不同復性方法純化的重組大腸桿菌外膜蛋白A 小鼠免疫原性研究

肖雪 ，楊思宇 ，翟璐 ，夏洪偉 ，高玉龍 ，吳金 ，張中洋 ，朱戰(zhàn)波 ，崔玉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學，大慶163319；2.和元生物工程股份有限公司）

奶牛乳房炎是目前影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，不僅引起奶牛產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)降低，還導致奶牛產(chǎn)后發(fā)情周期延長，甚至失去繁殖性能，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。據(jù)報道，引起奶牛乳房炎的病原微生物多達150 種[2]，但以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌感染最為常見，這三類細菌引起的奶牛乳房炎可占90%以上[3]，而在這三類病原菌中，腸桿菌科細菌引起的奶牛乳房炎占比高達33.6%。在臨床分離的腸桿菌中，埃希氏大腸桿菌（E.coli）占76.1%，且引起的乳房炎難以治療[4]。以往奶牛乳房炎的治療以抗生素為主，且隨著抗生素的長期和超量使用，臨床上出現(xiàn)大量耐藥菌株，致使抗生素治療效果不佳[5]。因此，研究使用疫苗免疫預防奶牛乳房炎受到人們越來越多的關(guān)注[6]。目前，研究報道較多的是使用 E.coli（O111：B4）J5 株全菌苗免疫接種奶牛，該疫苗株是不完全O-側(cè)鏈多糖突變菌株，其脂多糖的核心區(qū)和脂質(zhì)A 區(qū)是暴露的，暴露區(qū)抗原刺激產(chǎn)生的抗體可以與革蘭氏陰性腸桿菌核心抗原結(jié)合而發(fā)揮抗感染作用，并且能交叉抵抗不同血清型的E.coli 感染[7-8]。但E.coli（O111：B4）J5 疫苗的使用并不能阻止乳房內(nèi)感染，只能減少臨床奶牛乳房炎新病例的發(fā)生[8]。

近年來，隨著亞單位疫苗的廣泛研究和臨床應用，國內(nèi)外紛紛開展了E.coli 抗原亞單位疫苗研究。佟春玉等[9]將原核表達純化的重組OmpT 蛋白（rOmpT）免疫小鼠，結(jié)果免疫小鼠對4 個進化種系（Phylogenetic group）不同的E.coli 攻毒的免疫保護率均為50%～60%，證明rOmpT 對各進化種系E.coli 均具有良好的免疫預防作用。俱雄等[10]將表達純化的OmpC蛋白免疫小鼠，并用大腸桿菌進行攻毒，免疫保護率達到63.64%。呼銳等[11]原核表達了E.coli 的OmpA，通過小鼠模型實驗證明rOmpA 能誘導產(chǎn)生特異性的IgG 抗體和淋巴細胞因子，分別用E.coli C8391 株、E.coli O157 株、E.coli J96、E.coli 2002-1 株以及福氏志賀氏菌、克雷伯氏菌對rOmpA 免疫小鼠攻毒，在對照組全部死亡時，各攻毒組免疫保護率分別為60%、60%、60%、40%、50%、30%，表明 rOmpA 不僅對E.coli 攻擊具有良好免疫保護作用，且對志賀氏菌、克雷伯氏菌攻擊也具有一定的交叉免疫保護作用。RAINARD 等[12]研究顯示，用rOmpA 免疫能誘導奶?？贵w滴度增加，表明rOmpA 是誘導奶牛產(chǎn)生抗體的良好免疫原。由以上研究結(jié)果看出，rOmpA 不僅可用于預防E.coli 感染、也可用于預防腸桿菌科其他細菌感染，是具有良好開發(fā)應用潛力、預防腸桿菌感染的候選疫苗抗原。但誘導表達后的rOmpA 主要以不可溶的包涵體形式存在，且rOmpA 包涵體復性方法研究鮮有報道，為其應用帶來一定困難。為此，實驗室前期對rOmpA 包涵體蛋白進行了復性研究，篩選出兩種較優(yōu)復性方法，即使用β-環(huán)糊精、吐溫-20 對包涵體形式的rOmpA 進行復性，然后純化，獲得了可溶性rOmpA。但不同方法復性后純化的rOmpA 免疫原性如何及復性后純化的rOmpA 與包涵體形式的rOmpA 在免疫原性上是否存在差異尚缺乏實驗研究。為此，實驗分別以β-環(huán)糊精復性rOmpA（βrOmpA）、吐溫-20 復性 rOmpA（T-rOmpA）和包涵體rOmpA（I-rOmpA）作為抗原，比較研究了它們的免疫原性和免疫保護作用，為rOmpA 的進一步開發(fā)應用提供前期工作基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和實驗動物

重組菌株OmpA-pET32a/ BL21（DE3）由實驗室構(gòu)建并保存，分離于奶牛乳房炎病牛乳汁的E.coli 2002-1 菌株由實驗室保存。

6～8 周齡 SPF 級雌性BALB/c 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑：PageRulerTM Prestained Protein Ladder 購自Thermo Scientific 公司；瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物購自OXOID 公司；弗氏佐劑、牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma-Aldrich Inc.公司；山羊抗小鼠IgG/辣椒根酶標記購自天根生化科技（北京）有限公司；Tris-HCl、Tris、NaCl、尿素、EDTA、TritonX-100 購自納川生物技術(shù)有限公司；His-binding-resin 蛋白純化柱購自上海點創(chuàng)生物科技有限公司；RPMI1640 購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)CS）購自 ExCell Bio 公司；干擾素-γ（INF-γ）、白介素-17A（IL-17A）、白介素-4（IL-4）、等細胞因子檢測試劑盒、紅細胞裂解液及200 目尼龍網(wǎng)購自深圳達科為生物工程有限公司。

主要儀器：電泳儀DYY-8B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，TECAN Infinite M200PRO 多功能酶標儀，Gel Doc 2000 紫外凝膠成像儀系統(tǒng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 rOmpA 免疫原制備

1.3.1.1 重組菌株 OmpA-pET32a/ BL21（DE3）的誘導表達

將實驗室保存的重組菌株OmpA-pET32a/BL21（DE3）劃線接種于LB-Amp+固體培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h 后，挑取單菌落接種3 mLLB-Amp+液體培養(yǎng)基中 37 ℃，180 rpm 培養(yǎng) 12 h，再以 1∶100 的比例轉(zhuǎn)接于LB-Amp+液體培養(yǎng)基中，以180 rpm 于37 ℃條件下培養(yǎng)至菌液OD600值達到0.6～0.8 之間時，加入終濃度為0.1 mmol·L-1的IPTG 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，同時設置空載體菌株pET32a/BL21（DE3）作為對照。培養(yǎng)結(jié)束后，分別吸取1 mL 菌液，8 000 rpm 離心10 min，棄盡上清，加入無菌 dd 水 40 μL 重懸菌體沉淀，再加入5×上樣緩沖液（含巰基乙醇）10 μL 震蕩混勻，密封樣品于沸水中煮沸10 min，待處理樣品冷卻至室溫后取5 μL 樣品進行12%SDS-PAGE 電泳鑒定。

1.3.1.2 表達的rOmpA 復性及純化

將活化的OmpA-pET32a/BL21（DE3）重組菌以1∶100 的比例接種于 LB-Amp+液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃條件下以180 rpm 震蕩培養(yǎng)至菌液OD600值達到0.6～0.8 之間，加入終濃度為 0.1 mmol·L-1的 IPTG 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，然后4 ℃ 8 000 rpm 離心10 min 收集菌體，用緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl pH8.0，100 mmol·L-1NaCl）洗滌菌體兩次，然后以溶液（50 mmol·L-1Tris-HCl pH8.0，100 mmol·L-1NaCl，1%Triton X-100）重懸菌體（菌液與溶液比例約為200 mL∶20 mL），冰浴超聲破碎菌體（功率：150 W，破碎/間隔時間為：5 s/5 s）10 min 后，離心收集沉淀，分別用洗滌液Ⅰ（50 mmo·lL-1Tris-HCl pH8.0，100 mmol·L-1NaCl，0.5% Triton X-100，2 mol·L-1尿素）、洗滌液Ⅱ（100 mmol·L-1Tris-HCl pH8.0，300 mmol·L-1NaCl，3%Triton X-100）各洗滌一次，每次2～8 ℃冷藏柜搖床上振搖30 min，收集含有大量rOmpA 的離心沉淀物。以含8 mol·L-1尿素的溶液溶解包涵體蛋白，并分別用含β-環(huán)糊精和吐溫-20 復性溶液做復性處理，然后用His-bindingresin 柱純化復性蛋白，利用紫外分光光度計測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至1 mg·mL-1備用。

包涵體rOmpA 純化即以含8 mol·L-1尿素的溶液溶解包涵體蛋白后，用His-binding-resin 柱純化蛋白，純化后蛋白溶液用PBS 溶液透析24 h，濃縮透析溶液，留取包涵體固體沉淀，PBS 溶液吹懸包涵體固體使其均勻分布在PBS 溶液中。分別取上述復性純化和包涵體rOmpA 懸液，進行SDS-PAGE 電泳，檢測蛋白純度和確定含量。

1.3.1.3 rOmpA 蛋白亞單位疫苗的制備

分別取β-環(huán)糊精復性rOmpA、吐溫-20 復性rOmpA 和包涵體 rOmpA，用無菌 PBS 稀釋至 1 mg·mL-1，用弗氏佐劑以1∶1 比例與蛋白溶液充分混合，用齒科銀汞調(diào)和器（Amalgamator）30 s·次-1，乳化數(shù)次，直至乳化蛋白滴至水中不迅速散開為止，將乳化完蛋白吸入無菌注射器中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實驗動物分組及免疫接種

取6～8 周齡SPF 級雌性BALB/c 小鼠隨機分成4 組，每組 20 只，分別標記為 PBS 組、β-環(huán)糊精復性rOmpA 免疫組（β-rOmpA）、吐溫-20 復性 rOmpA 免疫組（T-rOmpA）、包涵體 rOmpA 免疫組（I-rOmpA）。飼養(yǎng)一周后，每只小鼠以50 μg 抗原劑量與等量弗氏完全佐劑乳化后于腿部肌肉免疫接種。初次免疫接種后21 d，每只小鼠以同樣抗原劑量與等量弗氏不完全佐劑乳化后進行加強免疫。

1.3.3 間接ELISA 測定抗體水平

在加強免疫接種后第14 d，每組隨機取出4 只小鼠進行眼球采血，收集血清。E.coli 2002-1 全菌80 ℃水浴熱滅活30 min 備用，酶標板中每孔分別包被包涵體rOmpA 純化得到的可溶性rOmpA 蛋白0.2 μg，熱滅活的 E.coli 2002-1 全菌 1×106CFU，4 ℃包被過夜，次日棄去包被液，每孔加入200 μL PBST重復洗滌3 次；然后每孔加入5%脫脂100 μL，于37 ℃孵育1 h，棄去孔內(nèi)液體，PBST 洗滌3 次后，每孔加入 1∶1 600 倍稀釋的小鼠血清 100 μL，37 ℃孵育 1 h，再 PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μL 以 1∶5 000 倍稀釋的 Goat anti-mouse HRP-IgG 二抗，37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μL TMB 顯色液，避光放置15 min 后，每孔加入50 μL 的終止液（2 mol·L-1硫酸）終止反應，在終止反應 10 min 內(nèi)，用酶標儀測定波長450 nm 處各孔吸光度值。

1.3.4 脾淋巴細胞分離與細胞因子檢測

在加強免疫接種后7 d，每組隨機取4 只小鼠，無菌取出小鼠脾臟，在含有3 mL 的RPMI-1640 細胞培養(yǎng)液的35 mm 細胞培養(yǎng)皿上覆蓋一張200 目尼龍網(wǎng)，將脾臟放置于尼龍網(wǎng)上，使用無菌注射器的活塞輕輕碾壓小鼠脾臟使細胞穿過尼龍網(wǎng)懸于RPMI-1640 培養(yǎng)液中，制備細胞懸液；將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，1 000 rpm 室溫離心 5 min 后，棄去上層清液；加入1 mL 紅細胞裂解液使紅細胞裂解，37 ℃處理 2 min 后加入 9 mL 的 RPMI-1640 培養(yǎng)液終止反應；1 000 rpm 室溫離心3 min，棄去上清；使用RPMI-1640 培養(yǎng)液清洗細胞3 次，末次清洗結(jié)束后，1 000 rpm 室溫離心3 min 后，棄去上清，加入適量完全RPMI-1640 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，100 U青霉素·mL-1，100 U 鏈霉素·mL-1）重懸細胞，并調(diào)節(jié)細胞濃度至1×106cells·mL-1，將稀釋好細胞鋪于12孔細胞培養(yǎng)板中（1 mL·孔-1），每孔分別加入包涵體rOmpA 純化得到的可溶性rOmpA 蛋白30 μg，熱滅活的E.coli 2002-1 全菌體1×107CFU，置于細胞培養(yǎng)箱中（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng) 72 h；將淋巴細胞懸液轉(zhuǎn)移至2 mL EP 管中，2 200 rpm 離心20 min，收集上清，按照達科為產(chǎn)品Mouse IFN-γ、IL-4 和IL-17A Precoated ELISA Kit 操作方法進行檢測。

1.3.5 免疫接種小鼠攻毒

將菌株E.coli 2002-1 劃線接種于LB 固體培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h 后，挑取單菌落接種于3 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 rpm 震蕩培養(yǎng) 12 h，再以1∶100 的比例轉(zhuǎn)接于200 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 rpm 震蕩培養(yǎng) 5 h 后，8 000 rpm 離心10 min 收集菌體，以適量無菌PBS 重復洗滌菌體3 次，倍比稀釋后涂板計數(shù)；在加強免疫接種后14 d，每組取3 只分別以3.6×108CFU·只-1劑量進行腹腔攻毒，攻毒后48 h 處死小鼠，分別取肝、脾、肺、腎4個器官研磨于 2 mL PBS 中，混勻后按 1∶10、1∶100 比例稀釋，將研磨器官原液及各梯度稀釋液分別取20 μL涂布于LB 固體培養(yǎng)板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。通過平板菌落數(shù)量計算肝、脾、肺、腎細菌定植數(shù)；每組取10 只分別以5×108CFU·只-1劑量進行腹腔攻毒，攻毒后7 d 內(nèi)，每天觀察并記錄小鼠的生存情況。

1.3.6 統(tǒng)計學分析

所有的數(shù)據(jù)進行生物統(tǒng)計學分析，采用SPSS 軟件進單因素方差分析，組間差異采用t 檢驗，其中*表示P＜0.05，** 表示 P＜0.01，***P＜0.001，有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白OmpA 的表達與純化

重組菌株 OmpA-pET32a/BL21（DE3）經(jīng) IPTG 誘導4 h 后進行SDS-PAGE 分析。結(jié)果，經(jīng)IPTG 誘導菌在56 KD 處可見明顯條帶，其分子量大小與預期相符。經(jīng)β-環(huán)糊精復性純化蛋白、吐溫-20 復性純化蛋白和表達后直接純化的包涵體蛋白進行SDSPAGE 分析，結(jié)果在分子量56 KD 處呈現(xiàn)單一條帶。SDS-PAGE 圖中可知，經(jīng)β-環(huán)糊精復性純化蛋白及直接純化的包涵體蛋白純度較高，SDS-PAGE 圖中無雜蛋白條帶，而經(jīng)吐溫-20 復性純化蛋白SDSPage 中可見一條清晰雜帶。純度結(jié)果詳見圖1。

圖1 SDS-PAGE 鑒定蛋白表達及純化結(jié)果Fig.1 Expression and purification of recombinant OmpA.Lane M.PageRulerTM Prestained Protein Ladder

2.2 免疫小鼠血清特異性抗體檢測結(jié)果

采用間接ELISA 方法測定各組在加強免疫后14 d小鼠血清中的抗體水平。結(jié)果顯示，rOmpA 和E.coli 2002-1 全菌作抗原進行檢測，β-rOmpA、T-rOmpA 和I-rOmpA 免疫組均能誘導機體產(chǎn)生體液免疫應答，三組抗體水平極顯著高于PBS 對照組（P＜0.001），且β-rOmpA 免疫組抗體水平顯著高于T-rOmpA 免疫組（P＜0.05）、極顯著高于 I-rOmpA 免疫組（P＜0.001）。結(jié)果詳見圖 2。

圖2 免疫小鼠血清中的特異性抗體水平Fig.2 Levels of specific antibody in the immunized mice sera

2.3 免疫小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子檢測結(jié)果

取各組免疫接種小鼠脾臟脾淋巴細胞，體外經(jīng)rOmpA 和E.coli 2002-1 全菌體刺激后用間接ELISA方法檢測脾淋巴細胞分泌的特異性細胞因子IFN-γ、IL-17A 和IL-4。結(jié)果，各抗原免疫組小鼠脾細胞均能產(chǎn)生較高水平的IFN-γ，顯著高于對照組（P＜0.05），但產(chǎn)生 IL-4 水平均較低；rOmpA 刺激試驗中 β-rOmpA 免疫組產(chǎn)生 IFN-γ、IL-17A 水平顯著高于 T-rOmpA 免疫組（P＜0.05），極顯著高于 I-rOmpA免疫組（P＜0.01）。結(jié)果詳見圖 3A；E.coli 2002-1 全菌體刺激試驗中I-rOmpA 免疫組產(chǎn)生IFN-γ 水平顯著高于 β-rOmpA 和 T-rOmpA 免疫組，β-rOmpA和T-rOmpA 免疫組產(chǎn)生IFN-γ 水平無顯著差異（P＞0.05），三組產(chǎn)生 IL-17A 水平無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果詳見圖3B。

圖3 刺激后淋巴細胞上清中細胞因子水平Fig.3 Cytokine level in supernatant of lymphocyte culture after stimulating

2.4 免疫接種小鼠對E.coli 2002-1 菌株攻擊的免疫保護作用

為比較各種抗原免疫接種后誘導的免疫保護作用，用E.coli 2002-1 菌株分別以3.6×108CFU·只-1和5.0 ×108CFU·只-1劑量對各組小鼠進行腹腔攻毒，然后測定小鼠肝、脾、肺、腎細菌定植數(shù)和小鼠免疫保護率。結(jié)果顯示，以3.6 ×108CFU·只-1劑量攻毒后，小鼠肝、脾、肺和腎均有細菌定植，各抗原免疫組器官細菌定植數(shù)目均低于PBS 對照組，其中β-rOmpA免疫組肝、脾、肺、腎細菌定植量極顯著低于T-rOmpA 免疫組和 I-rOmpA 免疫組（P＜0.001），結(jié)果詳見圖4A。

對各免疫組小鼠以5.0 ×108CFU·只-1劑量攻毒后，觀察記錄小鼠死亡情況。結(jié)果，在攻毒后2 d，PBS對照組小鼠全部死亡，而此時β-rOmpA 免疫組小鼠存活率為60%，T-rOmpA 免疫組小鼠存活率為40%，I-rOmpA 免疫組小鼠存活率率為30%；而攻毒后3 d至 7 d，β-rOmpA 免疫組小鼠存活率為 40%，T-rOmpA 免疫組小鼠存活率為0，而I-rOmpA 免疫組小鼠存活率仍為30%。免疫保護作用結(jié)果表明，β-環(huán)糊精復性純化的蛋白免疫原性優(yōu)于吐溫-20 復性純化的蛋白和直接純化的包涵體蛋白，誘導機體產(chǎn)生免疫應答和免疫保護作用最強。結(jié)果詳見圖4B。

圖4 免疫小鼠對E.coli 2002-1 菌株攻擊的免疫保護作用結(jié)果Fig.4 Immunoprotection of the immunized-mice against challenge with E.coli 2002-1 strain.

3 討論

基因重組蛋白特別是重組膜蛋白在原核細胞中誘導表達，往往形成高密度、無活性、不可溶的包涵體形式蛋白。這種表達方式的優(yōu)點[13]是表達量高，方便后續(xù)對其進行分離純化；缺點是包涵體形式蛋白必須先變性再復性，才能恢復其生物活性。1961 年，Anfinsen[14]發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)含有其折疊成熟所需的全部信息，無活性的包涵體形式蛋白質(zhì)在一定的條件下可以完全自發(fā)地恢復活性。后來實驗研究表明[15-16]，伸展的肽鏈折疊成活性蛋白質(zhì)并不是一步完成的，它先經(jīng)過折疊進入中間態(tài)，然后由中間態(tài)過渡到最終具有特定三維結(jié)構(gòu)和生物活性的自然狀態(tài)。從中間態(tài)到天然構(gòu)象折疊是復性的限速步驟。由于蛋白在折疊過程中會產(chǎn)生一些錯誤折疊的中間體，而且缺乏協(xié)助折疊的輔助蛋白，同時受到聚集反應的競爭，體外折疊形成蛋白質(zhì)天然構(gòu)象所需時間很長，從十幾小時到幾十小時不等。并非所有蛋白質(zhì)在一定的條件下均可自發(fā)恢復具有完全活性的天然構(gòu)象，包涵體復性成有活性的蛋白的過程非常復雜，且不同蛋白需要不同的復性方法。田亮等[17]研究牦牛源多殺性巴氏桿菌重組外膜蛋白H（rOmpH）亞單位疫苗對免疫接種小鼠誘導的免疫保護效果，結(jié)果rOmpH 包涵體蛋白經(jīng)體外變性、復性及純化后，不能產(chǎn)生良好的免疫原性?？梢?，即便是包涵體形式重組蛋白得到了復性，其免疫原性也受到了很大的影響，對復性的抗原蛋白的免疫原性仍需要實驗證明。因此，實驗前期對表達的主要以包涵體形式存在的rOmpA 以不同方法復性純化后，進一步研究了它們的免疫原性，為后續(xù)將rOmpA 作為免疫原開發(fā)應用做前期準備。

研究分別將β-環(huán)糊精和吐溫-20 復性純化后的rOmpA 和包涵體形式的rOmpA 制備免疫原后免疫接種小鼠，然后檢測和比較各組的血清抗體水平、脾淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子水平以及細菌攻擊后的肝、脾、肺、腎細菌定殖量、免疫小鼠存活數(shù)。結(jié)果顯示，β-rOmpA 誘導的免疫應答和免疫保護作用明顯好于T-rOmpA 和 I-rOmpA，且 β-rOmpA 免疫組小鼠所獲得免疫保護率也最好，與乎銳等[11]研究的可溶性rOmpA 的免疫保護率結(jié)果一致。表明，利用β-環(huán)糊精復性后純化的rOmpA 具有良好的免疫原性，可用于后續(xù)疫苗開發(fā)。

在檢測血清抗體水平時，考慮到臨床上E.coli 感染的實際情況，我們嘗試了用滅活的E.coli 全菌體作為抗原對小鼠血清中抗體進行檢測，所檢測的血清抗體水平雖然明顯低于rOmpA 作抗原的檢測水平，但兩種抗原各組之間抗體水平的變化趨勢一致，說明rOmpA 和E.coli 全菌體均可作為抗原對免疫小鼠血清抗體進行檢測。在體外脾淋巴細胞分泌細胞因子檢測時，我們也嘗試了用滅活的E.coli 全菌體作抗原進行刺激，各組均產(chǎn)生了比較高水平的IFN-γ 和一定水平的IL-17A，而IL-4 水平非常低。但與rOmpA 作為抗原相比，各組之間IFN-γ 的水平差異比較大，且不具有其他結(jié)果那樣規(guī)律性。可能是由于全菌體抗原成分復雜，包括各種菌體表面蛋白、LPS、莢膜等成分，而且實驗使用的是脾細胞，而非單一的淋巴細胞成分，這些因素可能都會影響到細胞因子表達譜及表達水平，致使這一結(jié)果不具有特異性[18-20]。各組產(chǎn)生IL-17A、IL-4 水平較低，說明在抗感染過程中，發(fā)揮較大作用的是Th1 細胞，而Th17 細胞和Th2 細胞發(fā)揮抗感染作用較弱。對免疫小鼠以E.coli 2002-1 菌株腹腔攻毒后，測定小鼠肝、脾、肺、腎細菌定植數(shù)和小鼠的存活率，β-rOmpA 免疫組小鼠肝、脾、肺、腎細菌定植量極顯著低于T-rOmpA 和I-rOmpA 免疫組，而小鼠存活率也是β-rOmpA 免疫組最高，說明用β-環(huán)糊精方法復性純化的rOmpA 誘導小鼠產(chǎn)生的抗E.coli 感染免疫保護作用最好。但實驗是以小鼠作為動物實驗模型開展的研究，可能與奶牛體內(nèi)實驗結(jié)果不一定完全一致，特別是對E.coli 和其它腸桿菌奶牛乳腺感染的免疫預防作用尚需進一步研究。