骨橋蛋白在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義

趙嚴(yán)禮 張鐵成 唐瞾隆 陳輝 周永強(qiáng) 劉桂才

成釉細(xì)胞瘤是口腔頜面部常見的牙源性良性腫瘤之一[1]，約占上下頜骨良性腫瘤的10%，其雖生長緩慢，但具有局部侵襲性的特點(diǎn)。成釉細(xì)胞瘤的發(fā)病病因不明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其可能來源于各種牙源性上皮細(xì)胞，如牙源性濾泡上皮襯里等[2]。成釉細(xì)胞瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，往往認(rèn)為是與其具有局部侵襲性有關(guān)，臨床上也可見惡變[3]?，F(xiàn)階段，對成釉細(xì)胞瘤的治療多采用廣泛手術(shù)切除病變骨質(zhì)和(或)帶血管蒂腓骨或髂骨移植修復(fù)頜骨缺損的方法治療該疾病，術(shù)后往往對患者的生活質(zhì)量有一定的影響。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是細(xì)胞基質(zhì)蛋白小整合素結(jié)合配體N端連結(jié)糖蛋白(small integrin-binding N-linked glycoprotein，SIBLING)家族中的一員[4]，在正常組織中OPN表達(dá)水平很低，但在一些腫瘤組織中表達(dá)水平較高[5]。本文通過對研究骨橋蛋白在臨床上較常見的成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況，初步探討其與成釉細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的相關(guān)性，旨在為臨床上治療成釉細(xì)胞瘤提供新的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 實(shí)驗(yàn)組60 例(濾泡型32 例，叢狀型20 例,單囊型8 例)成釉細(xì)胞瘤標(biāo)本取于南通市口腔醫(yī)院口腔頜面外科。標(biāo)本中男31 例,女29 例,年齡12～57 歲,平均30.32 歲。對照組取10 例門診阻生牙拔除時(shí)所切除的正常健康牙齦黏膜組織。

1.1.2 主要試劑 透明質(zhì)酸酶、Anti-Mouse IgG Antibody、Bovine serum albumin(BSA)、DAB substrate(武漢博士德生物有限公司)；Anti-OPN Antibody(美國Baylor大學(xué)Dr.Qin實(shí)驗(yàn)室)。

1.1.3 主要儀器 病理石蠟切片機(jī)(徠卡公司，德國)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(Beckman公司，美國)；高級熒光顯微鏡(Eclipse 90i，日本尼康)。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常規(guī)制片，恒溫加熱箱中70 ℃烘烤切片4 h；二甲苯脫蠟；梯度乙醇水化；蘇木素染色；鹽酸酒精分化；0.5 %伊紅染色；梯度無水乙醇脫水；透明；封片；置于室溫凝固，備用觀察。

1.2.2 免疫組織化學(xué)SP法 70 ℃烤片24 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水， 3%過氧化氫處理10 min，修復(fù)液37 ℃，孵育60 min，山羊混合血清封閉4 ℃過夜，次日加入稀釋(1∶400)Anti-Osteopontin鼠抗一抗， 4 ℃過夜，次日加入即用型山羊多克隆抗體二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，透明，封片，拍片。

1.2.3 結(jié)果判定 胞漿中出現(xiàn)黃色顆粒為陽性著色。評分判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]A(按切片中細(xì)胞顯色有無及深淺評分)： 0 分為細(xì)胞無色； 1 分為淺黃色； 2 分為棕黃色； 3 分為棕褐色。 B(按切片中顯色瘤細(xì)胞占切片中瘤細(xì)胞的比例評分)： 1 分為25%以下； 2 分為25%～75%； 3 分為75%以上。 每例積分=A×B，按積分高低分為:陰性(-)，積分0 分；弱陽性(+)， 積分1～3 分；中度陽性(++)，積分4～7 分；強(qiáng)陽性(+++)，積分>7。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)分析成釉細(xì)胞瘤2 種主要組織學(xué)類型與正常牙齦黏膜中骨橋蛋白表達(dá)陽性率的差別，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE 染色

染色結(jié)果見圖 1。

2.2 免疫組織化學(xué)染色

結(jié)果如圖 2，骨橋蛋白在正常的牙齦黏膜呈現(xiàn)陰性表達(dá)，在濾泡型成釉細(xì)胞瘤上皮細(xì)胞的細(xì)胞核、星網(wǎng)狀層細(xì)胞和瘤周基質(zhì)呈陽性表達(dá)；在叢狀型成釉細(xì)胞瘤中的腫瘤上皮內(nèi)和在腫瘤間的結(jié)締組織呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，在單囊型成釉細(xì)胞瘤中瘤體細(xì)胞的細(xì)胞核和瘤周基質(zhì)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。

圖 1 確定成釉細(xì)胞瘤的組織分型(HE， ×100)

圖 2 各組樣本中OPN的表達(dá)(SP, ×200)

濾泡型成釉細(xì)胞瘤表達(dá)陽性率為24/32(75%)，叢狀型成釉細(xì)胞瘤表達(dá)陽性率為16/20(80%)，單囊型成釉細(xì)胞瘤陽性率5/8(62.5%)。濾泡型成釉細(xì)胞瘤和叢狀型成釉細(xì)胞瘤及單囊型成釉細(xì)胞瘤的OPN的陽性表達(dá)均高于正常牙齦黏膜，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表 1)。

表 1 OPN在各組樣本中表達(dá)的比較

3 討 論

OPN富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，是首次發(fā)現(xiàn)在骨組織中的骨唾液涎蛋白，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在腎、腦、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和許多細(xì)胞上皮襯里也有表達(dá)[7]。OPN的結(jié)構(gòu)中含有豐富的天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸，它是一種酸性的分泌型磷酸化糖蛋白，有多種功能[8-9]，如促進(jìn)細(xì)胞黏附、生存、轉(zhuǎn)移和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫。研究表明[10-11]，在骨的重建、創(chuàng)傷及炎癥的修復(fù)、腫瘤的轉(zhuǎn)移和自身免疫疾病中也可檢測到OPN的高表達(dá)。另外，OPN還可通過激活信號通路來促進(jìn)腫瘤形成和干擾腫瘤的預(yù)后，甚至可導(dǎo)致腫瘤的惡變[12]。成釉細(xì)胞瘤雖是一種頜骨良性腫瘤，但其生物學(xué)行為具有局部侵襲性，術(shù)后復(fù)發(fā)率比較高。最近的研究證實(shí)[13]，OPN在致癌和癌癥的轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。此外，高表達(dá)的OPN與各種腫瘤[13-15]，如肝癌、宮頸癌、胰腺癌和前列腺癌的惡變、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)?，F(xiàn)階段，對成釉細(xì)胞瘤中OPN表達(dá)的研究較少，本文通過檢測OPN在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況，探討其在該類腫瘤發(fā)生及復(fù)發(fā)中的可能意義。

本研究結(jié)果顯示，在叢狀型，濾泡型及單囊型成釉細(xì)胞瘤中，OPN的陽性反應(yīng)主要表達(dá)在類成釉細(xì)胞和類星網(wǎng)狀層細(xì)胞的細(xì)胞核，瘤周反應(yīng)主要集中于腫瘤基質(zhì)，在成釉細(xì)胞瘤體上皮細(xì)胞的細(xì)胞核、星網(wǎng)狀層細(xì)胞和瘤周基質(zhì)中OPN的陽性表達(dá)率45/60(75%)。而在正常的牙齦上皮細(xì)胞中，OPN的表達(dá)為陰性或弱陽性，陽性表達(dá)率為1/10(10%)。Wang等[16]認(rèn)為OPN可能由星網(wǎng)狀細(xì)胞分泌和合成，通過成釉細(xì)胞樣細(xì)胞加工修飾分泌到成釉細(xì)胞瘤周基質(zhì)中參與瘤體發(fā)生發(fā)展，也不排除成釉細(xì)胞瘤樣細(xì)胞分泌少量的OPN。圖 2中OPN的陽性表達(dá)，提示在成釉細(xì)胞瘤不同區(qū)域OPN的表達(dá)也不同，細(xì)胞核陽性表達(dá)較高，該陽性表達(dá)可能提示OPN在該區(qū)域活性可能較高。表 1可見，正常牙齦黏膜中OPN的陽性表達(dá)均小于濾泡型成釉細(xì)胞瘤，叢狀型及單囊型成釉細(xì)胞瘤中OPN的陽性表達(dá)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

OPN可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲和轉(zhuǎn)移，激活破骨細(xì)胞，并且可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞抵御免疫介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)，成釉細(xì)胞瘤瘤體細(xì)胞和瘤周結(jié)締組織中的高表達(dá)的OPN至少可以部分的解釋為什么實(shí)性的成釉細(xì)胞瘤有局部侵襲行為和較高的溶骨能力[17]。研究表明[18]，在牙源性角化囊腫中的上皮襯里和結(jié)締組織中也檢測到OPN的高表達(dá)，因此我們可以猜測成釉細(xì)胞瘤中OPN的高表達(dá)有可能與該腫瘤高復(fù)發(fā)率有關(guān)。

現(xiàn)階段對于成釉細(xì)胞瘤的治療，手術(shù)仍是首選，創(chuàng)傷較大，易于復(fù)發(fā)，多次復(fù)發(fā)手術(shù)嚴(yán)重影響面容，并造成功能障礙。對患者的生活質(zhì)量有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示OPN很可能參與成釉細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程,可通過研究成釉細(xì)胞瘤的生物學(xué)行為和OPN表達(dá)之間的關(guān)系，將OPN作為成釉細(xì)胞瘤的診斷和評價(jià)預(yù)后的有效指標(biāo)。鑒于此，將OPN作為靶基因來治療成釉細(xì)胞瘤是有可能的。但OPN能否作為一個(gè)有價(jià)值的靶向治療, 在成釉細(xì)胞治療方面是否起到積極作用，仍需進(jìn)一步的研究。