不同益生菌發(fā)酵玉米須產(chǎn)物對(duì)體內(nèi)外降糖作用的影響

李敏 劉暢

摘 要：目的：研究不同益生菌發(fā)酵玉米須的產(chǎn)物對(duì)小鼠體內(nèi)降糖的影響和藥物體外降糖的影響。方法：小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，將小鼠分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、玉米須水煎液組、釀酒酵母菌發(fā)酵液組、枯草芽孢桿菌發(fā)酵液組和乳酸桿菌發(fā)酵液組，灌胃14d，測(cè)定小鼠的血糖并進(jìn)行藥物體外降糖試驗(yàn)。結(jié)果：成功建立糖尿病小鼠模型（P<0.01），乳酸桿菌發(fā)酵液對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠的體內(nèi)外降糖效果較好（P<0.01）。結(jié)論：乳酸桿菌發(fā)酵液對(duì)糖尿病小鼠具有良好的體內(nèi)外降血糖作用。

關(guān)鍵詞：玉米須;STZ;Ⅱ型糖尿病

中圖分類號(hào) TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2021）02-0016-03

Effects of Different Probiotics Fermented Corn Whisker Products on in Vivo and in Vitro Hypoglycemic

LI Min et al.

（College of Bioengineering， Daqing Normal University， Daqing163712， China）

Abstract：Objective： To study the hypoglycemic effects of different probiotics fermented corn whiskers on mice and drugs in vitro. Methods： chain urea with rhzomorph （STZ） mice celiac injection Ⅱ diabetes mice model was established， and divided the mice into stigma of water decoction groups， groups of brewing yeast fermented liquid， bacillus subtilis fermented liquid， lactobacillus fermented liquid group， model group， positive control group and blank control group 2 weeks to fill the stomach， the determination of blood glucose in mice and in vitro hypoglycemic drug experiments. Results： successfully established diabetic model mice （P<0.01）， lactobacillus fermented liquid in mice with diabetes type Ⅱ hypoglycemic effect is better in vivo and in vitro （P<0.01）. Conclusion： Lactobacillus fermentation broth has good hypoglycemic effect in vivo and in vitro in diabetic mice.

Key words： Corn whisker; STZ; Ⅱ diabetes

糖尿病是人體葡萄糖的代謝紊亂造成的，主要臨床特點(diǎn)是長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)。其中，Ⅱ型糖尿病更為常見(jiàn)，占所有糖尿病病例的75%～85%[1]。目前，臨床上使用的降糖藥物種類繁多，且大多為西藥，長(zhǎng)期服用難免產(chǎn)生很多不良反應(yīng)。因此，從中藥里開(kāi)發(fā)一種安全有效、價(jià)格低廉的降糖中藥得到了廣大學(xué)者的關(guān)注。

玉米須是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，是《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥材標(biāo)準(zhǔn)》收錄的常見(jiàn)藥材品種之一，最早藥用記載于《滇南本草》[2]。其味甘、性平，歸腎、肝、膽經(jīng)，有利膽止血之效?，F(xiàn)代藥理研究表明，玉米須具有明顯的降血糖作用。發(fā)酵中藥是指微生物對(duì)中藥進(jìn)行預(yù)消化、分解和轉(zhuǎn)化，把大分子的中間物質(zhì)，分解轉(zhuǎn)化成為能夠被直接吸收的有效小分子物質(zhì)的中藥炮制方法[3]。中藥經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理，有效成分提取率提高、藥效增強(qiáng)，可以減少中藥使用量。另外，中藥渣能提供微生物生長(zhǎng)繁殖所需的碳源、氮源等，可作為培養(yǎng)基用來(lái)培養(yǎng)微生物[4]。有研究者采用微生物發(fā)酵玉米須，來(lái)獲取玉米須中的有效成分。

酵母屬于簡(jiǎn)單的單細(xì)胞真核生物，易于培養(yǎng)，且生長(zhǎng)迅速，被廣泛用于現(xiàn)代生物學(xué)[5]?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌屬的一種，在消化道中與動(dòng)物體（人體）內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用幫助消化，消化道益生菌[6]。乳酸桿菌是指能使糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌，在食品、飲品和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，其存在廣泛嗜酸性，生存最適pH為5.5～6.0。當(dāng)然，在pH為3.0～4.5的環(huán)境中仍然能生存，它在無(wú)芽孢桿菌中是耐酸力最強(qiáng)的[7]。

本研究將把發(fā)酵中藥技術(shù)與傳統(tǒng)中藥玉米須相結(jié)合，以玉米須作為試驗(yàn)材料，用酵母菌、枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌3株益生菌分別發(fā)酵玉米須，然后觀察發(fā)酵后的玉米須產(chǎn)物對(duì)高血糖小鼠血糖的影響，對(duì)比發(fā)酵前后玉米須和不同菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)模型小鼠的降血糖作用及發(fā)酵產(chǎn)物的體外降糖作用，為中藥治療糖尿病提供新的思路和依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小白鼠70只，雄性，體重18～20g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。

1.2 儀器 BSM-120.4卓精電子分析天平（北京中金凱技術(shù)有限公司）;UV1700紫外分光光度計(jì)（杭州微米派科技有限公司）;PDZ5-2100離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;1mL注射器（北京索萊寶科技有限公司）;HGM-114血糖儀（歐姆龍健康醫(yī)療中國(guó)有限公司）。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma公司）;75%乙醇（德州眾祥工貿(mào)有限公司）;鹽酸二甲雙胍片（上海醫(yī)藥有限公司）;α-淀粉酶（Sigma公司）;α-葡萄糖苷酶（Sigma公司）;4-硝基苯基-B-D-吡喃葡萄苷（PNPG）（Sigma公司）;阿卡波糖（Sigma公司）。

1.4 藥品 玉米須（選用大慶本地的玉米須，烘干磨成粉末，過(guò)80目篩;用釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌3株益生菌分別發(fā)酵玉米須水煎液（10%），低溫離心得到發(fā)酵產(chǎn)物液。

2 試驗(yàn)方法

2.1 分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法把70只小鼠分成空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、玉米須水煎組、釀酒酵母菌發(fā)酵組、枯草芽孢桿菌發(fā)酵組和乳酸桿菌發(fā)酵組，每組10只小鼠。

2.2 造模 空白對(duì)照組：生存在正常環(huán)境下，正常飼養(yǎng);模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、玉米須水煎組、釀酒酵母菌發(fā)酵組、枯草芽孢桿菌發(fā)酵組和乳酸桿菌發(fā)酵組，用STZ（334mg·kg-1）腹腔注射進(jìn)行造模，72h后檢測(cè)血清葡萄糖水平。

2.3 給藥 空白對(duì)照組和模型組：生存在正常環(huán)境下，正常飼養(yǎng);陽(yáng)性對(duì)照組：灌胃給藥（鹽酸二甲雙胍片）鹽酸二甲雙胍片（30g/kg）1次/d;玉米須水煎組：灌胃給藥（玉米須水煎液5mL）1次/d;釀酒酵母菌發(fā)酵組：灌胃給藥（釀酒酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物5mL）1次/d;枯草芽孢桿菌發(fā)酵組：灌胃給藥（枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物5mL）1次/d;乳酸桿菌發(fā)酵組：灌胃給藥（乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物5mL）1次/d，連續(xù)14d。

2.4 測(cè)定指標(biāo)

2.4.1 血糖值 測(cè)定小鼠的血糖指標(biāo)：空腹血糖（FBG）測(cè)定于給藥前，給藥第3天、第7天、14天測(cè)空腹血糖，測(cè)空腹血糖當(dāng)天禁食2h;給藥，繼續(xù)禁食lh后，剪尾取全血10?L，用血糖儀測(cè)定并記錄。

2.4.2 對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力 取3株益生菌的發(fā)酵液1mL，加0.1mol/L的PBS溶液0.94mL（pH=6.8），再加10mol/L PNPG 40μL，混勻，于37℃反應(yīng)10min。再加0.28U/L α-葡萄糖苷酶20μL，37℃反應(yīng)30min。繼續(xù)加入1mol/L Na2CO3 溶液1.5mL終止反應(yīng)，混勻后405nm處測(cè)吸光度，并計(jì)算抑制率，同時(shí)做空白。空白管只用于調(diào)零，不參與計(jì)算。以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。背景對(duì)照不加酶液，加入等量的PBS溶液?？瞻讓?duì)照為不加樣品，加入等量PBS溶液的反應(yīng)管，其他與樣品管操作相同。

2.4.3 對(duì)α-淀粉酶活性的抑制能力 取2U/mLα-淀粉酶50μL和等體積的3株益生菌的發(fā)酵液，37℃反應(yīng)10min，加1%可溶性淀粉1mL，37℃反應(yīng)5min，再加1mLDNS試劑，沸水浴5min，迅速冷卻后用蒸餾水稀釋至2.5倍，照分光光度計(jì)，在540nm處測(cè)吸光值，計(jì)算抑制率，同時(shí)作空白，空白管只用于調(diào)零，不參與計(jì)算。以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。背景對(duì)照不加酶液，加入等量的蒸餾水?？瞻讓?duì)照為不加樣品，加等量蒸餾水的反應(yīng)管，其他與樣品管操作相同。

2.5 Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立 腹腔注射STZ（334mg·kg-1），72h后，與正常小鼠對(duì)比，模型組小鼠體重顯著降低、空腹血糖顯著升高（P<0.01）（見(jiàn)圖1），表現(xiàn)出“三多一少”癥狀典型，說(shuō)明糖尿病小鼠模型構(gòu)建成功。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同益生菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖的影響 由表2可知，4玉米須水煎液組、5釀酒酵母組、6枯草芽孢桿菌組、7乳酸桿菌發(fā)組具有降低糖尿病小鼠空腹血糖的作用，其中釀酒酵母發(fā)酵液和乳酸桿菌發(fā)酵液的作用明顯。與陽(yáng)性對(duì)照組的降糖作用對(duì)比結(jié)果表明，乳酸桿菌發(fā)酵液的降糖作用更為明顯（P<0.01），說(shuō)明乳酸發(fā)酵液的降血糖作用更為明顯。

3.2 不同益生菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)酶活性抑制能力的影響 通過(guò)體外α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶模型對(duì)3株益生菌發(fā)酵玉米須的產(chǎn)物進(jìn)行活性篩選，結(jié)果顯示，乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出一定的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性較好，其α-葡萄糖苷酶IC50為6.8±6.2μmol/L（P<0.05），α-淀粉酶IC50為6.5±6.1μmol/L（P<0.05），阿卡波糖為α-葡萄糖苷酶陽(yáng)性對(duì)照IC50為（285.63±8.66）μmol/L，阿卡波糖為α-葡萄糖苷酶陽(yáng)性對(duì)照IC50為（280.63±6.66）μmol/L。

4 結(jié)論與討論

近年來(lái)，降血糖中藥已取得了一定的研究進(jìn)展，但因其起藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理不明確，在毒理學(xué)上也缺乏相關(guān)研究，使得研究進(jìn)展較為緩慢。JianyouGuo等[8]研究發(fā)現(xiàn)，玉米須水提物可作為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)素供應(yīng)，明顯降低小鼠的高血糖。其血糖代謝的作用是通過(guò)提高胰島素水平以及恢復(fù)損傷胰島-β細(xì)胞來(lái)達(dá)成，作用原理可能為玉米須水提物幫助胰島素從未受損的胰腺-β細(xì)胞釋放。Martin等[9]研究發(fā)現(xiàn)，玉米須水提物能夠顯著降低實(shí)驗(yàn)狗的血壓，阻止膽固醇在肝臟合成。類似的研究結(jié)果在國(guó)內(nèi)報(bào)道，玉米須水提取物能有效保護(hù)肝臟和腎臟，延緩肝細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞變性，能夠改善Ⅱ型糖尿病大鼠糖脂代謝，減輕Ⅱ型糖尿病糖脂毒性對(duì)其胰腺、心臟、肝臟及腎臟的損害，進(jìn)而延緩并發(fā)癥進(jìn)展[10]，其Ⅱ型糖尿病發(fā)病的基本環(huán)節(jié)為胰島素抵抗和胰島-β細(xì)胞功能異常。其機(jī)制可能為1個(gè)多靶點(diǎn)，多途徑的過(guò)程，且有研究表明主要的降糖活性部位為總皂苷[11]，表明玉米須水提取物作為降血糖降血脂食物或藥物具有一定潛力。但是玉米須水提物中活性成分復(fù)雜，成分間的協(xié)同或拮抗作用有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)探究了不同益生菌發(fā)酵玉米須產(chǎn)物對(duì)小鼠降血糖的作用，其中乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的降血糖作用明顯。在試驗(yàn)結(jié)果中，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的血糖未完全降低到正常值，其可能的原因是給藥的時(shí)間不夠，降血糖效果還未表現(xiàn)出來(lái)。同時(shí)，在體外降糖作用，乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的效果較好。

綜上所述，乳酸桿菌發(fā)酵玉米須水煎液對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠具有較好的降血糖作用，對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制作用較好，是具有降血糖的依據(jù)。今后還應(yīng)深入探討乳酸桿菌發(fā)酵液的降血糖機(jī)理，進(jìn)一步研究發(fā)酵液中的成分，闡明乳酸桿菌發(fā)酵液對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)作用。

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（責(zé)編：張宏民）