桃果實中MiR167a與其靶基因的鑒定及對IAA的響應(yīng)分析

張彥蘋，朱旭東，王 晨，劉照坤，李慶魁

(1 蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 江蘇蘇州 215008；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院, 南京 210095；3 蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 江蘇蘇州 215000)

植物的性狀由基因控制，基因的表達被多種調(diào)節(jié)因子高度調(diào)節(jié)，以確保各組織的正常發(fā)育和功能以及適應(yīng)外界的變化。MicroRNA(miRNA)是一類長度為19～24個核苷酸的內(nèi)源非編碼小RNA分子[1]，已被證明通過參與轉(zhuǎn)錄后翻譯在植物的生長、發(fā)育、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面起調(diào)控作用。miRNA具有在轉(zhuǎn)錄后水平與靶基因互補配對，通過剪切或翻譯抑制的方式調(diào)控靶基因表達的功能。在植物中，目前的研究發(fā)現(xiàn)許多生長素相關(guān)表型出現(xiàn)在miRNA-靶基因互作體系中，說明植物miRNA直接或者間接地參與了生長素信號通路的調(diào)控，在植物的生長發(fā)育過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。

生長素信號途徑中，生長素和ARF(auxin response factor)轉(zhuǎn)錄因子均為植物生長素響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[2]。ARFs轉(zhuǎn)錄因子可以與生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)域中生長素響應(yīng)元件(AuxREs)TGTCTC/GAGACA發(fā)生特異性結(jié)合，激活或抑制下游基因的表達[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，植物中miR160和miR167通過靶向ARFs基因參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控，進而影響植物的生長發(fā)育。如在擬南芥中，miR167通過調(diào)控ARF6和ARF8的表達影響擬南芥雌蕊、雄蕊以及花瓣的發(fā)育[4]。miR160能夠介導(dǎo)ARF17的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而影響植株對生長素的敏感性，進而調(diào)控植物體的發(fā)育[5]。此外，在其他植物中也已證實miR160及miR167家族的靶基因為ARFs，如番茄miR167下調(diào)ARF6和ARF8導(dǎo)致花的發(fā)育異常和雌性不育[6]。miR160a抑制slARF10影響番茄葉片的長出及早期果實的發(fā)育[7]。水稻中超量表達miR167導(dǎo)致水稻分蘗角度變大和植株矮小，表明miR167在調(diào)節(jié)植株株型上起作用[8]。在低溫狀態(tài)下，草莓miR167通過調(diào)節(jié)靶基因ARF8來調(diào)控激素的生物合成從而延緩草莓果實的衰老[9]。miR167靶向ARF8控制細胞的伸長參與大花牽牛(Ipomoeanil)幼苗莖尖，葉原基和雌蕊等器官的發(fā)育，并可能間接調(diào)控氣孔的開放[10]。在雜柑品種‘清見’的果實發(fā)育過程中，伴隨著IAA含量的變化，miR167和靶基因ARF8的表達量呈現(xiàn)出此消彼長的趨勢[11]。綜上，miR167靶向ARFs基因參與調(diào)控植物生長發(fā)育及生物脅迫等多個方面，表明二者在植物生長發(fā)育過程中具有十分重要的作用。

目前miR167的研究集中于擬南芥、水稻、番茄等模式植物中，且大多研究的重點為植株的生長發(fā)育調(diào)控，有關(guān)miR167參與生長素信號通路調(diào)控果實生長發(fā)育的研究還鮮有報道。本項目組前期從桃的基因組中預(yù)測到了miR167a及其對應(yīng)的3個ARFs靶基因[12]，本研究中以桃品種‘小白鳳’不同發(fā)育時期的果實為實驗材料，驗證了該品種果實中ppe-miR167a的精確序列，克隆了預(yù)測的3個ARFs靶基因的ORF并進行了序列進化和保守性分析；qRT-PCR分析了miR167a及其靶基因在果實不同發(fā)育時期的空間表達情況；降解組測序確定了桃ppe-miR167a與ARF8間的裂解作用模式并明確了裂解位點；研究了ppe-miR167a、ARF8及其3′ 端裂解產(chǎn)物對外源IAA處理的響應(yīng)，為今后進一步研究miRNA參與生長素信號途徑調(diào)控桃果實發(fā)育的分子機制提供了理論支持。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院合作試驗基地的‘小白鳳’水蜜桃(Prunuspersica)成年樹上不同發(fā)育時期的果實作為實驗材料。于花后20 d (果實第一次迅速生長期)、50 d(果實硬核期)、75 d(果實第二次迅速生長期)和90 d(果實成熟期)分別取樣。

生長素處理于2019年6月10日(成熟前30 d)用0.2 mmol·L-1外源IAA(加1% 吐溫80)進行活體浸果處理1 min，清水(加1% 吐溫80)為對照，處理后30 d取樣。采集的所有樣品帶回實驗室液氮速凍并放置在-80 ℃冰箱保存。

1.2 引物合成及生化試劑

實驗所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體序列見表1。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、DNase酶Ⅰ、Power Script Ⅱ TM反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、dNTPs、pMD19-T載體、DNA Marker、熒光定量染料SYBR Green Ⅰ均購自TaKaRa公司，DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

表1 引物序列及用途

1.3 方 法

1.3.1 RNA提取及miRNA分離采用改良CTAB法提取不同發(fā)育階段果實中的總RNA[12]，DNase Ⅰ酶(RNase free)消化及氯仿抽提去除基因組DNA。在總RNA基礎(chǔ)上，用4 mol·L-1LiCl分離出低分子量RNA(LMWRNA)與mRNA[12]。

1.3.2 cDNA合成mRNA與LMWRNA cDNA合成參考Zhang等[12-13]的方法。

1.3.3 桃miR167a精確序列驗證以1.3.2中合成的LMWRNA的cDNA為模板，用表1中的引物進行擴增，miR-RACE方法參照Sun等進行[14]。

1.3.4 預(yù)測靶基因的克隆及序列分析根據(jù)從桃基因組中預(yù)測miR167a的3個靶基因序列[12]，以所得總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得‘小白鳳’桃PpARF6、PpARF8 及PpARF6-like的ORF序列。獲得的序列在NCBI中進行Blast(http/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比對。利用保守結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(CDD, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)進行保守結(jié)構(gòu)域的分析。系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建使用MEGA 5.0軟件。

1.3.5 降解組測序依據(jù)‘小白鳳’桃確定的4個發(fā)育時期，選取花后20、50、75 和90 d果實的果肉部分進行降解組測序?？俁NA 用Trizol試劑盒 (Invitrogen, CA, USA)提取，構(gòu)建4個降解組文庫，樣品送聯(lián)川生物公司(杭州)進行單末端(50 bp)測序，測序平臺為Illumina Hiseq 2500(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)。

1.3.6 實時熒光定量RT-PCR分別以mRNA、miRNA以及加5′端接頭和3′-ploy(A)尾巴純化的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以桃RPII基因[15]和U6 rRNA為內(nèi)參進行qRT-PCR擴增[16]。實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用LinRegPCR和Excel 2010軟件分析。目的基因的引物見表 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 ppe-miR167a 精確序列驗證及在不同發(fā)育時期桃果實中的表達

依據(jù)前期在桃基因組中預(yù)測的桃ppe-miR167a序列，利用miR-RACE技術(shù)驗證ppe-miR167a在桃品種‘小白鳳’中的精確序列[12]。實驗結(jié)果表明，驗證的ppe-miR167 序列與桃基因組中預(yù)測的序列在5′ 和3′ 端均存在一定的堿基差異，即驗證序列在5′ 端第1個堿基處多了堿基U，而在3′ 端最后1個堿基處少了堿基G(表2)。

為進一步了解ppe-miR167a在桃果實發(fā)育過程中的表達情況，本試驗利用qRT-PCR對其在‘小白鳳’桃果實發(fā)育過程中4個關(guān)鍵時期的時空表達進行了分析[17]。結(jié)果表明，ppe-miR167a在花后20 d時表達量最高，隨著果實進入硬核期，ppe-miR167a表達量顯著下降，自硬核期(花后50 d)開始，ppe-miR167a的表達量逐漸上升(圖1)。

2.2 ppe-miR167a預(yù)測靶基因的克隆及序列分析

依據(jù)前期利用psRNA target web server(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)在基因組中預(yù)測的ppe-miR167a的靶基因結(jié)果(表3)，為分析預(yù)測的靶基因，以mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用在桃基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_v1.0)中比對到的序列設(shè)計引物，克隆得到PpARF6(XM_020562547)、PpARF8(XM_020560148)和PpARF6-like(XM_007217628)的完整ORF，大小分別為2 664、1 767 和 2 760 bp(圖2)。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示3個ARFs基因均含有高度保守的生長素響應(yīng)DNA結(jié)合域(圖3)。

表2 桃miR167a預(yù)測序列與驗證序列比較

不同小寫字母代表顯著差異(P<0.05)，下同圖1 桃果實不同發(fā)育時期ppe-miR167a的表達Different normal letters represent significant differences (P<0.05), the same as belowFig.1 Relative expression of ppe-miR167a in different stages of peach fruits

2.3 ppe-miR167a預(yù)測靶基因的系統(tǒng)發(fā)育

通過MEGA 5.0 軟件構(gòu)建了ppe-miR167a 3個預(yù)測靶基因的系統(tǒng)進化樹(圖4)，結(jié)果顯示，桃中PpARF6、PpARF8 及PpARF6-like均與巴旦杏的親緣關(guān)系較近，其次為梅和甜櫻桃。PpARF6和PpARF6-like與楊樹的親緣關(guān)系較遠，而PpARF8與核桃的親緣關(guān)系較遠(圖4)。

2.4 桃果實發(fā)育過程中ppe-miR167a預(yù)測靶基因的表達

分析ppe-miR167a預(yù)測靶基因在果實不同發(fā)育階段中的表達結(jié)果表明，PpARF6在花后20和75 d果實中的表達基本一致，在硬核期(花后50 d)的表達相對較高，花后90 d果實中表達量最高(圖5)。PpARF8的表達量在果實第一次快速膨大期(花后20 d)最高，至硬核期(花后50 d)有所下降，在隨后的兩個時期中無顯著變化。PpARF6-like的表達量在4個發(fā)育時期無顯著變化(圖5)。分析ppe-miR167a與其預(yù)測靶基因的表達模式表明，PpARF8與ppe-miR167a的表達趨勢基本一致，PpARF6和PpARF6-like的表達與其無明顯相關(guān)性。因此，預(yù)測的3個靶基因及其與ppe-miR167a間的作用方式均有待進一步深入研究。

2.5 ppe-miR167a與其靶基因間的作用方式

為驗證預(yù)測靶基因的真實性及ppe-miR167a與靶基因間的作用模式，本研究通過降解組測序進行了鑒定分析。結(jié)果表明，ppe-miR167a以剪切方式作用的靶基因有2個，其一為ARFs家族基因，即PpARF8，另一個為HPR-A基因(生物信息學(xué)未預(yù)測到，非ARF基因家族成員)，其與miR167a間的作用頻度較低，本研究中不進行詳細分析。降解組未檢測到ppe-miR167a與PpARF6和PpARF6-like之間的作用，說明信息學(xué)預(yù)測結(jié)果存在一定的誤差，有必要進行深入的驗證分析。降解組數(shù)據(jù)顯示ppe-miR167a 作用于靶基因PpARF8的裂解位點位于miR167a 5′端的第9和10位堿基之間，即PpARF8 的2 441位堿基處(圖6)。另外，在桃果實發(fā)育的4個時期，miR167a對PpARF8的裂解頻度存在顯著差異(表4)，其中二者間的裂解頻度在花后20和90 d時較低。在花后75 d時作用強度最大，表明miR167a可能在桃果實發(fā)育的第二次迅速生長期(花后75 d)起主要調(diào)節(jié)作用。

表3 預(yù)測的桃基因組中miR167a的靶基因

圖2 桃PpARF6、PpARF8 及PpARF6-like的ORF擴增(M. DL5000)Fig.2 PCR products of PpARF6, PpARF8 and PpARF6-like genes ORF

圖3 桃PpARF6、PpARF8 及PpARF6-like序列的保守結(jié)構(gòu)域分布Fig.3 The distribution of conserved domains in PpARF6, PpARF8 and PpARF6-like genes

A. PpARF6；B. PpARF6-like；C. PpARF8圖4 PpARF6、PpARF8 及PpARF6-like預(yù)測靶基因的進化樹分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of predicted target genes PpARF6, PpARF8 and PpARF6-like

2.6 生長素處理對桃ppe-miR167a、靶基因PpARF8 及裂解產(chǎn)物表達的影響

上述降解組結(jié)果表明ppe-miR167a的主效靶基因為生長素應(yīng)答因子PpARF8，已知生長素通過與應(yīng)答因子(ARF)結(jié)合影響植物的生長發(fā)育，因此為解析ppe-miR167a參與生長素信號調(diào)控果實發(fā)育的功能，本研究在果實發(fā)育后期用外源IAA處理30 d，對果實中ppe-miR167a及其靶基因的空間表達進行了分析，同時也分析了二者間裂解產(chǎn)物表達量的變化。結(jié)果表明，果實發(fā)育后期生長素處理后，處理組中ppe-miR167a的表達量低于對照組，而其靶基因PpARF8以及3′ 端裂解產(chǎn)物的表達在處理組中均高于對照組(圖7)。由以上結(jié)果可以看出，生長素處理能在一定程度上影響ppe-miR167a及其靶基因PpARF8 的表達以及二者間的作用頻度。

不同小寫字母代表3個基因在不同發(fā)育時期表達量的顯著性差異(P<0.05)圖5 果實不同發(fā)育階段PpARF6、PpARF8 及PpARF6-like的相對表達Different normal letters represent the significant differences of the expression levels of three genes in different development periods (P<0.05)Fig.5 Relative expression of PpARF6, PpARF8 and PpARF6-like in different stages of peach fruits

圖6 ppe-miR167a與PpARF8間的作用方式及作用位點鑒定Fig.6 The mode and site of action between ppe-miR167a and PpARF8 were identified by degradome sequencing

表4 降解組測序鑒定的ppe-miR167a的靶基因信息

不同小寫字母代表同一基因在處理前后的表達量的差異顯著(P<0.05)圖7 IAA處理后ppe-miR167a與其靶基因及靶基因3′ 端裂解產(chǎn)物的表達Different normal letters represent the significant differences of the expression levels of the same gene with treatments (P<0.05)Fig.7 Expression patterns of ppe-miR167a, ARF8 and cleavage product of peach ARF8 3′ end with IAA treatment and the control fruits

3 討 論

目前的報道已經(jīng)證明ARF轉(zhuǎn)錄因子為生長素信號通路中的關(guān)鍵因子，直接參與生長素信號，在植物果實成熟過程中發(fā)揮重要作用[18-21]。本項目組前期的研究發(fā)現(xiàn)ppe-miR167a的靶基因為生長素響應(yīng)因子ARFs家族成員，為研究二者間的作用關(guān)系及它們在桃果實發(fā)育過程中可能存在的作用，我們首先驗證了miR167a在‘小白鳳’品種中的精確序列，結(jié)果表明，ppe-miR167a的序列在不同品種間存在一定的堿基差異[12]，且差異堿基發(fā)生在序列的兩端，這與早期其他植物中的研究結(jié)果一致[22]。分析ppe-miR167a在不同發(fā)育時期桃果實中的表達情況發(fā)現(xiàn)miR167a在果實快速膨大期和果實成熟期表達量較高，而在果實硬核期表達量較低，這與雜柑品種‘清見’中miR167a的表達量在果實發(fā)育前中期相對較高而后期較低有所不同[11]。3個ARFs基因的空間表達結(jié)果顯示PpARF8與ppe-miR167a的表達趨勢基本一致，PpARF6和PpARF6-like的表達與ppe-miR167a的表達無明顯相關(guān)性，這與早期研究報道的miRNA與靶基因的表達一般呈負相關(guān)不同[23]。擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)，miR167與其靶基因AtARF6和AtARF8間存在反饋調(diào)節(jié)作用，AtARF6能激活miR167表達，AtARF8抑制miR167表達，它們之間通過彼此激活或抑制作用來調(diào)控不定根的形成[24]。在甜橙果實成熟過程中即花后170～250 d，CiARF8的表達量明顯下調(diào)，在花后250 d的表達量保持在一個較低的水平[25]，這與本研究中PpARF8在桃不同發(fā)育時期果實中的表達也存在一定差異。

為驗證預(yù)測靶基因的真實性及ppe-miR167a與ARFs基因間的作用模式，我們通過降解組測序進行了分析，結(jié)果表明僅PpARF8上存在miR167a的裂解位點，說明生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果存在一定的誤差，可能是預(yù)測時參數(shù)設(shè)置問題導(dǎo)致了一定的假陽性結(jié)果。降解組結(jié)果顯示ppe-miR167a 作用于靶基因PpARF8的裂解位點位于miR167a 5′ 端的第9和10位堿基之間，這與早期報道的miRNA裂解靶基因的位點大多位于miRNA 5′ 端的第10和11個堿基之間有所不同[26-27]，說明miRNA對其靶基因的裂解位點既有一定的保守性，又存在一定的多樣性[28-30]。降解組結(jié)果顯示3′端裂解產(chǎn)物的表達與對應(yīng)ppe-miR167a的表達趨勢不一致，這與之前研究者在桃及其他物種中推測的miRNA表達量可能與靶基因表達趨勢相反而與3′端裂解產(chǎn)物的表達趨勢一致的情況存在差異[13, 31]，這可能是miRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平參與了植物發(fā)育的多個過程，其不僅對靶向的mRNA起作用，同時也可以和其他的RNAs相互作用調(diào)控其自身或其他的競爭性內(nèi)源RNA[32-33]。

已有的報道表明AtARF4，AtARF5，AtARF16，AtARF19，OsARF1 和OsARF23 在生長素處理后，轉(zhuǎn)錄物的表達量有所增加[34-37]。FvARF響應(yīng)生長素處理[38]，SlARF2 轉(zhuǎn)錄物積累量明顯受生長素和赤霉素的正調(diào)控[39]。目前，研究最多的生長素是IAA[40]，但miR167靶向ARFs基因?qū)AA處理的響應(yīng)分析還未見報道。王少希等通過外源IAA處理[21]，研究了不同濃度和不同IAA處理時間對FvARFs表達的影響，結(jié)果表明外源 IAA處理后所有FvARFs的表達均增加，并在處理6 h或12 h達到峰值，但其未對miR167的表達進行分析。本研究中外源IAA處理桃果實30 d后定量表達結(jié)果顯示，miR167a的表達量在處理組中低于對照組，PpARF8及3′ 端裂解產(chǎn)物的表達在處理組中均高于對照組，PpARF8在IAA處理后的表達變化情況與王少希等[21]的研究結(jié)果一致。由此可知，外源生長素處理能在一定程度上影響了miR167a和PpARF8 的表達以及二者間的裂解作用頻度，但未表現(xiàn)出之前研究者推測的miRNA表達量可能與靶基因表達趨勢相反而與3′ 端裂解產(chǎn)物的表達趨勢一致的現(xiàn)象，這一情況推測可能是miRNA和靶基因在植物的生長發(fā)育中不止在一個代謝過程中起作用，它們可能參與了植物生長發(fā)育的多個方面，受多種因素調(diào)控。綜上，桃果實中ppe-miR167a可以通過介導(dǎo)其靶基因PpARF8的裂解影響生長素信號途徑參與果實發(fā)育的調(diào)控，但其調(diào)控機理及作用通路還有待進一步深入研究。