清香型白酒釀造核心功能微生物的研究與應(yīng)用

杜艾明，李 良，李俊薇，胡申才*

（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北 武漢 430050）

清香型白酒主要是以其無色、清亮透明、清香純正等特點深受廣大消費者的喜愛。除了大家熟知的山西汾酒、湖北黃鶴樓酒以及北京二鍋頭之外，河南寶豐酒、浙江同山燒、河南龍興酒、青稞酒、廈門高粱酒和天長帝酒等也都屬于清香型白酒。

清香型白酒具有“清香純正，醇甜柔和，自然諧調(diào)，余味爽凈”的風(fēng)格特點。這些風(fēng)格特點與清香型白酒的“清蒸清茬、地缸發(fā)酵、清蒸二次清”釀造工藝特點是緊密相關(guān)聯(lián)的。清香型白酒釀造工藝講究的就是“清字當(dāng)頭，凈字到底”，那么該釀造工序中微生物群落組成和演化交替過程是怎么樣的呢？釀造過程中產(chǎn)生了哪些風(fēng)味物質(zhì)？這些風(fēng)味物質(zhì)是如何代謝產(chǎn)生的？要回答好這些問題，就需要剖析微生物群落組成和解析風(fēng)味代謝物質(zhì)成分及形成機理，而隨著微生物基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，這些研究熱點問題都得到了一定程度的解答。本文對近年來清香型白酒釀造的微生物群落組成、核心微生物組成及相互作用和主要代謝風(fēng)味物質(zhì)及產(chǎn)生機理進行了歸納總結(jié)，以期為同行提供參考，推陳出新，釀造出質(zhì)量更好、營養(yǎng)健康價值更高的清香型白酒。

1 清香型白酒釀造工藝

從不同曲法發(fā)酵來看，清香型白酒主要有大曲清香、小曲清香、麩曲清香。大曲酒的生產(chǎn)工藝通常采用“清蒸清燒、地缸發(fā)酵、清蒸兩次清”。該工藝將發(fā)酵所用的粉碎高粱和輔料進行蒸煮處理，將蒸煮后的高粱拌入低溫大曲和輔料，置于埋入土中的陶瓷缸中發(fā)酵28 d后蒸得第一次酒，即大米查酒。蒸餾后的酒醅不再配入新料，只加曲和輔料后即可進行第二次發(fā)酵，28 d后取出蒸得第二次酒，即二米查酒。將兩次蒸餾后的酒儲存一定年限經(jīng)勾兌即得清香型白酒[1-2]。

2 釀造微生物群落組成及分布

釀造過程復(fù)雜，是自然發(fā)生的“多微共酵”固態(tài)發(fā)酵過程。曲粉作為發(fā)酵起始劑，在發(fā)酵過程的微生態(tài)中擔(dān)負著重要作用，但環(huán)境微生態(tài)因素和地缸不同相位所創(chuàng)造的不同小微生態(tài)位的影響作用也不容小覷。

2.1 大曲微生物群落組成

曲為酒之魂，不同來源的大曲，其中所含微生物種類也有著差別。ZHENG X W等[3]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reactiondenatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)從汾酒大曲中檢測到109種細菌和81種真菌，其中地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）占到了細菌總數(shù)的57%，另外短桿菌（Brevibacteriumsp.）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）等乳酸菌分別占到總細菌數(shù)的4%、17%、6%和6%。在DGGE法中還發(fā)現(xiàn)了傳統(tǒng)培養(yǎng)法未分離得到的食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、三叉乳酸桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）、乳酸乳桿菌（L.lactis）和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；葉光斌等[4]通過構(gòu)建細菌16S rRNA基因文庫、限制性片段長度多態(tài)性（restricted fragment length polymorphism，RFLP）指紋圖譜分析、測序和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析發(fā)現(xiàn)大曲中的細菌包括乳桿菌（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、假單胞菌（Pseudomonas）和高溫放線菌（Thermoactinomyces）等細菌；蘭玉倩等[5]研究發(fā)現(xiàn)，清香型白酒大曲中含有腹膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、酵母屬（Saccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）等酵母菌。WANG H Y等[6]通過PCR-DGGE技術(shù)對幾種大曲微生物群落比較分析后發(fā)現(xiàn)大曲中含有的乳酸菌極具豐富多樣性，是絕對的優(yōu)勢細菌；扣囊腹膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）是主要的酵母菌，也含有一些季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）等非釀酒類酵母。霉菌主要以米曲霉（Aspergillus oryzae）和布氏犁頭霉（Absidia blakesleeana）為常見菌。

2.2 釀造環(huán)境微生物群落

不同的生態(tài)環(huán)境，甚至不同的廠區(qū)都可能有著不同的微生物群落組成。WANG X S等[7]通過高通量測序技術(shù)比較新廠區(qū)酒醅及老廠區(qū)酒醅中微生物種群演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境酒醅初始微生物種群結(jié)構(gòu)不同，并進一步造成了酒醅中微生物演替規(guī)律及代謝的差異；同時還發(fā)現(xiàn)老廠區(qū)環(huán)境中白酒發(fā)酵功能微生物相對豐度高于新廠區(qū)。其中釀酒車間室內(nèi)地面及工具富集了豐富的白酒釀造功能微生物，細菌種群主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella），真菌種群主要包括畢赤酵母屬（Pichia）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、酵母屬（Saccharomyces）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）和曲霉屬（Aspergillus）。

2.3 地缸中不同相位微生物群落組成

固態(tài)發(fā)酵以氣相為連續(xù)相，這就使系統(tǒng)內(nèi)的物質(zhì)、熱量和動量傳遞受阻，產(chǎn)生的“空間位阻效應(yīng)”創(chuàng)造了不同的小微生態(tài)位，有效地避免了微生物之間的競爭，從而保持了白酒發(fā)酵過程中的微生物多樣性[8]。王雪山等[9]利用高通量測序技術(shù)分析不同位置酒醅中微生物種群結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律，結(jié)果表明清香型白酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌種群包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和片球菌屬（Pediococcus），優(yōu)勢酵母真菌種群包括畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、復(fù)膜孢酵母屬和哈薩克斯坦酵母（Kazachstania）。不同位置酒醅微生物種群結(jié)構(gòu)在屬水平存在明顯差異。同時，上層酒醅微生物種群演替速率慢于中、下層酒醅，最終造成上層酒醅乙醇產(chǎn)生速率低于中、下層酒醅。雷振河[10]應(yīng)用高通量測序技術(shù)以發(fā)酵第10天的地缸酒醅樣品為研究對象，發(fā)現(xiàn)地缸酒醅面層往下20 cm處的地缸中心部位酒醅和靠近地缸缸壁酒醅中的微生物組成大體相同，但原核微生物中的醋酸桿菌科、乳桿菌科和芽孢桿菌科，以及真核微生物中的假絲酵母和畢赤酵母科等5種優(yōu)勢微生物豐富度明顯不同，且雙足囊菌科（Dipodascaceae）、復(fù)膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）、小囊菌科（Microascaceae）等真菌僅存于中心酒醅中，在地缸缸壁邊緣基本不存在。

3 核心功能微生物及其作用

不同的發(fā)酵食品由不同的核心微生物組成，這些核心微生物也為發(fā)酵食品的風(fēng)味多樣性和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性提供了重要保證[11]。一般來說，清香型白酒酒醅發(fā)酵過程中的核心微生物群主要由不同種屬的乳酸菌、醋酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌和少數(shù)霉菌等組成。

3.1 乳酸菌

乳酸菌以代謝產(chǎn)物命名，是利用碳水化合物（主要指葡萄糖）發(fā)酵成乳酸的一類菌群的統(tǒng)稱，在白酒釀造過程中發(fā)揮著重要作用。除主要代謝產(chǎn)物乳酸外，乳酸菌也可產(chǎn)生其他有機酸。乳酸是一種重要的酒味調(diào)和物，既能掩蓋酒精的刺激性，還能使酒體協(xié)調(diào)柔和。另外乳酸還可以通過酯化作用與乙醇縮合生成乳酸乙酯，形成主體香氣成分之一。陳申習(xí)等[12]從清香型小曲酒機械化釀造車間發(fā)酵過程中的酒醅中分離鑒定得到了干酪乳桿菌（Lacto bacillus casei）、短乳桿菌（L.brevis）、希式乳桿菌（L.hilgardii）和瑞士乳桿菌（L.helveticus）4種乳酸菌。李銳等[14]從小曲清香型勁酒酒醅中分離到植物乳桿菌（L.plantarum）、副干酪乳桿菌（L.paracasei）、短乳桿菌（L.brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）、布氏乳桿菌（L.buchneri）和類布氏乳桿菌（L.parabuchneri）7種乳酸菌。其中植物乳桿菌（L.plantarum）、短乳桿菌（L.brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和副干酪乳桿菌（L.paracasei）4種為產(chǎn)乙酸細菌；植物乳桿菌（L.plan-tarum）和發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）為產(chǎn)乳酸細菌；植物乳桿菌（L.plantarum）、布氏乳桿菌（L.buchneri）和類布氏乳桿菌（L.parabuchneri）可產(chǎn)丁酸。

3.2 芽孢桿菌

芽孢桿菌是環(huán)境中存在非常廣泛的一類微生物，隨著對釀造中微生物的不斷探索和發(fā)酵機理的研究，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌在中國主流大曲白酒發(fā)酵中確實起著非常重要的作用。楊春霞等[13]從牛欄山地缸酒醅中篩選出5株芽孢桿菌，分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。不同的芽孢桿菌可產(chǎn)生不同風(fēng)味貢獻物質(zhì)，如地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）與含氮化合物，蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）與醛酮類物質(zhì)，短小芽孢桿菌（B.pumilus）與烴類和醇類物質(zhì)，以及枯草芽孢桿菌（B.licheniformis）與雜環(huán)類化合物。

李銳等[14]從勁酒酒醅中分離到甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）等3種芽孢桿菌，它們都能分解蛋白質(zhì)，其中甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）為好氧菌，還具有分解淀粉的作用。

3.3 酵母

王薇等[15]從清香型白酒固態(tài)釀造過程中共鑒定出10種酵母，分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、異常威克漢姆酵母（Wick erhamomyces anomalus）、扣囊腹膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、發(fā)酵畢赤酵母（P.fermentans）、阿薩希絲孢酵母（Trichosporonasahii）、耐滲透壓有孢漢遜酵母（H.osmophila）、粉狀畢赤酵母（P.farinose）、膜璞畢赤酵母（P.membranifa ciens）和葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）。其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和異常威克漢姆酵母（W.anomalus）是白酒釀造過程中最核心的3種酵母菌。

乙酸乙酯的主要合成途徑是酵母菌代謝，而乳酸乙酯的主要合成途徑是乳酸菌產(chǎn)生的乳酸在和酵母菌產(chǎn)生的醇在酯化酶催化作用下合成的。研究指出，白酒發(fā)酵中，產(chǎn)酯能力強的酵母有漢遜酵母（Hansenula polymorpha）、畢赤酵母（Pichia pastoris）、假絲酵母（Candida）、酒香酵母（Brettanomyces）、白地霉（Geotrichum candidum）等[16-17]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)扣囊腹膜孢酵母（S.fibuligera）可產(chǎn)生大量糖化酶，具有很強的糖化作用，在將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的過程中擔(dān)負著重要的作用；WU Q等[18]還研究發(fā)現(xiàn)，酵母在代謝過程中可產(chǎn)生多種萜類活性物質(zhì)。

3.4 霉菌

霉菌往往出現(xiàn)于發(fā)酵前期，隨著氧氣的消耗，霉菌含量也隨之降低。綜合來看，清香型白酒發(fā)酵過程中的霉菌主要有犁頭霉、曲霉、根霉和毛霉等[19-20]。

清香型白酒酒醅中的霉菌主要來源于大曲，在釀造過程中，霉菌的數(shù)量不再增殖，參與發(fā)酵過程的主要是霉菌的酶，其酶活性發(fā)揮的作用是降解原料大分子[21]。產(chǎn)生的糖化酶、液化酶將淀粉分解為葡萄糖，供酵母代謝利用而產(chǎn)生乙醇，再通過酯化酶促進釀酒過程中不同酯類物質(zhì)的形成。

4 功能菌在清香型白酒中的應(yīng)用

4.1 酯化和糖化功能菌的應(yīng)用

酯類物質(zhì)在白酒中起著呈香作用，近年來有不少關(guān)于高產(chǎn)酯酵母在生產(chǎn)中應(yīng)用的研究報道。楊強等[22]在將從酒曲中篩選出的Y29擴大培養(yǎng)后制成酵母麩曲，并應(yīng)用于中試車間發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯含量比對照組分別提高了99.4%，達到2.004 g/L，正丙醇含量卻下降了44.2%。曹苗文等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在清香型白酒生產(chǎn)中在大曲中添加高酯曲，大楂酒總酯提高了2.350 g/L，乙酸乙酯含量提高了1.167 g/L，乳酸乙酯含量提高了0.670 g/L。管健等[23]在使用酯化紅曲、生香酵母和釀酒酵母作強化麩曲時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中升溫速度會加快，對淀粉的利用率高，乙酸乙酯和乳酸乙酯含量也得到了提高。

扣囊腹膜孢酵母可分泌高活力的淀粉酶（α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、生淀粉糖化酶）、β-葡萄糖苷酶等水解酶類，既能水解α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵，又能水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵[24]，將其作為發(fā)酵添加液加入酒醅發(fā)酵，可明顯改善牛欄山清香型白酒的香氣，并增強醇甜味[25]。進一步研究表明，扣囊復(fù)膜孢酵母在高粱培養(yǎng)基中可以生成牛欄山二鍋頭白酒中重要的6種香氣成分[26]。潘天全等[27]在小曲清香型白酒拌曲發(fā)酵時添入0.5%的安琪根霉曲，研究結(jié)果表明根霉曲配合小曲使用明顯協(xié)同促進了糧醅的糖化作用，酸類和酯類等揮發(fā)性風(fēng)味成分種類增加，乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量提高明顯，乙酸乙酯與乳酸乙酯比由1.42提高到1.92，使得原酒風(fēng)味更為諧調(diào)，清香更為純正。

4.2 調(diào)降乳酸乙酯含量的微生物技術(shù)開發(fā)

清香純正主要是指清香型白酒的主體香味物質(zhì)乙酸乙酯與乳酸乙酯搭配諧調(diào)，具有清雅、純正、舒適、協(xié)調(diào)的復(fù)合香氣。但在清香型白酒的生產(chǎn)過程中，乙酸乙酯與乳酸乙酯比例失調(diào)也是一個普遍存在的問題。乳酸乙酯含量過高，則會影響酒的口感，導(dǎo)致酒體放香不足和香氣欠協(xié)調(diào)、后味澀苦等問題，從而降低白酒品質(zhì)。

乳酸乙酯的產(chǎn)生依賴于乳酸的合成，酒醅中能形成乳酸的微生物多樣復(fù)雜，難以調(diào)控。因此如何降低乳酸含量是調(diào)降乳酸乙酯的重要突破口，而“降乳菌”的篩選應(yīng)用是一條可行途徑，如牛欄山酒廠從清香型大曲中篩選出1株可降解乳酸的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌可有效降低白酒中乳酸乙酯的含量，乙酸乙酯與乳酸乙酯比例失調(diào)的問題得到了很好的解決[28]。

4.3 功能菌在風(fēng)味物質(zhì)代謝合成與調(diào)控方面的應(yīng)用

四甲基吡嗪是中國白酒中廣泛存在的微量成分，能賦予酒體以咖啡和堅果的獨特香氣，還能發(fā)揮抗氧化、提高免疫力和防止肝纖維素化等多種生理作用。因此，四甲基吡嗪已公認為是白酒中有益于健康的一類風(fēng)味活性功能物質(zhì)。艾金鐘等[29]將蛋白酶活性較高的芽孢桿菌菌株，應(yīng)用于紅星二鍋頭酒生產(chǎn)中后，原酒中四甲基吡嗪含量可達到0.010 g/L。

萜類化合物是自然界廣泛存在的一大類異戊二烯衍生物（isoprenoids），有著重要的生物學(xué)功能和應(yīng)用價值，生物醫(yī)學(xué)研究表明萜類具有抗癌、消炎、降糖、預(yù)防心腦血管疾病、延緩衰老等藥理功效。其實，清香型白酒中存在的芳樟醇（linalool）、α-松脂醇（α-terpineol）、橙花叔醇（nerolidol）、香葉醇（geraniol）、大馬烯酮（β-damascenone）和金合歡醇（farnesol）也是一類重要的風(fēng)味物質(zhì)[30]，WU Q等[18]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母、東方伊薩酵母和異常漢遜酵母不但能生物轉(zhuǎn)化利用高粱等谷物中含有的萜類前體物，還能從頭合成芳樟醇等萜類物質(zhì)，賦予清香白酒獨特的風(fēng)味。

5 結(jié)語

微生物無疑是支撐酒體質(zhì)量的基礎(chǔ)與核心，研究微生物群落組成、來源與其消長規(guī)律以及風(fēng)味物質(zhì)的代謝調(diào)控機制，以及主要功能菌間的互作關(guān)系，對于提升白酒產(chǎn)品競爭力至關(guān)重要。目前國內(nèi)外白酒微生物研究者借助先進的高通量測序技術(shù)，可對傳統(tǒng)白酒釀造過程及大曲、環(huán)境中微生物的可培養(yǎng)微生物和未培養(yǎng)微生物同時進行分析解讀，還可借助氣質(zhì)聯(lián)用等分析儀器對風(fēng)味物質(zhì)進行可視化的痕量分析，這為白酒微生物的研究提供了技術(shù)支撐，也為揭示釀酒過程中所發(fā)生的各種內(nèi)在反應(yīng)本質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

白酒釀造環(huán)境與工藝都較為特殊，系統(tǒng)相對開放，但又存在自身的微生態(tài)系統(tǒng)，多種微生物共同發(fā)酵，制曲過程和釀造過程中均發(fā)生著復(fù)雜的生理生化反應(yīng)。迄今為止，行業(yè)內(nèi)對復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)存在的微生物種類多樣性和代謝多樣性以及微生物各類群之間的相互作用關(guān)系還缺乏清晰的認識。核心功能微生物資源的挖掘以及代謝機制的解析，對于解決不同原料和季節(jié)差異而導(dǎo)致的酒體非均一性以及低出酒率必將發(fā)揮出重要作用。