PTBP1介導(dǎo)長鏈非編碼RNA RP11-879F14.2發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用

楊 瑩，郭 晶，溫藝紅，黃宇晴，易芷瑤，朱杰寧，方咸宏，單志新，，，4

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006；2.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；3.廣東省臨床藥理學(xué)重點實驗室//廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州 510080；4.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510280）

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是心肌組織中細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積并伴有膠原蛋白比例或膠原成分發(fā)生變化，引起心的硬度增加，彈性下降，順應(yīng)性發(fā)生改變，心輸出量與供血能力受到嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致心肌功能障礙直至心衰的發(fā)生［1-2］。盡管目前所用的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻滯劑等抗纖維化藥物可延緩心肌纖維化的進(jìn)展，但并不能從根本上預(yù)防和治療此類疾病，因此，研究并闡明心肌纖維化發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的干預(yù)靶點對于心肌纖維化的治療具有非常重要的意義［3］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類核苷酸長度大于200 nt 并且缺乏蛋白質(zhì)編碼功能的轉(zhuǎn)錄本，與編碼蛋白的mRNA 相比，lncRNA 同樣由RNA 聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄而來，多數(shù)具有5’帽子和3’端多聚尾，但其物種間的保守序列小于10%，表達(dá)豐度不高，具有較強(qiáng)的組織和細(xì)胞特異性［4-6］。研究發(fā)現(xiàn)，ln?cRNAs可作為“分子信號”、“支架”和“誘餌”等與不同分子結(jié)合，在表觀調(diào)控、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個層面參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)［7-8］。研究顯示ln?cRNAs與心力衰竭的發(fā)生密不可分，并且參與心肌纖維化的發(fā)生過程［9-10］，深入探究lncRNAs 調(diào)節(jié)心肌纖維化的作用機(jī)制，對于心肌纖維化的治療研究有重要意義。本文中，我們通過分析心衰患者與健康人心肌組織的lncRNA 表達(dá)譜，選取在心衰患者心肌中表達(dá)顯著增加的lncRNA RP11-879F14.2，并探討其調(diào)控心肌纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

利用心衰病人和健康器官捐獻(xiàn)者的心肌組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA 表達(dá)譜分析和RP11-879F14.2 表達(dá)的定量PCR 檢測。心衰病人和健康器官捐獻(xiàn)者均知情同意，基本資料見表1。利用房顫（atrial fibrilla?tion，AF）病人（持續(xù)出現(xiàn)房顫的時間不低于1 年）、竇性心律（sinus rhythm，SR）病人左心耳切除術(shù)后廢棄的新鮮心耳組織及無心源性疾病的器官捐獻(xiàn)者的新鮮心耳組織進(jìn)行心房肌成纖維細(xì)胞的分離。

本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)【批準(zhǔn)號No.GDREC2019238H（R1）】，手術(shù)標(biāo)本來源：廣東省心血管病研究所。

1.2 主要試劑

Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoR I、PacI 和PmeI（NEB）；BJ5183E.Coli、載體pAd-Track-cmv vector和pAd-EasyⅠ（Colon cancer）；DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基、特級澳洲胎牛血清、2.5 g/L EDTA-胰蛋白酶（Gibco）；100×青-鏈霉素混合抗生素（solarbio）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、核質(zhì)分離試劑盒和TRIzol 試劑（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green Mix、4×SDS loading buffer 和RNase free water（TaKaRa）；si-PTBP1（廣州銳博）；SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒（碧云天）；GAPDH 抗體、COL1A1抗體、COL3A1 抗體（Protein Technology）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（Ab?cam）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo）；蛋白Marker（Fermentas）；ECL 發(fā) 光 液（Millipore）；PVDF 膜（Whatman）；血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Sigma）。其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由Invitrogen公司合成，具體序列見表2。

表1 患者臨床資料Table 1 Clinical characteristics of the patients with heart failure and healthy organ donors

1.3 主要方法

1.3.1 Masson三色染色 剪取臨床外科手術(shù)廢棄的新鮮心耳組織，用40 g/L 多聚甲醛固定過夜后，逐步脫水、透明、浸蠟、包埋后制作4 μm 厚度的連續(xù)石蠟切片，用Masson 三色染色試劑盒逐步染色膠原纖維，觀察心肌組織的膠原纖維沉積情況，選擇八個單獨的視野（放大倍數(shù)=原始×400）計算心肌膠原纖維所占比例（CVF），CVF=膠原區(qū)域/總面積。

表2 PCR引物序列Table 2 The sequences of the primers for RT-qPCR

1.3.2 LncRNAs 表達(dá)譜芯片分析 取各5 份心衰病人和健康捐獻(xiàn)者的心肌組織進(jìn)行l(wèi)ncRNAs 表達(dá)譜分析，由上?？党晒緟f(xié)助完成芯片的雜交和結(jié)果分析。主要實驗步驟：利用TRIzol試劑提取人心肌組織總RNA，用隨機(jī)引物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增后與lncRNAs 表達(dá)譜芯片（Arraystar human lncRNA Ar?ray）上的寡核苷酸cRNA 探針（Arraystar Super RNA labeling kit）進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交后經(jīng)Agilent Scan?ner G2505 掃描并上傳數(shù)據(jù)，最后由Feature Extrac?tion Software進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析。

1.3.3 人心房肌成纖維細(xì)胞（HAFs）的分離、培養(yǎng)和處理 參考我們已報道方法［11］，用冷PBS清洗左心耳，只剪取近心房組織，去除淤血。用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化法分離心房肌成纖維細(xì)胞。離心棄上清，沉淀用完全培養(yǎng)液（含100 mL/L 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)液）重懸，接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后，更換一次完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞密度達(dá)90%時，消化傳代。本實驗使用的HAFs 為P3-P5。分別將重組腺病毒rAd-lncRNA RP11-879F14.2、rAd-PTBP1感染HAFs，以rAd-GFP（MOI=10）作為對照，感染后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用lipofectamine2000 試劑將100 nmol/L si-NC 陰性對照，si-PTBP1 分別轉(zhuǎn)染至HAFs 中，并在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)測定。

1.3.4 lncRNA RP11-879F14.2 和PTBP1 重 組 腺 病毒的制備 根據(jù)我們報道的方法［12］，分別將RP11-879F14.2 和PTBP1 的模板DNA 定向克隆到pAd-Track-cmv 載體上。然后，將pAd-Track-RP11-879F14.2、pAd-Track-PTBP1 分別 轉(zhuǎn) 化入含pAd-Easy-I 骨架質(zhì)粒BJ5183 的化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌中進(jìn)行同源重組。接著，將RP11-879F14.2、PTBP1的重組腺病毒質(zhì)粒用限制酶PacI 線性化，并轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝和擴(kuò)增。同時，制備rAd-GFP作為對照空載腺病毒。

1.3.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?參照已報道方法［11］構(gòu)建包含RP11-879F14.2 的重組螢光素酶報告質(zhì)粒pGL3-RP11-879F14.2（基于pGl3-promoter載體）。利用人心肌AC16細(xì)胞，將AC16細(xì)胞（細(xì)胞密度約為1×105/每孔12 孔板）轉(zhuǎn)染1.0 μg 重組熒光素酶報告質(zhì)粒，500 ng pAd-Track-PTBP1 以及1 ng pRL-TK（表達(dá)海腎熒光素酶的內(nèi)參照質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染24 h 后，測定螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)L）及海腎熒光素酶（renilla luciferase，RL）強(qiáng)度，兩種熒光強(qiáng)度比值（FL/RL）變化可反映RP11-879F14.2與PTBP1間的結(jié)合能力。

1.3.6 實時定量PCR（RT-qPCR） 采用TRIzol 法提取總RNA 后，定量1.0 μg，用Oligo（dT）15和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。以Gapdh 作為內(nèi)部參照，用相應(yīng)的引物檢測RP11-879F14.2、PTBP1 及纖維化相關(guān)基因的RNA 表達(dá)水平。在vii A7 Quantitative PCR System（美國Applied Biosystems）進(jìn)行PCR 反應(yīng)，以2-ΔΔCt法計算RP11-879F14.2 及纖維化相關(guān)基因的相對表達(dá)水平。

1.3.7 蛋白免疫印跡法（Western blot） 在處理后的HAFs 中，加入RIPA 蛋白裂解液，冰上裂解后收集細(xì)胞，超聲后于4 ℃10 000×g轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清測定濃度后，進(jìn)行蛋白定量分裝。加入4×SDS loading buffer，99 ℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。完成PVDF 膜轉(zhuǎn)印蛋白后，加入5%脫脂牛奶至完全覆蓋PVDF膜，封閉1 h，分別用相應(yīng)的一抗anti-COL1A1（1∶1 000）、anti-COL3A1（1∶5 000）、anti-α-SMA（1∶5 000）、anti-PTBP1（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光試劑盒曝光顯影，以GAPDH（1∶5 000）為內(nèi)參照，Image J掃描灰度值并分析蛋白表達(dá)相對含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組計量資料的均數(shù)比較，如果每一組資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性，組間比較采用t檢驗，反之用校正t檢驗或秩和檢驗；多組均數(shù)比較，各組定量資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性采用One way-ANOVA 進(jìn)行分析，并用Bonferroni 校正的t檢驗進(jìn)行組間兩兩比較，反之用Kruskal Wal?lisH檢驗。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA RP11-879F14.2 在心衰患者心肌中表達(dá)增加

Masson 染色結(jié)果表明，與健康對照組相比，心衰患者心肌微血管周圍和細(xì)胞間質(zhì)的膠原沉積明顯，發(fā)生顯著的心肌纖維化（圖1A）。LncRNA 表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，心衰患者心肌的lncRNAs 表達(dá)譜發(fā)生改變，分別有230和262個lncRNAs呈2倍以上的表達(dá)上調(diào)和下調(diào)，其中l(wèi)ncRNA RP11-879F14.2在心衰心肌中升高表達(dá)2.81 倍（圖1B）。RT-qPCR結(jié)果證實，與健康對照組相比，RP11-879F14.2 在心衰患者心肌組織中表達(dá)顯著增加（P＜0.01；圖1C）。

2.2 lncRNA RP11-879F14.2 富集于HAFs 的細(xì)胞核中

RT-qPCR 結(jié)果顯示，在20 μmol/L Ang-Ⅱ處理的HAFs中RP11-879F14.2表達(dá)顯著增加（P＜0.01；圖2A）。核質(zhì)RNA組分分離和RT-qPCR結(jié)果顯示，在Ang-Ⅱ處理前后的HAFs 中，RP11-879F14.2 均主要分布在細(xì)胞核中（圖2B、C）。

2.3 lncRNA RP11-879F14.2 抑制HAFs 中纖 維化相關(guān)基因表達(dá)

為進(jìn)一步探究RP11-879F14.2 對HAFs 纖維化表型的影響，我們利用重組腺病毒rAd-RP11-879F14.2 在HAFs 過表達(dá)RP11-879F14.2，進(jìn)而檢測纖維化相關(guān)基因（Col1a1、Col3a1、Acta2）的表達(dá)。rAd-RP11-879F14.2 共表達(dá)的綠色熒光蛋白（GFP）顯示rAd-RP11-879F14.2 已充分感染HAFs（圖3A）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，腺病毒可充分介導(dǎo)RP11-879 F14.2 在HAFs 中過表達(dá)，同時引起HAFs 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)顯著降低（圖3B）。Western blot 結(jié)果顯示，過表達(dá)RP11-879F14.2 的HAFs 中Col1a1、Col3a1 和α-SMA 的表達(dá)顯著降低（圖3C）。

圖1 lncRNA RP11-879F14.2在心衰病人心肌中表達(dá)增強(qiáng)Fig.1 Upregulation of lncRNA RP11-879F14.2 in the myocardium of patients with heart failure

圖2 lncRNA RP11-879F14.2在HAFs中的核質(zhì)分布情況Fig.2 Cellular distribution of lncRNA RP11-879F14.2 in the cytoplasm and nucleus of HAFs

圖3 LncRNA RP11-879F14.2抑制HAFs中纖維化相關(guān)基因表達(dá)Fig.3 LncRNA RP11-879F14.2 inhibits fibrosis-related genes expression in HAFs

2.4 PTBP1 介 導(dǎo)lncRNA RP11-879F14.2 抑 制HAFs中纖維化相關(guān)基因表達(dá)

序列分析結(jié)果（http：//service.tartaglialab.com/page/catrapid_omics_group）提示，RP11-879F14.2 與PTBP1蛋白間存在結(jié)合作用，我們通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果證實，與PTBP1蛋白的結(jié)合可降低AC16 細(xì)胞中RP11-879F14.2 的穩(wěn)定性（圖4A）。Western blot結(jié)果顯示，腺病毒介導(dǎo)有效表達(dá)RP11-879F14.2的HAFs中，PTBP1蛋白表達(dá)顯著增加（圖4B）。沉默HAFs中PTBP1表達(dá)，可顯著逆轉(zhuǎn)RP11-879F14.2抑制HAFs中纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用（圖4C）。

3 討論

心肌纖維化是引發(fā)心力衰竭的主要原因，其特征主要為成纖維細(xì)胞增殖，并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過度沉積，該過程可引起心臟室壁順應(yīng)性降低，舒縮功能減弱以及心臟傳導(dǎo)異常等，最終導(dǎo)致心功能不全，進(jìn)而引起心衰［13］。本文基于lncRNA 表達(dá)譜芯片和RT-qPCR 結(jié)果，證實RP11-879F14.2 在心衰患者心肌和AngII 誘導(dǎo)的HAFs 中表達(dá)均增強(qiáng)；功能研究發(fā)現(xiàn)在HAFs 中過表達(dá)RP11-879F14.2 可以顯著抑制HAFs 中纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而證實心衰時心肌中高表達(dá)的RP11-879F14.2具有抑制心肌纖維化的作用。

圖4 PTBP1介導(dǎo)LncRNA RP11-879F14.2抑制HAFs中纖維化相關(guān)基因表達(dá)Fig.4 Participation of PTBP1 in attenuation of fibrosis-related genes expression by lncRNA RP11-879F14.2 in HAFs

研究表明，lncRNA 在心臟發(fā)育以及多種心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，可能成為多種心血管疾病提供治療靶點。如慢性壓力超負(fù)荷后的小鼠心肌成纖維細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 母系表達(dá)基因3（mater?nally expressed gene3，Meg3）表達(dá)上調(diào)，沉默Meg3可降低p53 與基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metallo?peptidase 2，Mmp-2）啟動子區(qū)域的相互作用，防止心肌Mmp-2 的誘導(dǎo)產(chǎn)生，促進(jìn)心臟纖維化和壓力超負(fù)荷后舒張功能受損［14］。在心肌梗死小鼠中促纖維化lncRNA PFL 可以通過內(nèi)源性競爭吸附mi?croRNA let-7d，解除let-7d 對血小板活化因子受體的抑制作用，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞生成［15-16］。為了探究RP11-879F14.2 抑制心肌纖維化的可能機(jī)制，通過核/質(zhì)RNA 分離和RT-qPCR 檢測，證實RP11-879F14.2 主要位于心肌細(xì)胞核中。鑒于核內(nèi)ln?cRNA 一般通過RNA 結(jié)合蛋白來發(fā)揮生物學(xué)作用［17］，本文根據(jù)生物信息學(xué)分析（http：//service.tart?aglialab.com/page/catrapid_omics_group）結(jié)果，利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬龛b定RP11-879F14.2與PTBP1 間可能的結(jié)合作用。我們利用pGl3-pro?moter 載體，將RP11-879F14.2 序列插入到螢火蟲熒光素酶基因的3’端，證實增加PTBP1 表達(dá)后螢火蟲熒光素酶基因表達(dá)降低，提示PTBP1與RP11-879F14.2間發(fā)生結(jié)合作用，進(jìn)而降低螢火蟲熒光素酶基因轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和表達(dá)。在后續(xù)研究中我們將通過RNA pull-down 和序列突變實驗進(jìn)一步明確RP11-879F14.2與PTBP1間的結(jié)合作用。

PTBP1屬于核糖核蛋白家族，為基因表達(dá)過程中主要的剪接因子，該蛋白主要位于細(xì)胞核中，作為一種穿梭蛋白，PTBP1 可通過影響mRNA 剪接翻譯等過程參與調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)程［18］，研究發(fā)現(xiàn)PTBP1 與細(xì)胞發(fā)育及癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［19-21］。LncRNA Meg3 可通過招募PTBP1蛋白促進(jìn)shp mRNA 的降解，進(jìn)而誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷［22］。而在成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞過程中，PTBP1 會出現(xiàn)下調(diào)，表明PTBP1 為成纖維細(xì)胞獲得心肌細(xì)胞特異性的剪接模式的一種關(guān)鍵的阻礙物［23］。

本文中，我們證實RP11-879F14.2 可與PTBP1相互作用，并可上調(diào)PTBP1 表達(dá)，而沉默PTBP1 可促進(jìn)HAFs 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)RP11-879F14.2 抑制纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用，提示PTBP1 可介導(dǎo)RP11-879F14.2 發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用。我們推測RP11-879F14.2 可能作為“支架”通過招募PTBP1而促進(jìn)PTBP1調(diào)控與纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實。

綜上，本文證實RP11-879F14.2 在心衰患者心肌中表達(dá)增強(qiáng)，通過結(jié)合PTBP1 發(fā)揮抑制HAFs 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用。在后續(xù)研究中，我們將繼續(xù)探明RP11-879F14.2 與PTBP1 的結(jié)合作用及對其下游基因的調(diào)控作用，并在整體動物水平上進(jìn)一步闡明PTBP1 介導(dǎo)RP11-879F14.2 抑制心肌纖維化的作用機(jī)制。