5 Optimal temperature (A) and thermal stability (B) of ferulic acid esterase

由圖5A可知，當溫度＜50 ℃時，酶活呈逐漸上升狀態(tài)，這是因為在此溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，促進了反應速度；當溫度為50 ℃，此時相對酶活最高為100%；當溫度＞50 ℃時，隨著溫度的升高，酶活呈下降狀態(tài)，這是因為過高的溫度會導致酶蛋白開始變形。因此，酶的最適溫度為50 ℃。

由圖5B可知，阿魏酸酯酶在30～40 ℃范圍內(nèi)時穩(wěn)定性很好，在溫度為50 ℃時表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，50 ℃保溫50 min后，酶活仍保留58.96%。但當溫度為60 ℃時，阿魏酸酯酶穩(wěn)定性較差，保溫50 min后殘余酶活不到20%。

2.2.2 酶最適pH及pH穩(wěn)定性

由圖6A可知，pH值為5.6時相對酶活最高為100%，兩邊呈遞減狀態(tài)，這是因為pH會改變底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，進而影響酶和底物的結(jié)合，而且過高或過低的pH都會影響酶的穩(wěn)定性，從而使酶遭受不可逆的破壞。因此，酶的最適pH值為5.6。

圖6 阿魏酸酯酶的最適pH值（A）及pH穩(wěn)定性（B）Fig.6 Optimal pH value (A) and pH stability (B) of ferulic acid esterase

由圖6B可知，酶活在pH值為5.0～6.8范圍內(nèi)放置2 h，其酶活穩(wěn)定性較好，殘余酶活均在80%以上，pH值在3.2～3.8范圍內(nèi)，酶活穩(wěn)定性較差。

2.3 菌株Kosakonia cowanii初步應用

2.3.1 麩皮發(fā)酵

由圖7可知，麩皮發(fā)酵提取液在1～7 d，麩皮發(fā)酵釋放阿魏酸的含量呈現(xiàn)上升趨勢?？瞻捉M的麩皮阿魏酸含量為13.374 μg/g，麩皮發(fā)酵至第7天時的阿魏酸含量為16.3 715 μg/g，比空白組的麩皮阿魏酸含量提高了22.42%，該菌株發(fā)酵麩皮產(chǎn)生的阿魏酸酯酶，能夠釋放麩皮中的阿魏酸，從而提高釋放的阿魏酸含量，說明菌株發(fā)酵能夠提高麩皮中阿魏酸的釋放。

圖7 麩皮發(fā)酵對阿魏酸含量的影響Fig.7 Effect of bran fermentation on ferulic acid content

2.3.2 糟醅發(fā)酵

由圖8可知，第0天的糟醅發(fā)酵提取液中阿魏酸的含量為11.136 6 μg/g，接菌的糟醅發(fā)酵第一天的阿魏酸含量與發(fā)酵0 d的糟醅發(fā)酵提取液中的阿魏酸含量相比有所增加，第二天之后呈現(xiàn)下降趨勢，可能是因為前期三角瓶中含有氧氣，菌株能夠生長，產(chǎn)生的阿魏酸酯酶釋放了糟醅中的阿魏酸，沒有氧氣后，糟醅中的阿魏酸不再被釋放，又因為阿魏酸被分解，所以阿魏酸的含量逐漸減少。對照組中糟醅的阿魏酸被分解，含量逐漸減少，沒有上升的過程。說明菌株在前期有氧條件下能起到釋放阿魏酸的作用的；氧氣消耗完后，菌株停止產(chǎn)酶，阿魏酸含量逐漸降低。

圖8 糟醅發(fā)酵對阿魏酸含量的影響Fig.8 Effect of distilled grains fermentation on ferulic acid content

2.3.3 大曲發(fā)酵

由圖9可知，第0天的大曲發(fā)酵提取液中阿魏酸的含量為4.054 8 μg/g，實驗組中的阿魏酸含量呈現(xiàn)遞增的趨勢。這是因為實驗組中接種的菌株產(chǎn)生阿魏酸酯酶，釋放了大曲中的阿魏酸，所以阿魏酸含量呈遞增趨勢。對照組中阿魏酸含量呈現(xiàn)先遞減后遞增的趨勢，出現(xiàn)遞增的趨勢可能是因為大曲中本身含有可以產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株，使大曲中的阿魏酸被釋放出來，所以出現(xiàn)遞增的趨勢。出現(xiàn)遞減的趨勢可能是因為前期阿魏酸的分解速度大于阿魏酸酯酶釋放阿魏酸的速度，所以出現(xiàn)遞減的趨勢。但是對照組與實驗組相比，對照組中的阿魏酸被釋放的含量較少，說明添加菌株有利于釋放大曲中阿魏酸，且能夠增加釋放阿魏酸的速度。

圖9 大曲發(fā)酵對阿魏酸含量的影響Fig.9 Effect of Daqu fermentation on ferulic acid content

3 結(jié)論

通過單因素優(yōu)化培養(yǎng)條件為：裝液量90 mL/250 mL、培養(yǎng)基初始pH值為5.5、接種量4%、溫度34 ℃。在此優(yōu)化條件下，酶活最高，酶活比優(yōu)化前提高了20.92%。阿魏酸酯酶最適反應溫度為50 ℃，在30～40 ℃時穩(wěn)定性良好；阿魏酸酯酶最適反應pH值為5.6，在pH值為5.0～6.8酶活穩(wěn)定性良好。通過菌株的初步應用探究得出，菌株能夠增加麩皮、大曲和糟醅中阿魏酸的釋放量，使得樣品中阿魏酸含量增加，為后續(xù)阿魏酸酯酶在白酒釀造中的應用奠定了一定基礎。