成釉細(xì)胞瘤基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的初步研究

陸長(zhǎng)璽， 郭傳瑸

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔綜合科，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011；2.北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，北京 100081）

在原發(fā)腫瘤逐漸侵襲的過程中，除抑制腫瘤細(xì)胞增生外，降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力對(duì)腫瘤的侵襲也十分重要。細(xì)胞外基質(zhì)的降解主要靠蛋白水解酶?；|(zhì)金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinase，MMP）是4類蛋白水解酶（絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天門冬氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶）中較重要的一類。

MMP是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，經(jīng)典型MMP以水溶性酶原形式分泌到細(xì)胞外，需要在激活劑作用下才具有酶活性；新型MMP則不同，分泌型MMP直接以活性酶的形式分泌到細(xì)胞外，而另一種膜型的MMP則結(jié)合在胞膜上。研究表明，在多種類型的腫瘤系中，MMP的表達(dá)水平和活性水平與其侵襲性和轉(zhuǎn)移成正相關(guān)[1-5]。

MMP-2也稱為Ⅳ型膠原酶，其可以降解Ⅳ型膠原，Ⅳ型膠原同時(shí)也是構(gòu)成基底膜的主要膠原成分。研究普遍認(rèn)為，MMP-2水平可能是腫瘤惡性程度的標(biāo)志之一。本研究對(duì)MMP-2在成釉細(xì)胞瘤體及骨組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討其在成釉細(xì)胞瘤侵襲及骨破壞過程中的作用。

1 資料和方法

1.1 組織標(biāo)本準(zhǔn)備

石蠟標(biāo)本共26塊，為2005—2009年北京大學(xué)口腔醫(yī)院手術(shù)所得，其中確診為成釉細(xì)胞瘤的標(biāo)本為25塊，惡性成釉細(xì)胞瘤為1塊。成釉細(xì)胞瘤病理類型包括單囊型（11例）、一般型（13例）及角化型（1例）。其中，一般型又可分為4個(gè)亞型：濾泡型、叢狀型、棘皮瘤型、顆粒細(xì)胞型。標(biāo)本均用10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）充分脫鈣后進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為5 μm，隨后進(jìn)行免疫組化染色。

1.2 免疫組化染色

試劑包括免疫組化通用型試劑盒,兔抗人MMP-2多克隆抗體,增強(qiáng)聚合物法染色劑（diaminobenzidine,DAB）。以上試劑均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

染色過程：石蠟切片，60℃烤片2 d后，常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸溶液下微波抗原熱修復(fù)15 min，3%過氧化氫去離子水孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）沖洗3次，每次3 min，滴加正常山羊血清工作液（A液）置室溫孵育15 min，傾去，滴加MMP-2多克隆抗體（一抗），37℃下孵育3 h；PBS沖洗3次，每次3 min，滴加生物素化山羊抗兔IgG（B液）置室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（C液）置室溫孵育15 min；PBS沖洗3次，每次3 min，DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片劑封片。

1.3 結(jié)果判斷

因細(xì)胞較少，本研究采取如下方法判斷：MMP-2陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，在高倍鏡下觀察，深褐色區(qū)域>50%為強(qiáng)陽性,26%～50%為中等陽性，5%～25%或僅有少量斑點(diǎn)為弱陽性，<5%為陰性。此外，因細(xì)胞數(shù)過少或其他原因無法確定的標(biāo)本判定為“不確定”。分別將已知的陽性片和PBS代替一抗（MMP-2）設(shè)為陽性和陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果分析

分析軟組織中MMP-2的表達(dá)，包括腫瘤組織及基質(zhì)組織。分析骨組織中MMP-2的表達(dá)，探討其與骨侵襲性的關(guān)系。分析各型成釉細(xì)胞瘤中MMP-2的表達(dá)是否有差異，以及此差異是否與侵襲性相關(guān)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)MMP-2表達(dá)的總陽性率，比較各病理類型的陽性率，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2染色結(jié)果

在成釉細(xì)胞瘤中，絕大部分MMP-2強(qiáng)陽性表達(dá)存在于外周柱狀細(xì)胞的胞質(zhì)中，少量細(xì)胞膜呈MMP-2陽性表達(dá)，中心星網(wǎng)狀細(xì)胞少見或未見表達(dá)。許多基質(zhì)中類似成纖維細(xì)胞的組織也存在MMP-2的陽性表達(dá)。

如圖1所示，在單囊型成釉細(xì)胞瘤的囊壁細(xì)胞內(nèi)，MMP-2呈強(qiáng)陽性表達(dá)，MMP-2在囊壁基底層呈強(qiáng)陽性表達(dá),纖維結(jié)締組織中也有MMP-2的強(qiáng)陽性表達(dá)；腫瘤組織少部分外層柱狀細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見MMP-2表達(dá)（白色箭頭），少量中心星網(wǎng)狀分化細(xì)胞可見MMP-2表達(dá)（紅色箭頭）。所以，單囊型MMP-2的表達(dá)主要發(fā)生在基質(zhì)中。

圖1 單囊型成釉細(xì)胞瘤免疫組化染色圖（×200）Figure 1 Immunohistochemistry staining of unicystic ameloblastoma （×200）

如圖2所示，叢狀型成釉細(xì)胞瘤免疫組化染色可見腫瘤上皮島外周柱狀細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有MMP-2陽性表達(dá)，基質(zhì)中出現(xiàn)MMP-2強(qiáng)陽性表達(dá)；神經(jīng)組織外周也有MMP-2陽性表達(dá)（白色箭頭）。

圖2 叢狀型成釉細(xì)胞瘤免疫組化染色圖（×400）Figure 2 Immunohistochemistry staining of plexiform ameloblastoma （×400）

如圖3所示，角化型成釉細(xì)胞瘤免疫組化染色結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞中心為角化物，MMP-2呈強(qiáng)陽性表達(dá)，外周柱狀細(xì)胞質(zhì)呈MMP-2強(qiáng)陽性表達(dá)。

圖3 角化型成釉細(xì)胞瘤免疫組化染色圖，腫瘤及角化物（×400）Figure 3 Immunohistochemistry staining of keratotic ameloblastoma,tumor and keratin （×400）

惡性成釉細(xì)胞瘤免疫組化染色結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞排列無規(guī)律，可見核分裂象，整個(gè)腫瘤組織中的細(xì)胞質(zhì)中均有MMP-2陽性表達(dá)（圖4）。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

本研究中，MMP-2表達(dá)的總陽性率為88.5%，強(qiáng)陽性率為65.4%，中等陽性率為15.4%，弱陽性率為7.7%，陰性率為3.8%，不確定的為7.7%。其中，一般型成釉細(xì)胞瘤MMP-2表達(dá)的總陽性率為76.9%，強(qiáng)陽性率為61.5%，中等陽性率為7.7%，弱陽性率為7.7%，陰性率為7.7%，不確定的為15.4%；單囊型成釉細(xì)胞瘤MMP-2表達(dá)的總陽性率為100%，強(qiáng)陽性率為63.6%，中等陽性率為27.3%，弱陽性率為9.1%，無陰性及不確定的病例；角化型及惡性成釉細(xì)胞瘤均呈MMP-2強(qiáng)陽性表達(dá)。不同病理類型成釉細(xì)胞瘤中MMP-2的表達(dá)情況見表1。

將一般型及單囊型成釉細(xì)胞瘤MMP-2陽性率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩者M(jìn)MP-2的表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。

圖4 惡性成釉細(xì)胞瘤免疫組化染色圖 （×400）Figure 4 Immunohistochemistry staining of malignant ameloblastoma （×400）

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)展過程中，癌細(xì)胞必須突破基底膜才能從原位癌向周圍組織侵襲，進(jìn)而發(fā)展成為浸潤(rùn)癌?；啄な悄[瘤細(xì)胞侵襲生長(zhǎng)的主要屏障，主要成分有Ⅳ型膠原、層連蛋白（laminin,Lm）和纖維粘連蛋白（fibronectin,Fn）等，其中Ⅳ型膠原可能是最主要、最穩(wěn)定的成分。MMP幾乎可以降解所有細(xì)胞外基質(zhì) （extracellular matrix,ECM）和基底膜（basement membrane,BM）成分，在腫瘤細(xì)胞突破基底膜和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[6]。

MMP在腫瘤細(xì)胞移動(dòng)侵襲過程中的多重作用主要為直接降解基底膜成分。如MMP-2可水解Ⅳ型膠原，破壞基底膜的完整性；調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附，打破原有的黏結(jié)，形成新的細(xì)胞間及細(xì)胞基質(zhì)間的黏附，有利于細(xì)胞的游走；MMP作用于ECM能激活生成新的活性因子，產(chǎn)生一系列反應(yīng)[7]。

表1 不同病理類型成釉細(xì)胞瘤中MMP-2的表達(dá)情況（例）Table 1 Expression of MMP-2 in different pathological types of ameloblastoma （case）

成釉細(xì)胞瘤雖然是良性腫瘤，但包膜不完整，具有局部侵襲性。有學(xué)者從細(xì)胞增殖活力的角度分析了成釉細(xì)胞瘤的生物學(xué)行為，通過對(duì)成釉細(xì)胞瘤和角化囊腫細(xì)胞的體外培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，兩者的細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)不同，前者細(xì)胞增殖活躍，具有主動(dòng)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，細(xì)胞向周圍游走的能力強(qiáng)；而后者細(xì)胞的膨脹性生長(zhǎng)能力強(qiáng)，能使病變范圍變大，并具有術(shù)后易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。Piattelli等[8]的研究表明，成釉細(xì)胞瘤的增殖細(xì)胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA）細(xì)胞主要集中在腫瘤上皮島的外周細(xì)胞上，提示外周細(xì)胞的增殖活躍，在成釉細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。

關(guān)于基底膜和蛋白水解酶等在成釉細(xì)胞瘤局部侵襲中作用的研究尚少。本研究利用免疫組化的方法對(duì)MMP-2在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)和分布進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在26例成釉細(xì)胞瘤中，對(duì)于基質(zhì)細(xì)胞，有24例可見MMP-2強(qiáng)陽性染色；對(duì)于腫瘤細(xì)胞，大部分MMP-2陽性表達(dá)位于外周柱狀細(xì)胞,中心星網(wǎng)狀細(xì)胞少見或未見表達(dá)。

本研究中，MMP-2表達(dá)的總陽性率為88.5%，強(qiáng)陽性率為65.4%，陰性率為3.8%。Kumamoto等[9]的研究顯示，MMP-2表達(dá)的總陽性率為93.2%，強(qiáng)陽性率為45.5%，陰性率為6.8%。Fregnani等[10]的研究顯示，腫瘤細(xì)胞中MMP-2表達(dá)的陽性率為47.3%，基質(zhì)細(xì)胞中為38.2%，總陽性率為85.5%。陶謙等[6]的研究顯示，MMP-2表達(dá)的總陽性率為92%，強(qiáng)陽性率為84%，陰性率為8%。孫福星等[11]的研究顯示，中等至強(qiáng)的陽性率為79%。以上結(jié)果顯示，各研究的總陽性率差別較小，而強(qiáng)陽性率差別較大，可能與實(shí)驗(yàn)條件和判斷標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。

角化型成釉細(xì)胞瘤的外周柱狀細(xì)胞胞質(zhì)中，MMP-2呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其角化物中的MMP-2也呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)，這提示了角化型成釉細(xì)胞瘤的侵襲性可能大大強(qiáng)于單囊型及一般型成釉細(xì)胞瘤。

1例惡性成釉細(xì)胞瘤中，腫瘤組織不呈現(xiàn)“成釉器”樣表現(xiàn)，MMP-2的陽性表達(dá)也不局限在外周細(xì)胞，在中心部分也有強(qiáng)陽性表達(dá)。

本研究結(jié)果提示，成釉細(xì)胞瘤的外周細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生的MMP-2可致基底膜成分Ⅳ型膠原降解，破壞基底膜的完整性，這可能是成釉細(xì)胞瘤局部侵襲生長(zhǎng)的機(jī)制之一。但不同病理類型間的MMP-2表達(dá)并無顯著差異（P>0.05）。Fregnani等[10]將叢狀型與其他病理類型的成釉細(xì)胞瘤比較，MMP-2的表達(dá)無顯著差異（P>0.05）。Kumamoto等[9]比較了叢狀型和濾泡型成釉細(xì)胞瘤中MMP-2的表達(dá)，未見明顯差異（P>0.05）。陶謙等[6]的研究則提示，MMP-2的表達(dá)與是否為單囊型或一般型無關(guān)，但成釉細(xì)胞瘤與角化囊腫及含牙囊腫間的差異顯著。

臨床上，一般型成釉細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)率較單囊型高，主要原因可能并不在于MMP-2的表達(dá)或侵襲的深度，而是由于單囊型成釉細(xì)胞瘤無實(shí)性瘤體，邊界光滑，容易刮治，而一般型成釉細(xì)胞瘤為多囊，呈囊實(shí)性混合腫塊，其對(duì)骨壁的不規(guī)則侵襲造成瘤體不易被刮凈，而需采用一定邊界范圍的切除法。