基于二代測(cè)序的RhD陽(yáng)性個(gè)體RHD基因mRNA選擇性剪接分析

羅亞林，魏 玲，姬艷麗，羅廣平，付涌水，，溫機(jī)智，黎誠(chéng)耀

（1.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院輸血醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510515；2.廣州血液中心臨床輸血研究所，廣東廣州 510095）

Rh是除ABO之外最重要的血型系統(tǒng)之一，其中D 抗原是Rh 血型系統(tǒng)中免疫原性最強(qiáng)的抗原，其相應(yīng)同種抗體可引起嚴(yán)重溶血性輸血反應(yīng)和胎兒新生兒溶血病。編碼D 抗原的RHD基因由10 個(gè)外顯子組成，并與編碼RhCE 抗原的RHCE基因具有高度同源性［1］。大部分人類基因在剪接過程中能夠通過選擇性剪接產(chǎn)生多種mRNA 轉(zhuǎn)錄本，使機(jī)體在不同組織和不同環(huán)境條件中能夠利用一套固定的遺傳物質(zhì)表達(dá)出豐富的蛋白產(chǎn)物，以滿足不同的生理需求［2］。前期研究顯示，RHD基因也同樣存在選擇性剪接現(xiàn)象，這些選擇性剪接形成的轉(zhuǎn)錄本能否表達(dá)出不同C-端的RhD 蛋白，且這些序列多樣的RhD 蛋白是否有完整的D 抗原表位，迄今尚不清楚［3］。以往對(duì)RHD基因可變剪接的研究多采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）擴(kuò)增后分子克隆測(cè)序，或RT-PCR 后直接Sanger 測(cè)序的方法進(jìn)行，對(duì)于低豐度的轉(zhuǎn)錄本難以檢出，并且無法進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。本研究首先從RhD 陽(yáng)性獻(xiàn)血者的新鮮血液中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），進(jìn)行有核紅細(xì)胞（Erythroblast）的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，提取紅細(xì)胞特異性RNA，然后采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)RHD基因的cDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，以期獲得RHD基因選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本的定性和定量分析結(jié)果，并使用生物信息學(xué)方法對(duì)RHD基因選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本形成機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取D 陽(yáng)性獻(xiàn)血者3 名，分別留取新鮮EDTA 抗凝外周靜脈血10 mL。本研究經(jīng)廣州血液中心倫理委員會(huì)同意，并獲得研究對(duì)象知情同意。

1.2 前體有核紅細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)

參照我們已經(jīng)建立的從外周血中分離、培養(yǎng)并擴(kuò)增前體有核紅細(xì)胞的方法［4］。采用Ficoll 密度梯度法分離PBMC，使用包含1 ng/mL 人白介素3（Interleukin-3，IL-3，Stem Cell 公司）、2 U/mL 促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO，Stem Cell 公司）、1 μmol/L 地塞米松（Dexamethasone，Dex，Sigma 公司）、40 ng/mL 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（Insulin-like growth factor-1，IGF-1，R&D 公司）、40 μg/mL cho?lesterol-rich lipids（Sigma 公司）和100 ng/mL 干細(xì)胞因子（Stem cell factor，SCF，Stem Cell 公司）的Stem?Span SFEM 培養(yǎng)基（Stem Cell 公司）進(jìn)行篩選培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106/mL。在第5 天時(shí)使用Percoll分離液進(jìn)行密度梯度離心，以純化有核紅細(xì)胞，并改用不含IL-3 的相同濃度細(xì)胞因子（即2 U/mL EPO、1 μmol/L Dex、40 ng/mLIGF-1、40 μg/mL cho?lesterol-richlipids 和100 ng/mL SCF）的StemSpan SFEM 培養(yǎng)基對(duì)有核紅細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并將細(xì)胞濃度維持在1.5～2.0×106/mL［5］。

1.3 RNA的提取分離

采用QIA amp RNA Blood MiniKit 試劑盒（QIA?GEN GmbH，D-40724 Hilden，德國(guó)），按照試劑盒操作說明，提取有核紅細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度分裝后，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR

依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript，II 1st strand cDNA Synthesis kit，TaKaRa）操作說明，采用Oligo（dT）20 引物將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過引物設(shè)計(jì)軟件（Premer Premier 5.0）設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物，擴(kuò)增RHDmRNA的外顯子6到3’非編碼區(qū)，即正向引物位于外顯子6（引物序列：5’-TGGCTGGGCT?GATCTCCG-3’），反向引物位于3’非編碼區(qū)（引物序列：5’-TGCATAATAAATGGTGAGATTCTCCTC-3’）。隨后，用GoTaq DNA 聚合酶（Promega 公司，USA）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.5 PCR產(chǎn)物二代測(cè)序

將PCR 產(chǎn)物送至成都柯萊博生物科技有限公司，建庫(kù)后使用Illumina Novaseq 測(cè)序儀進(jìn)行二代測(cè)序。使用Hisat2-2.1.0 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果和RHD基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，測(cè)序結(jié)果采用StringTie v2.1.1 軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接以及表達(dá)量計(jì)算，使用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄和每百萬(wàn)映射讀取的轉(zhuǎn)錄本（Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads，TPM）對(duì)不同轉(zhuǎn)錄本相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行校正。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采 用MaxEntScan 軟 件（http：//hollywood.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html）對(duì)RHD基因各外顯子的5’-剪接位點(diǎn)（5’-splice site，5’ss）和3’ss 保守區(qū)域序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，計(jì)算反映5’ss和3’ss與剪接體結(jié)合力的指標(biāo)，即最大熵值，以推測(cè)不同RHD轉(zhuǎn)錄本形成的原因。根據(jù)文獻(xiàn)［6］報(bào)道，5’ss 區(qū)域包括外顯子最后3 個(gè)堿基和內(nèi)含子5’端的6個(gè)堿基，用該模型（Maximum En?tropy Model，MaxENT）計(jì)算的最理想保守序列最大熵值為11.81；3’ss 區(qū)域包括內(nèi)含子3’端的6 個(gè)堿基和外顯子的前3 個(gè)堿基，用該模型計(jì)算的最理想保守序列最大熵值為13.59。實(shí)際計(jì)算值越接近理想保守序列的最大熵值，表明在剪接時(shí)被剪接體識(shí)別且結(jié)合能力越強(qiáng)，更易被剪接。

2 結(jié)果

2.1 使用二代測(cè)序?qū)HD 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析

為了解RhD 陽(yáng)性個(gè)體紅細(xì)胞中RHD基因的各種轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況，我們將RT-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行二代測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：在RhD陽(yáng)性標(biāo)本中除了包含10 個(gè)外顯子的RHD基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本外，還檢測(cè)到了其它8 種不同的RHD基因mRNA 轉(zhuǎn)錄本（圖1）。將結(jié)果進(jìn)行校正后，每種轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)量如圖1所示。

2.2 生物信息學(xué)分析RHD 基因各外顯子5’ss 與3’ss剪接區(qū)域剪接效能

對(duì)RhD 陽(yáng)性個(gè)體各外顯子5’ss 與3’ss 剪接區(qū)域的序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，計(jì)算了10 個(gè)外顯子兩端5’ss 的9 個(gè)堿基的保守序列（包括外顯子最后3 個(gè)堿基和緊鄰內(nèi)含子的前六個(gè)堿基序列）和3’ss 的23 個(gè)堿基長(zhǎng)度的保守序列（包括內(nèi)含子的最后20 個(gè)堿基和緊鄰?fù)怙@子的前3 個(gè)堿基序列）的最大熵值（圖2），計(jì)算結(jié)果顯示RHD基因外顯子7 的5’ss 保守區(qū)域最大熵值（2.93）和外顯子2的3’ss保守區(qū)域最大熵值（2.83）明顯低于最理想保守序列最大熵值，同時(shí)外顯子7 和9 的3’ss 保守序列的最大熵值也相對(duì)較低（分別為6.98和6.15）。這些結(jié)果提示在RHD基因剪接過程中，剪接體與這幾個(gè)外顯子5’ss 剪接區(qū)域和3’ss 剪接區(qū)域的保守序列相互識(shí)別結(jié)合和結(jié)合能力下降，導(dǎo)致外顯子2、7 和9 無法被正確識(shí)別，從而出現(xiàn)RHD基因被異常剪接形成相應(yīng)外顯子缺乏的轉(zhuǎn)錄本。

圖1 三個(gè)RhD陽(yáng)性個(gè)體中檢出的不同RHD mRNA轉(zhuǎn)錄本及比例Fig.1 The expression frequencies of RHD mRNA transcripts in three RhD-positive individuals

此外，我們分析了位于IVS7+918_1087 區(qū)域（圖2）的被異常插入RHD基因mRNA 轉(zhuǎn)錄本的170 bp 片段及其周圍序列，發(fā)現(xiàn)其兩端也存在GTAG保守序列，即其可能會(huì)被識(shí)別為一個(gè)“外顯子”。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示這170 bp 片段5’ss 序列的最大熵值為6.04，高于上游緊鄰的外顯子7 的5’ss 序列的最大熵值2.93（圖2），所以在剪接過程中有可能被剪接體識(shí)別并作為一個(gè)外顯子被剪接到成熟的mRNA轉(zhuǎn)錄本中。

3 討論

本研究采用二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)RhD陽(yáng)性個(gè)體紅細(xì)胞表達(dá)的RHD基因mRNA 轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了分析，檢測(cè)到了9種不同的RHD基因mRNA 轉(zhuǎn)錄本，其中包括3 種新的低豐度表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（圖1F-H）。自從Westhoff［7］等明確鑒定了第一個(gè)RHD基因轉(zhuǎn)錄本以來，多項(xiàng)研究在RhD 陽(yáng)性個(gè)體紅細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)了6 種不同的RHDmRNA 轉(zhuǎn)錄本［3］，從臍血中提取的總RNA 中擴(kuò)增檢測(cè)到的RHDmRNA 轉(zhuǎn)錄本可高達(dá)13種，種類更加豐富［8］。以往研究在RhD陽(yáng)性個(gè)體中報(bào)道過的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目較少，這可能與這些研究采用一代Sanger 測(cè)序難以檢出低豐度轉(zhuǎn)錄本有關(guān)。本研究首次采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)RHD基因RT-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析，一次能對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)序，不但提高了檢測(cè)的靈敏度，而且可以計(jì)算出每種轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)量。雖然我們采用的測(cè)序方法較傳統(tǒng)方法在檢測(cè)水平上有了較大提高，但我們推測(cè)RhD 陽(yáng)性個(gè)體可能仍然存在其它尚未發(fā)現(xiàn)的RHDmRNA轉(zhuǎn)錄本。

本研究?jī)H擴(kuò)增了RHD基因外顯子6 到3’非編碼區(qū)的序列（即RHD基因mRNA 后半部分）并進(jìn)行了二代測(cè)序分析，而沒有對(duì)RHD基因外顯子1 至外顯子10 進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增和二代測(cè)序分析。這是由于以往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)RHD基因的可變剪接主要集中在外顯子7、外顯子8 和外顯子9［9］。此外，考慮到目前二代測(cè)序技術(shù)測(cè)序長(zhǎng)度有限，僅擴(kuò)增RHD基因mRNA 后半部分也可減少二代測(cè)序分析過程中序列拼接的次數(shù)，從而增加測(cè)序結(jié)果的可靠性。

圖2 RHD基因各外顯子5’ss端和3’ss端最大熵值計(jì)算結(jié)果示意圖Fig.2 The maximum entropy values of 5’and 3’splice sites of all exons of RHD gene

本研究中發(fā)現(xiàn)多種不同RHD基因mRNA 轉(zhuǎn)錄本，其變異形式存在外顯子缺失以及內(nèi)含子保留兩種情況，具體表現(xiàn)為外顯子7、外顯子8和外顯子9 存在不同組合的缺失，以及內(nèi)含子7 部分序列（170 bp的片段）的保留，本研究發(fā)現(xiàn)了三種包含部分內(nèi)含子7 序列（位于RHD基因IVS7+918_1087 區(qū)域）的RHD基因mRNA 轉(zhuǎn)錄本，這3 種轉(zhuǎn)錄本所占的比例均較低，其中3 種轉(zhuǎn)錄本（圖1F、G 和H）發(fā)生移碼突變，兩種轉(zhuǎn)錄本提前出現(xiàn)終止密碼子（圖1G 和H）。此外，我們進(jìn)一步對(duì)RHD基因這個(gè)內(nèi)含子7 的170 bp 片段及其周圍序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這170 bp 的序列和既往報(bào)道的DEL 個(gè)體的異常插入序列一致［10］。另外，在長(zhǎng)度為10 270 bp 的整個(gè)內(nèi)含子7中，我們關(guān)注的經(jīng)常被異常插入RHD基因mRNA 轉(zhuǎn)錄本的170 bp 片段的兩端堿基序列符合剪接位點(diǎn)的GT-AG 原則。我們采用生物信息學(xué)方法模擬計(jì)算兩端剪接序列的最大熵值，結(jié)果顯示該170 bp 片段模擬的5’ss 剪接序列的最大熵值（6.04）明顯大于RHD基因正常外顯子7 的5’ss最大熵值（2.93）。因此我們推測(cè)在RHD基因剪接過程中，與5’ss 保守序列互補(bǔ)結(jié)合的U1 SNRNP（small nuclear ribonucleoproteins）剪接體，在識(shí)別外顯子7 和內(nèi)含子7 的170 bp 片段的5’ss 保守序列時(shí)，U1 SNRNP 剪接體與內(nèi)含子7 的170 bp 片段的5’ss相似序列結(jié)合能力更強(qiáng)，可能會(huì)將這170 bp的內(nèi)含子7 序列識(shí)別為一個(gè)“外顯子”進(jìn)行剪接，從而將這170 bp 的內(nèi)含子7 序列保留在RHD基因mRNA中（圖2）。

此外，以往不同研究得到的RHD基因mRNA轉(zhuǎn)錄本種類和數(shù)量上存在一定差異（圖1），這可能是由于不同研究使用的紅細(xì)胞種類不同。由于RhD 蛋白在紅細(xì)胞中表達(dá)而不在白細(xì)胞中表達(dá)，但成熟紅細(xì)胞已經(jīng)脫核無法提取到RNA，故需要從尚未脫核的紅細(xì)胞中提取RNA 進(jìn)行RHD基因mRNA 轉(zhuǎn) 錄本 的分 析研 究。如Shao［11］等先 從新鮮全血中提取網(wǎng)織紅細(xì)胞后再抽提RNA，然后再進(jìn)行后續(xù)分析研究；許先國(guó)［8］等從臍帶血中抽取總RNA 并進(jìn)行后續(xù)分析研究。與以往研究不同，本研究中首次使用前期建立的有核紅細(xì)胞的培養(yǎng)方法，從新鮮外周血分離、培養(yǎng)并擴(kuò)增尚未脫核的有核紅細(xì)胞，然后再提取RNA 并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到的常見轉(zhuǎn)錄本也與以往報(bào)道一致。與前期研究相比，本研究使用的方法能大量獲得紅細(xì)胞總RNA，提高了檢測(cè)的靈敏度，并檢測(cè)到3 種新的含量較少的RHD基因mRNA 轉(zhuǎn)錄本，該方法也可以應(yīng)用于其他紅細(xì)胞特異性表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄分析的研究中。

為分析外顯子7和9容易發(fā)生剪接異常從而形成外顯子7 和9 缺失轉(zhuǎn)錄本的原因，我們對(duì)RHD基因所有外顯子的5’ss 和3’ss 保守區(qū)域序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。5’ss 和3’ss 剪接保守序列位于內(nèi)含子和外顯子的交界處，是在進(jìn)化過程中形成的相對(duì)保守區(qū)域，至少包括5’ss 的9 個(gè)堿基及3’ss 的23 個(gè)堿基序列，該區(qū)域中最保守的是內(nèi)含子的5’GT 和3’AG 位點(diǎn)，但也存在一定的變異。MaxENT模型可對(duì)該保守區(qū)域進(jìn)行分析，5’ss和3’ss區(qū)域最理想的保守序列的最大熵值分別為11.81 和13.59。如果一個(gè)基因某個(gè)外顯子剪接序列的數(shù)值越接近最大值，即表明其序列為一個(gè)真正的剪接位點(diǎn)幾率越大，更易被剪接體識(shí)別而發(fā)生剪接。分析結(jié)果顯示外顯子7 的5’ss 序列最大熵值相對(duì)于其他外顯子較低，即外顯子7 的5’ss 序列在剪接起始階段與U1 snRNP 剪接體的相互結(jié)合能力可能出現(xiàn)顯著下降，導(dǎo)致其不易被U1 snRNP 剪接體識(shí)別并結(jié)合，從而發(fā)生異常剪接。此外，外顯子9 的5’ss 序列最大熵值正常，僅存在3’ss 序列最大熵值中度下降的情況，外顯子9 異常剪接是否由3’ss 與其互補(bǔ)結(jié)合的U2 snRNP 剪接體結(jié)合減弱相關(guān)，還需要進(jìn)一步的研究。

總之，RHD基因存在十分復(fù)雜的選擇性剪接模式，使RhD 陽(yáng)性個(gè)體的RHD基因在mRNA 水平上存在多種不同的剪接轉(zhuǎn)錄本。本研究首次采用二代測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)到RhD 陽(yáng)性個(gè)體紅細(xì)胞9 種不同的RHD基因mRNA 轉(zhuǎn)錄本，其中包括三種新的低豐度轉(zhuǎn)錄本，從而為進(jìn)一步了解RhD 蛋白的抗原表位及其在臨床同種免疫中的意義奠定了基礎(chǔ)，亦將為探討剪接異常所致RhD 變異型的分子機(jī)制研究提供幫助。這些不同的RHD基因轉(zhuǎn)錄本的形成機(jī)制以及其能否翻譯出含正常D 抗原表位的RhD 蛋白，目前尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。