輪狀病毒SA11 株NSP2 蛋白的原核表達及其多克隆抗體的制備

陳肖宏，聞曉波，冉旭華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

輪狀病毒（Rotavirus，RV）是一種引起嬰幼兒及多種幼齡動物腸道感染的病原，致死率高，給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展造成巨大危害[1]。RV 屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬成員，電鏡觀察下為一個無包膜的二十面體“車輪狀”顆粒，基因組由11 個分節(jié)段的雙鏈RNA（dsRNA）組成，共編碼6 個結構蛋白（VP1～VP4，VP6 和 VP7）、5 或 6 個非結構蛋白（NSP1～NSP5 和/或 NSP6）[2]。具有感染性的完整 RV粒子為三層衣殼結構（triple-layered particle，TLP），最內(nèi)層衣殼由VP2 蛋白及少量VP1 和VP3 構成，中間層由VP6 構成，最內(nèi)層和中間層構成具有轉錄活性的雙層衣殼結構（double-layered particle，DLP），DLP 外包裹纖突蛋白VP4 和糖蛋白VP7 構成了完整的具有感染性的RV 粒子。依據(jù)血清學分類方法，目前所鑒定出的RV 毒株可分為RVA～RVJ 至少10個群[3]，其中A 群是引起嬰幼兒和幼齡動物發(fā)生嚴重腹瀉和脫水的主要病原。血清型由外衣殼蛋白VP7和 VP4 決定，RV 根據(jù)其 VP7 和 VP4 的抗原性分為G 血清型（glycoprotein）和 P 血清型（protease-sensitive）[4]。迄今為止，已鑒定出 32 種 G 型和 47 種 P 型可感染人類和動物[5]。

RV 經(jīng)胞吞作用入侵細胞，在感染期間，病毒基因組復制和初生DLP 組裝均發(fā)生在細胞質內(nèi)的病毒質樣結構（viroplasm-like structure，VLS）中。有研究表明，在缺乏所有其他病毒蛋白的細胞中，NSP2 與NSP5 的共表達可形成 VLS[6]，但 NSP2 或 NSP5 的單獨表達都不足以形成VLS，因此，NSP2 和NSP5 被認為是VLS 形成的最小組合。NSP2 蛋白在VLS 形成中起關鍵作用，在RV 感染的細胞中，使用RNAi 干擾技術或胞內(nèi)抗體沉默NSP2 或NSP5 的表達可抑制VLS 形成[7-9]。現(xiàn)已證明NSP2 和NSP5 的相互作用對VLS 成核和病毒復制都是至關重要的[10]，但關于這兩種蛋白如何啟動病毒質組裝以及NSP2 在病毒質形成中的具體作用，目前尚不清楚。NSP2 蛋白由RV 基因組中第 8 基因片段編碼，A 群 NSP2 蛋白全長1 059 bp，共編碼317 個氨基酸，是一個相對分子量約為35 kDa 的堿性蛋白。從RV 感染細胞中分離出的具有復制活性的復制中間體，在非許可溫度下利用 SA11 tsE（1400）突變體沉默 NSP2，雙鏈 RNA 合成幾乎完全缺失[11]。X 射線晶體分析表明，NSP2 蛋白常以八聚體形式存在，其總體結構是高度保守的[12]。NSP2 蛋白具有多種酶活性，在基因組復制過程中起關鍵作用。NSP2 蛋白可與單鏈RNA（ssRNA）非特異性結合且具有ATP 解螺旋活性[13]，NSP2 蛋白還具有Mg2+依賴的核苷三磷酸酶（NTPase）活性和核苷二磷酸（NDP）激酶活性[14]。除了它的酶功能外，NSP2 還可與多種蛋白相互作用，例如NSP5、VP1 和微管蛋白[15]。

NSP2 蛋白在輪狀病毒RNA 的復制、基因組的包裝及雙層衣殼結構裝配的初始階段發(fā)揮重要作用[16]，近年來，對于NSP2 蛋白的研究主要集中于蛋白表達、結構與功能及其免疫學等方面的研究[17]，但其在VLS 形成中的具體作用及其關鍵結構域對病毒質形成的影響目前尚不清楚。利用Kanai 等[18]開發(fā)的14質粒的RV 反向遺傳操作系統(tǒng)，通過替換或缺失NSP2 蛋白關鍵位點或關鍵結構域，來研究其對病毒質形成的影響，抑制RV 復制，可為RV 致弱提供突變位點，為弱毒疫苗研發(fā)提供新方法。研究通過原核表達系統(tǒng)表達NSP2 蛋白，經(jīng)免疫豚鼠制備NSP2 多克隆抗體，為進一步研究NSP2 蛋白結構和功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

E.coli BL21（DE3）、E.coli DH5α 和 pET-28a（+）載體均由實驗室保存。pT7-NSP2 質粒購自Addgene公司。

1.1.2 實驗動物

兩只8 周齡清潔級體重約200 g 的雌性豚鼠購于哈爾濱動物實驗基地，飼養(yǎng)于黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院動物房。

1.1.3 主要試劑

質粒小提、膠回收試劑盒購自OMEGA 公司；限制性內(nèi)切酶BamH I、HindIII、連接試劑盒購自Takara公司；Go Taq Green?Master Mix、預染彩虹蛋白Marker 購自Promega 公司；小鼠抗His Taq 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG 購自北京博奧森有限公司；DNA 分子量標準購自天根生物科技有限公司；3，3-二氨基苯胺四氫鹽酸（DAB）底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Micro BCATMProtein Assay Kit 購自 Thermo 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗豚鼠IgG 購自KPL 公司；TMB 顯色液購自北京Solarbio 公司。

1.2 方法

1.2.1 pET-28a-NSP2 重組質粒的構建

參照NCBI GenBank 收錄的輪狀病毒SA11 株NSP2（GenBank 登錄號：LC178571.1）基因組序列及pET-28a（+）載體圖譜，設計特異性引物擴增SA11 株NSP2 編碼區(qū)全序列，分別在上下游5′端添加BamH I和Hind III 酶切位點（下劃線表示）。引物序列如下：SA11-NSP2-F：5′-CGCGGATCCATGGCTGAGCTAGCTTGCTTTTG-3′；SA11-NSP2-R：5′-CCCAAGCTTAAACGCCAACTTGAGAAACTTCGTC-3′，擴增片段大小為954 bp，引物委托北京華大基因公司合成。

以pT7-NSP2 質粒為模板，利用SA11-NSP2-F和SA11-NSP2-R 進行擴增，擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，共 35 個循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min；對 PCR 產(chǎn)物電泳后進行切膠回收。將回收的目的基因和原核表達載體 pET-28a（+）分別用 BamH I 和 Hind III 進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳切膠回收后以T4 DNA Ligase 進行連接，連接產(chǎn)物轉化至E.coli DH5α 感受態(tài)細胞中，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性單克隆，搖菌提質粒后經(jīng)PCR、雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒送至北京華大科技有限公司測序，將測序正確的重組質粒命名為pET-28a-NSP2。

1.2.2 目的基因的誘導表達

將 pET-28a-NSP2 轉化至 E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆接種至3 mL 含終濃度為 50 μg·mL-1卡那抗性的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)，待菌液渾濁后以1∶100 的比例將菌液轉接至終濃度為50 μg·mL-1卡那抗性LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 rpm 培養(yǎng)至 OD600≈0.6。取出1 mL 菌液作為未添加誘導劑的對照，剩余部分加入終濃度為1 mM 的IPTG 誘導劑。將添加和未添加誘導劑的菌液，37 ℃，200 rpm 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取誘導培養(yǎng)物1 mL 離心棄上清，用PBS 洗滌菌體3 次后重懸于500 μL 的PBS 中，置于冰水浴中，超聲破碎至液體清亮；4 ℃，12 000×g 離心 20 min，分別收集上清液和沉淀。加入5×Loading buffer，煮沸10 min，進行SDS-PAGE 分析檢驗。同時，將未加入誘導劑的空載體pET-28a（+）轉化后的表達產(chǎn)物作為對照。

1.2.3 重組蛋白的Western blot 鑒定

取適量誘導樣品及未誘導的空載體對照組樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離后，從膠板上取下膠，切除多余部分，泡入轉膜液中。同時剪下大小適中的一張PVDF膜和2 張厚濾紙，將PVDF 膜泡入預冷的甲醇中1 min 后與厚濾紙一同泡入轉膜液中。按照濾紙、PVDF 膜、膠和濾紙的順序依次放置于電轉槽中央。半干法將蛋白轉移至PVDF 膜上，轉膜結束后將膜置于PBST 中漂洗3 次，然后浸潤于5%脫脂乳中，4 ℃封閉過夜，洗膜后與1∶10 000 倍稀釋的小鼠抗His Tag 抗體于37 ℃孵育1 h，再次洗膜后與1∶5 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 抗體室溫孵育2 h，再次洗膜，將配置好的DAB 顯色液混合均勻后滴加在膜上，等待幾分鐘后，目的條帶呈黃褐色，棄掉顯色液，用去離子水終止反應。

1.2.4 重組蛋白的純化及定量

誘導條件同上，離心收集誘導后菌體，重懸于PBS 中，置于冰水浴中超聲破碎至菌液清亮，離心后收集沉淀，用4M 尿素重懸沉淀，冰浴20 min，離心后收集上清，4M 尿素重復洗脫蛋白3 次。將收集到的蛋白樣品裝入透析袋中過夜透析，以去除蛋白樣品中的尿素，使蛋白復性。將復性后的蛋白稀釋后用BCA 試劑盒對蛋白進行定量，通過繪制標準曲線確定蛋白的濃度。

1.2.5 抗體制備

用PBS 將復性后的蛋白樣品稀釋至400 μg·mL-1，分別取2 mL 稀釋后的蛋白和2 mL ISA206 佐劑，將蛋白樣品和佐劑放置于31 ℃水浴鍋中溫浴10 min。將裝有佐劑的小瓶放置于磁力攪拌器上以適當轉速攪拌，攪拌的同時快速加入蛋白樣品，繼續(xù)攪拌乳化10 min，乳化液保存于 4 ℃。取 1 mL 含有 200 μg 重組蛋白的乳化液注射于豚鼠后肢肌肉，2 周后以同樣劑量加強免疫2 次，間隔2 周。在免疫前和免疫后2 周采血，4 ℃放置 2 h，5 000×g 離心 5 min 收集血清，通過間接ELISA 方法測定抗體效價，達到預期效價后，通過心臟采血收集血清，-20 ℃保存。

1.2.6 抗體效價的檢測

采用間接ELISA 法，用碳酸鹽緩沖液將重組NSP2 蛋白稀釋至 5 μg·mL-1后包被 96 孔板，100 μL·孔-1，4 ℃包被過夜。取出包被好的酶標板，PBST 洗滌3 次，甩干孔內(nèi)液體，加入5%脫脂乳，300 μL·孔-1，37 ℃封閉 2 h。PBST 洗滌 3 次，將多克隆抗體倍比稀釋后加入孔中，每個梯度做2 個重復，同時設置陰性對照和空白對照，100 μL·孔-1，37 ℃孵育 1 h。PBST 洗滌 3 次，加入 1∶5 000 倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗豚鼠IgG，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h。PBST 洗滌3 次，加入TMB 顯色液，50 μL·孔-1，37 ℃避光孵育 15 min。加入 2M H2SO4終止顯色，50 μL·孔-1，在酶標儀上讀取 OD450nm的數(shù)值，計算P/N 的值，P/N≥2.1 即為陽性閾值。

2 結果

2.1 pET-28a-NSP2 重組質粒的鑒定

重組質粒 pET-28a-NSP2 經(jīng) PCR 和 BamH I 與Hind III 雙酶切后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳可見954 bp 的目的條帶及約5.3 kb 的載體條帶，見圖1。將鑒定正確的菌液送至北京華大基因公司測序，測序結果與目的片段序列一致。

2.2 重組蛋白SDS-PAGE 鑒定

將鑒定正確的重組質粒pET-28a-NSP2 和空載體 pET-28a（+）轉化入大腸埃希菌感受態(tài) BL-21（DE3）中，經(jīng)誘導表達，破碎后分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE 驗證，可見相對分子質量約為35 kDa 的NSP2 特異性條帶，且以包涵體形式大量表達，見圖2。

圖1 重組質粒PCR、雙酶切鑒定Fig.1 PCR and restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pET-28a-NSP2

圖2 重組蛋白pET-28a-NSP2 的SDS-PAGE 分析Fig.2 The Glycine-SDS-PAGE analysis of recombinant protein pET-28a-NSP2

2.3 重組蛋白Western blotting 驗證

檢測結果表明包涵體形式的重組蛋白能與抗His 標簽的單抗發(fā)生特異性反應，在相對分子量約35 kDa 處可見特異性黃褐色條帶，見圖3，進一步證明NSP2 重組蛋白可在E.coli BL-21（DE3）感受態(tài)內(nèi)大量表達。

2.4 純化后重組蛋白的SDS-PAGE 鑒定

純化的重組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 分析，純化后的蛋白條帶大小與重組蛋白鑒定結果一致，可見相對分子質量約35 kDa 的目的條帶，見圖4，并用Micro BCATMProtein Assay Kit 測定蛋白濃度，重組蛋白濃度約 2.09 mg·mL-1。

圖3 Western blotting 鑒定NSP2 重組蛋白的表達Fig.3 Western blotting analysis of recombination protein NSP2

圖4 SDS-PAGE 鑒定純化的NSP2 重組蛋白的表達Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein NSP2

2.5 多克隆抗體效價

采用間接ELISA 法檢測表明，豚鼠血清中NSP2蛋白的多克隆抗體效價大于1∶5 000。

3 討論

在全球范圍內(nèi)，輪狀病毒幾乎感染每一個5 歲以下兒童，每年造成的死亡人數(shù)超過20 萬[1]，但目前尚未開發(fā)出針對RV 的特異性藥物，接種疫苗是世界公認的預防RV 性腸胃炎暴發(fā)的最有效手段。盡管現(xiàn)有的商品化減毒活疫苗在發(fā)達國家對預防RV 性腸胃炎非常有效，但仍存在散毒風險及潛在安全性等問題，畜牧業(yè)目前尚無商品化RV 疫苗，也無特異性治療藥物，臨床上也只是對癥治療。以豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）為例，豬輪狀病毒是導致世界范圍內(nèi)仔豬腹瀉的主要原因之一，該病潛伏期短，傳染性強，多呈地方性流行，主要感染7 日齡仔豬，發(fā)病仔豬以腹瀉、嘔吐和脫水為特征，病死率高達80%～100%，成年豬多數(shù)呈隱性感染，一般表現(xiàn)為消瘦、食欲不振和發(fā)育停滯等特點，嚴重損害養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益，阻礙養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[19-20]。目前國內(nèi)豬輪狀病毒感染率逐年遞增，一旦暴發(fā)，很難凈化，各種疫苗免疫也不能完全預防感染，因輪狀病毒基因組的特殊性，常發(fā)生重配、重排，大大增加了防控此病和開發(fā)疫苗的難度。對于新生兒、免疫缺陷患者、前往高危地區(qū)旅行的成年人、以及畜牧業(yè)來說開發(fā)廣譜抗RV 的藥物和疫苗都是迫切的。RV 初次感染嬰幼兒后，可在其體內(nèi)檢測到抗NSP2 蛋白的特異性血清IgG 和IgA，其抗體水平可維持100～150 d，當再次感染RV 時，其抗體水平可維持150 d[21]。另外，在初次感染后，在十二指腸液和糞便提取物中均可檢測到抗NSP2 蛋白的IgA。血清中抗NSP2 的抗體水平可能是RV 感染和再感染的敏感指標。抗NSP2 的抗體在再次感染后限制病毒復制的潛力值得進一步研究[21]。有研究表明即使在相距較遠的RV 血清群之間，NSP2 蛋白總體結構也是高度保守的[22]。2009 年范耀春[23]將 RV A 群 TB-Chen 株 NSP2 蛋白（Gen－Bank：AY787648）克隆至 pETL 載體中，表達并純化了NSP2 蛋白，免疫豚鼠制備了抗重組NSP2 蛋白的血清抗體，經(jīng)Western Blot 檢測，結果表明血清抗體可特異性識別重組NSP2 自身蛋白，也可交叉識別SA11 株和Wa 株感染MA104 細胞中的NSP2 蛋白，在間接免疫熒光實驗中進一步證明了這一結果，表達的TB-Chen 株NSP2 具有良好的免疫原性?，F(xiàn)有研究已證明重組NSP2 蛋白免疫兔子、豚鼠及小鼠均可獲得抗 NSP2 的高免血清[6，17，24-25]。將 NSP2 蛋白作為開發(fā)新型疫苗和藥物的靶蛋白，以期降低RV 感染對人類和畜牧業(yè)的危害。

重組NSP2 蛋白誘導表達時可見特異性蛋白條帶以包涵體形式大量表達，分子大小約35 kDa，NSP2蛋白以單體形式表達。但上清以及pET-28a（+）空載體中均存在與特異性蛋白條帶大小相似的條帶，經(jīng)Western blotting 對其進一步驗證，結果表明NSP2 蛋白以包涵體形式大量表達，其余相似蛋白可能為大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)自身蛋白。重組蛋白大量表達后收集菌體，超聲破碎收集沉淀，首先采用Ni-NTA 純化系統(tǒng)對重組蛋白進行純化，發(fā)現(xiàn)重組蛋白未能和填料良好的結合，過早出現(xiàn)在前期的洗脫液中，可能是蛋白本身標簽暴露不充分等因素導致與填料作用力弱，具體原因丞待研究。在后續(xù)試驗中將超聲破碎后的沉淀依次用 1、2、4、6、8 M 尿素重懸以洗脫蛋白，冰浴20 min 離心后收集上清，取適量上清 SDS-PAGE 檢測，結果表明 1、2 M 和 4 M 尿素溶液中均含有大量重組蛋白，6M 和8M 尿素溶液中重組蛋白量較少，4 M 尿素可較好洗脫蛋白。純化后總蛋白濃度可達2 mg·mL-1，重組蛋白含量占總蛋白的95%以上，結果表明未經(jīng)Ni-NTA 純化系統(tǒng)單純用尿素洗脫的方法也可獲得純化效果較好的重組蛋白，利用4 M 尿素溶液純化蛋白不僅降低了試驗成本，也減少了試驗的復雜程度。RV 可感染嬰幼兒及許多哺乳動物和鳥類，其中包括試驗常用的家兔和小鼠，感染后的動物體內(nèi)可產(chǎn)生抗RV 的抗體，可能對后續(xù)試驗產(chǎn)生影響，豚鼠不感染RV，可作為試驗動物制備多克隆抗體。因豚鼠對弗氏佐劑較為敏感[26]，免疫中易造成死亡，故而采用ISA206 佐劑，其乳化方法簡單易操作且造價低廉。

研究成功構建了pET-28a-NSP2 重組表達質粒，并在大腸埃希菌BL21（DE3）中高效表達了全長NSP2 蛋白，純化后的蛋白免疫豚鼠制備了多克隆抗體。利用抗NSP2 的高免血清通過間接免疫熒光試驗可對RV 感染宿主細胞后不同時期NSP2 蛋白的表達及其分布進行檢測。下一步將制備的抗NSP2 多克隆抗體作為一抗，進行間接免疫熒光與激光共聚焦試驗，在感染RV 的宿主細胞內(nèi)對NSP2 蛋白進行定位，進一步研究NSP2 蛋白影響病毒質形成的關鍵結構域、病毒自身復制和致病機制。輪狀病毒侵入宿主細胞后的復制機制尚不明確，研究輪狀病毒侵入宿主細胞后的復制機制可為輪狀病毒新型藥物和疫苗的研發(fā)提供借鑒。