基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的補(bǔ)中益氣丸抗疲勞機(jī)制研究

劉心悅 崔潔 賀超 王文全

摘要 目的：探討補(bǔ)中益氣丸發(fā)揮抗疲勞作用的主要活性成分和潛在的機(jī)制。方法：通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）篩選補(bǔ)中益氣丸中的活性成分，利用Swiss Target Prediction、Drugbank、Cytoscape 3.7.1、R語(yǔ)言等數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件預(yù)測(cè)活性成分作用靶點(diǎn)和“疲勞”相關(guān)靶點(diǎn)、構(gòu)建疾病-藥物-有效成分-靶基因的互作網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行關(guān)鍵靶基因的基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析，最后通過(guò)設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究補(bǔ)中益氣丸的抗疲勞藥效。結(jié)果：分析表明與補(bǔ)中益氣丸抗疲勞相關(guān)的163個(gè)潛在活性成分作用于與疲勞相關(guān)的108個(gè)靶點(diǎn)和160條通路。進(jìn)一步網(wǎng)絡(luò)特征分析發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)主要活性成分為黃酮類和甾醇類化合物，通過(guò)參與脂多糖應(yīng)答、對(duì)原細(xì)菌分子的反應(yīng)等生物過(guò)程，調(diào)控MAPK、PI3K-AKT、TNF等信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮抗疲勞作用。藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果提示補(bǔ)中益氣丸可顯著增強(qiáng)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力，但無(wú)顯著緩解體力疲勞的效果。結(jié)論：補(bǔ)中益氣丸具有多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的抗疲勞特點(diǎn)，其活性成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)蛋白，調(diào)控多個(gè)生物過(guò)程及信號(hào)通路，起到改善機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞功能等作用，但在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝方面未有明顯的富集效果及藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果。本研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)抗疲勞功能產(chǎn)品及藥品和臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)，為探究補(bǔ)中益氣丸抗疲勞作用機(jī)制提供新思路。

關(guān)鍵詞 補(bǔ)中益氣丸;抗疲勞;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)制

Mechanism of Anti-fatigue of Buzhong Yiqi Pills Based on Network Pharmacology

LIU Xinyue1，CUI Jie1，HE Chao1，WANG Wenquan 1，2，3

（1 Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China; 2 School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China; 3 Engineering Research Center of Good Agricultural Practice for Chinese Crude Drugs，Ministry of Education，Beijing 100102，China）

Abstract Objective：To explore the main active components and potential mechanism of Buzhong Yiqi Pills in anti-fatigue.Methods：The potential active components in Buzhong Yiqi Pills were screened according to TCMSP database.Swiss target Prediction，drugbank，Cytoscape 3.7.1，R language and other databases and softwares were used to predict the target of active ingredients and fatigue related targets，to construct the interaction network of disease-drug-active-ingredients target genes and PPI network of protein interaction，and to carry out enrichment analysis of GO and KEGG of key target genes.Finally，animal experiments were designed to explore the anti-fatigue effect of Buzhong Yiqi Pills.Results：The results showed that 163 potential active components related to Buzhong Yiqi Pills could act on 108 targets and 160 pathways related to fatigue.Further analysis of the network characteristics showed that the main active components were flavonoids and sterols，which regulated MAPK，PI3K AKT，TNF and other signaling pathways through participating in lipopolysaccharide response，the reaction of source bacterial molecules and other biological processes，thus playing an anti-fatigue role.The results of pharmacodynamics test showed that Buzhong Yiqi Pills could significantly enhance the exercise endurance of mice，but had no significant effect on relieving physical fatigue.Conclusion：Buzhong Yiqi Pills gets the anti-fatigue characteristics of multi-component，multi-target and multi-channel.Its active components can regulate multiple biological processes and signal pathways by interacting with multiple target proteins，which can improve the body′s oxidative stress response and regulate cell function.However，it has no obvious enrichment effect and pharmacodynamic results in regulating the body′s energy metabolism.This study provides theoretical guidance for the further development of anti-fatigue functional products and drugs and clinical application，and provides new ideas for exploring the anti-fatigue mechanism of Buzhong Yiqi Pills.

Keywords Buzhong Yiqi Pills; Anti-fatigue; Network pharmacology; Mechanism of action

中圖分類號(hào)：R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.008

疲勞是一種涉及多重復(fù)雜因素的主觀意識(shí)，按照屬性可分為生理性疲勞和病理性疲勞，前者通常發(fā)生在強(qiáng)烈的體力勞動(dòng)之后，往往是一個(gè)機(jī)體自我保護(hù)信號(hào)，建議身體休息。而后者癥狀不會(huì)隨著休息而緩解，如癌因性疲勞、免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的病毒感染性疲勞、慢性和精神疾病如多發(fā)性硬化癥、肺結(jié)核、帕金森病、艾滋病、腦卒中、慢性阻塞性肺疾病和精神分裂癥等伴隨的疲勞[1-6]。病理性疲勞感更強(qiáng)烈，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，會(huì)對(duì)個(gè)體的功能活動(dòng)和生命質(zhì)量造成嚴(yán)重?fù)p害。研究表明，疲勞的發(fā)生機(jī)制主要涉及能量代謝，氧化應(yīng)激、代謝產(chǎn)物累積、免疫系統(tǒng)紊亂、內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)等[7]。

補(bǔ)中益氣丸出自《脾胃論》，為益氣健脾的代表方劑，由黃芪（蜜炙）、黨參、甘草（蜜炙）、白術(shù)（炒）、當(dāng)歸、升麻、柴胡、陳皮組成，具有補(bǔ)中益氣，升陽(yáng)舉陷的功效[8]。中醫(yī)認(rèn)為氣為人生命活動(dòng)的根本，李東垣在《脾胃論·脾胃虛實(shí)傳變論》中言道“元?dú)庵渥?，皆由脾胃之氣無(wú)所傷，而后能滋養(yǎng)元?dú)狻?，脾胃的作用為運(yùn)化水谷精微，布輸全身，維持正常的生命活動(dòng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明補(bǔ)中益氣丸具有促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[9-12]。補(bǔ)中益氣丸的抗疲勞效果也已被初步證實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣丸可有效緩解癌因性疲勞（Cancer-related Fatigue，CRF）[13-14]，并且能改善急性運(yùn)動(dòng)后大鼠腦組織呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ、Ⅲ及ATP酶活性，對(duì)線粒體氧化磷酸化有一定的保護(hù)作用，可顯著降低運(yùn)動(dòng)后大鼠血清丙二醛（MDA）含量，提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）含量，從而提高機(jī)體抗疲勞能力[15-17]，楊可文等[18]觀察到大劑量補(bǔ)中益氣湯治療運(yùn)動(dòng)疲勞的臨床有效率為96.87%，且無(wú)不良反應(yīng)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體和系統(tǒng)的角度探索藥物與疾病的關(guān)系，這與中醫(yī)的整體特征非常一致[19]，以系統(tǒng)生物學(xué)和多重藥理學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用網(wǎng)絡(luò)可視化和網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)揭示藥物、有效成分、靶點(diǎn)和疾病之間復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，以期預(yù)測(cè)藥理作用機(jī)制[20]。關(guān)于補(bǔ)中益氣丸抗疲勞機(jī)制系統(tǒng)、深入的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，闡釋其潛在作用機(jī)制，為相關(guān)功能產(chǎn)品及藥品的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論參考，為探究其抗疲勞作用機(jī)制提供新思路，本研究方法路線圖。見(jiàn)圖1。

1 資料與方法

1.1 藥物有效活性成分及對(duì)應(yīng)靶基因的獲取

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索，根據(jù)ADME參數(shù)設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)，分別搜集補(bǔ)中益氣丸中8種中藥的主要活性成分。利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo);并利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）將靶標(biāo)名稱進(jìn)行統(tǒng)一注釋，獲得有效成分靶基因集，該數(shù)據(jù)庫(kù)可集中、準(zhǔn)確捕獲基因資源信息。

1.2 疾?。ㄆ冢┌谢蚣慕?/p>

在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/）中以“fatigue”“anti-fatigue”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，查找與疲勞有關(guān)的靶標(biāo)并進(jìn)行整合去重，獲得疲勞靶基因集。

1.3 疾病-藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用TBTools得到補(bǔ)中益氣丸有效成分靶基因集與疲勞靶基因集的交集靶點(diǎn)并制作韋恩圖，將共有基因作為候選預(yù)測(cè)靶標(biāo)，創(chuàng)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”及“疾病-靶點(diǎn)”關(guān)系文件及屬性文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中進(jìn)行可視化操作，形成疾病-藥物-藥物成分-靶點(diǎn)的作用網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“補(bǔ)中益氣丸”與“疲勞”的共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-bd.org/）中，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無(wú)聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)不變，并根據(jù)蛋白之間的關(guān)聯(lián)度進(jìn)行排序。獲取靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析

在R語(yǔ)言4.0.2程序中安裝“Bioconductor”軟件包“org.Hs.eg.db”并運(yùn)行，將藥物-疾病共同靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成Entrez Gene ID。然后在R軟件安裝“clusterProfiler”包，根據(jù)已轉(zhuǎn)換的Entrez Gene ID，以P<0.05，Q<0.05進(jìn)行關(guān)鍵靶基因GO與KEGG功能富集分析，按照顯著性大小進(jìn)行排序，選取前20條通路繪制氣泡圖。

1.6 補(bǔ)中益氣丸抗疲勞藥效學(xué)評(píng)價(jià)

本研究在北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)8周齡SPF級(jí)BABL/C雄性小鼠，體質(zhì)量為（20.0±2.0）g，共計(jì)24只（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），使其自由進(jìn)水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后分為2組，每組12只，空白組每天灌胃蒸餾水，補(bǔ)中益氣丸組將補(bǔ)中益氣丸（國(guó)藥準(zhǔn)字Z36021765）進(jìn)行超聲溶解于蒸餾水后再進(jìn)行灌胃，灌胃量為10 mL/（kg·d）。30 d后小鼠進(jìn)行負(fù)重力竭游泳試驗(yàn)：將尾部負(fù)重5%體質(zhì)量鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳，記錄小鼠自游泳開(kāi)始至力竭而沉入水中并維持8 s不能浮出水面的時(shí)間，并馬上把小鼠撈出水面[21]。而后繼續(xù)灌胃3 d，進(jìn)行血清尿素氮（BUN）測(cè)定：末次給受試樣品30 min后，不負(fù)重游泳90 min，休息60 min后進(jìn)行眼眶采血，取血清備用，利用全自動(dòng)生化儀（貝克曼庫(kù)爾特au480）及血清尿素氮試劑盒（購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)190971）進(jìn)行BUN含量檢測(cè)[22]。在灌胃38 d時(shí)，頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟制備肝組織勻漿，按照肝糖原酶聯(lián)免疫試劑盒（購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技公司）說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝糖原含量。

本研究由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)（倫理審查號(hào)：SLXD-20190826005）。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差齊性則2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，置信區(qū)間設(shè)置為95%，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物有效活性成分及對(duì)應(yīng)靶基因的獲取

補(bǔ)中益氣丸所涉及的八味中藥中黃芪（包括20種化合物）、黨參（包括21種化合物）、甘草（包括92種化合物）、白術(shù)（包括7種化合物）、當(dāng)歸（包括2種化合物）、升麻（包括17種化合物）、柴胡（包括17種化合物）、陳皮（包括5種化合物）的有效成分在整合并去重后共計(jì)163種，其中部分有效成分的信息見(jiàn)表1。

2.2 疾病-藥物-活性成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

為了研究補(bǔ)中益氣丸對(duì)疲勞的調(diào)控作用，需要對(duì)其中涉及的活性成分進(jìn)行疲勞-多成分-多基因分析。首先通過(guò)Drugbank、GeneCards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)以“Fatigue”“Anti-Fatigue”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得與疲勞相關(guān)的作用靶點(diǎn)1 226個(gè)。通過(guò)韋恩圖獲取補(bǔ)中益氣丸活性成分與疲勞交集基因108個(gè)。見(jiàn)圖2。將“疲勞”、補(bǔ)中益氣丸中的8味中藥及其活性成分、核心靶標(biāo)錄入Cytoscape 3.7.1軟件中，構(gòu)建疲勞-藥物-活性成分-靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖3。網(wǎng)絡(luò)圖包含節(jié)點(diǎn)235個(gè)，邊線1 110條。見(jiàn)圖3。

依據(jù)軟件中導(dǎo)出的default node.csv文件，發(fā)現(xiàn)與抗疲勞相關(guān)的163種活性成分中，度值排名前10位的活性成分具體信息及拓?fù)湫再|(zhì)見(jiàn)表2，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。將交集靶標(biāo)錄入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取蛋白相互作用關(guān)系并導(dǎo)出tsv文件。探索蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interactions）和相互作用網(wǎng)絡(luò)對(duì)于理解細(xì)胞組織、生物過(guò)程和功能非常重要，蛋白質(zhì)常通過(guò)PPI執(zhí)行特定的生物功能[23]。利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建出蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖5），其中排名10位的關(guān)鍵靶點(diǎn)（degree>20）拓?fù)湫畔⒁?jiàn)表3。

2.3 GO和KEGG的富集結(jié)果

通過(guò)GO功能富集分析，補(bǔ)中益氣丸八味中藥中與抗疲勞相關(guān)的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)基因共涉及生物過(guò)程（Biological Process，BP）富集條目2 109個(gè)，排名前5條的是脂多糖應(yīng)答（Response to Lipopolysaccharide，34個(gè)基因）、對(duì)源細(xì)菌分子的反應(yīng)（Response to Molecule of Bacterial Origin，34個(gè)基因）、抗生素響應(yīng)（Response to Antibiotic，31個(gè)基因）、化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)（Cellular Response to Chemical Stress，29個(gè)基因）和活性氧代謝過(guò)程（Reactive Oxygen Species Metabolic Process，27個(gè)基因），得到細(xì)胞組分（Cell Component，CC）條目59個(gè)，前三條是膜筏（Membrane Raft，22個(gè)基因）、膜微區(qū)（Membrane Microdomain，22個(gè)基因）、膜區(qū)（Membrane Region，22個(gè)基因），得到分子功能（Molecular Function，MF）條目137個(gè)（P<0.05），主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合（Cytokine Receptor Binding，17個(gè)基因）、細(xì)胞因子活性（Cytokine Activity，15個(gè)基因）、磷酸酶結(jié)合（Phosphatase Binding，14個(gè)基因）、蛋白磷酸酶結(jié)合（Protein Phosphatase Binding，12個(gè)基因）等。取各類別排名前20的GO條目繪制氣泡圖見(jiàn)圖6。

KEGG通路富集得到160條（P<0.05），主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、乙型肝炎、卡波濟(jì)氏肉瘤皰疹病毒感染、TNF信號(hào)通路等通路、內(nèi)分泌抵抗、MAPK、PI3K-AKT、AMPK信號(hào)通路等。見(jiàn)圖6。說(shuō)明補(bǔ)中益氣丸主要活性成分的作用靶點(diǎn)分布在不同的代謝通路，多成分、多靶點(diǎn)相互調(diào)節(jié)。表4為部分通路的網(wǎng)絡(luò)特征，圖6為GO功能和KEGG途徑富集分析前20位結(jié)果：y軸顯示靶基因的GO和KEGG途徑顯著富集，x軸顯示基因比率。基因比率表示屬于GO或KEGG途徑的靶基因數(shù)量與所有注釋基因數(shù)量的比例?；虮壤礁?，富集程度越高。粒徑越大，GO或KEGG途徑中靶基因的數(shù)量越多，紅點(diǎn)越深，P值越小，代表與補(bǔ)中益氣丸干預(yù)疲勞關(guān)系越密切。

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

與空白組比較，補(bǔ)中益氣丸組的小鼠力竭游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)，延長(zhǎng)率為30.63%，肝糖原含量增加了4.7%，血清尿素氮含量沒(méi)有降低，后2個(gè)指標(biāo)均無(wú)顯著性差異，提示補(bǔ)中益氣丸可顯著增強(qiáng)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力，但對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝方面無(wú)明顯作用，分析可能原因是給藥劑量過(guò)小。見(jiàn)表5。

3 討論

氧化應(yīng)激是疲勞的產(chǎn)生機(jī)制之一，氧化應(yīng)激是指活性氧（ROS）的產(chǎn)生與機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)能力之間的不平衡，ROS是造成肌肉疲勞的主要原因。而排名前10位的核心有效成分中有9種都是黃酮類物質(zhì)，黃酮類化合物是一種天然抗氧化劑，不僅能清除ROS或減少ROS形成，還可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)提高機(jī)體耐受能力，減緩肌肉的損傷及能量的過(guò)度損耗，達(dá)到抗疲勞作用[24-25]。Lv等[26]發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮A對(duì)對(duì)乙酰氨基酚（APAP）誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用，這可能與Nrf2介導(dǎo)的抗氧化防御機(jī)制密切相關(guān)。在中度氧化損傷中，槲皮素可減少ROS的產(chǎn)生，并激活PI3K-AKT和ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)元的成活[27]。此外，槲皮素還能引起雙相、劑量依賴性效應(yīng)，在低濃度下，起到抗氧化劑的作用，但在高濃度下作為一種促氧化劑發(fā)揮作用，可能會(huì)用于化療[28]。研究表明激活PI3K-AKT信號(hào)通路可抑制活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[29]，作為重要的抗氧化通路，它是本KEGG富集結(jié)果中值得關(guān)注的通路之一。PI3K-AKT信號(hào)通路是由一系列酶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，不僅參與多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)等信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)還參與細(xì)胞凋亡、成活以及調(diào)控細(xì)胞糖代謝等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[30-31]。另外，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路亦在機(jī)體對(duì)環(huán)境應(yīng)激適應(yīng)及維持機(jī)體內(nèi)氧化抗氧化動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中發(fā)揮著重要的作用[32]。在度值排名前10位的核心靶點(diǎn)之中有4個(gè)屬于MAPK家族，可見(jiàn)其調(diào)節(jié)機(jī)體疲勞的重要性。MAPK信號(hào)通路是由一系列連續(xù)作用的激酶組成，其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）是MAPK級(jí)聯(lián)的主要組成部分，負(fù)責(zé)在細(xì)胞膜上傳遞生長(zhǎng)因子信號(hào)，激活MEK1-ERK1/2可增強(qiáng)小鼠肌肉代謝效率、耗氧量及肌肉抗疲勞能力[33]。由此可見(jiàn)，上述兩條通路可通過(guò)改善機(jī)體氧化應(yīng)激而達(dá)到緩解體力疲勞的效果，這也與GO（BP）富集分析得到的補(bǔ)中益氣丸調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)與活性氧代謝相一致。王蕾等[16]亦發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣丸對(duì)線粒體氧化磷酸化過(guò)程有一定的保護(hù)作用，可明顯升高小鼠急性運(yùn)動(dòng)后腦組織呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ和Ⅳ活性，防止急性運(yùn)動(dòng)后腦組織Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的下降，保障呼吸電子傳遞鏈電子傳遞功能的正常。

在KEGG富集的前20條通路中，有4條為癌癥通路：前列腺癌、胰腺癌、癌癥中的蛋白多糖及MicroRNAs，可見(jiàn)疲勞是癌癥發(fā)生發(fā)展及治療干預(yù)過(guò)程中伴隨的病理現(xiàn)象，CRF嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量[34-35]。有5條與病毒感染相關(guān)通路，而病毒感染亦與癌癥有關(guān)，世界衛(wèi)生組織將本次度值排名第一位的卡波濟(jì)氏肉瘤皰疹病毒（KSHV）列入“一類致癌病毒”清單中。研究指出MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路與腫瘤有著千絲萬(wàn)縷的關(guān)系，它們的雙重抑制在理論上是一種很有前途的抗癌方法，但其臨床應(yīng)用仍有待研究[36]?；钚猿煞种荒鞠菟赝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)活性氧誘導(dǎo)的P38MAPK/NF-κB通路和鈣誘導(dǎo)的線粒體凋亡信號(hào)通路保護(hù)HO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激：上調(diào)人內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)，下調(diào)iNOS表達(dá)、線粒體膜bcl-2/bax比值及線粒體細(xì)胞色素C的釋放，從而增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡能力，起到抗腫瘤作用[37]，進(jìn)而減輕CRF癥狀。甘草查爾酮A在多種腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出促凋亡自噬，抗細(xì)胞增殖的作用[38-39]從而具有一定抗癌作用。另有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素與多種癌癥相關(guān)途徑相互作用，通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-AKT/mTOR通路、Wnt/β-catenin通路和MAPK/ERK1/2通路，對(duì)癌細(xì)胞和腫瘤發(fā)揮抗癌作用[40]。Maurya等[41]用300 μmol/L槲皮素預(yù)處理可抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS的增加，顯著下調(diào)AKT、PDK1、BAD的磷酸化及腫瘤壞死因子TNFR1水平，并上調(diào)抑癌基因PTEN水平，結(jié)果提示槲皮素和PI3K抑制劑PI-103抑制PI3K-AKT途徑以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制相似。

在疲勞的生物學(xué)基礎(chǔ)中，炎癥介質(zhì)可能發(fā)揮重要作用，疲勞是免疫介導(dǎo)的炎癥和感染后經(jīng)常觀察到的一種臨床癥狀，生物體對(duì)感染、疾病行為的適應(yīng)性反應(yīng)可最大限度地減少能量消耗，并通過(guò)炎癥消退來(lái)改善能量代謝效率[42]。由分析結(jié)果可知，本研究中與炎癥相關(guān)生物過(guò)程與通路的度值普遍偏高，例如脂多糖（LPS）應(yīng)答及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路，LPS是革蘭陰性菌主要的致病物質(zhì)，也是導(dǎo)致嚴(yán)重炎癥感染的直接原因，其與機(jī)體免疫功能的密切關(guān)系，生命科學(xué)研究常常提取LPS進(jìn)行誘導(dǎo)生長(zhǎng)促進(jìn)因子如白細(xì)胞介素的合成與分泌及動(dòng)物炎癥反應(yīng)[43-44]。而“糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路”涉及TNF、CASP3、IL6、IL1B、STAT1等炎癥介質(zhì)，以腫瘤壞死因子TNF為例，其主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，活化的TNF與細(xì)胞膜中的受體（TNFR1，TNFR2）結(jié)合，導(dǎo)致許多基因的激活，啟動(dòng)核因子κB通路和MAPK通路[45]，大量TNFα可參與誘導(dǎo)IL-1、IL-6、IL-8的表達(dá)，從而釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，引起組織壞死。本次篩選到的活性成分山柰酚能降低HO和百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，降低炎癥標(biāo)志物如核因子κB、TNF-α、IL-6的含量[46]，從而改善能量代謝，緩解體力疲勞。

提高及機(jī)體能量供給，改善能量代謝水平亦是緩解疲勞的重要機(jī)制之一，值得關(guān)注的相關(guān)通路如AMPK信號(hào)通路，AMPK激酶可感知細(xì)胞能量和營(yíng)養(yǎng)水平，在機(jī)體中維持能量代謝的完整性和脂肪代謝的效率，是一種燃料傳感器和調(diào)節(jié)器，在不同的組織中促進(jìn)ATP的產(chǎn)生和抑制ATP的消耗，AMPK激酶通常被低ATP水平激活，可促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致胰島素刺激的葡萄糖攝取增加[47-48]。藥效學(xué)試驗(yàn)中測(cè)定的小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間直接反映小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，運(yùn)動(dòng)耐力依賴于包括糖原的儲(chǔ)存、脂肪的消耗和代謝產(chǎn)物的積累等因素;肝糖原作為重要的能源儲(chǔ)備物質(zhì)用于補(bǔ)充血糖的消耗，使得機(jī)體內(nèi)的血糖保持長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定，推遲疲勞發(fā)生;血清尿素氮主要反映機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝情況，機(jī)體在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)后，體內(nèi)能源儲(chǔ)備糖原物質(zhì)消耗，就會(huì)開(kāi)始消耗體內(nèi)蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生大量尿素，機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)性越低，形成的尿素越多。以上3個(gè)指標(biāo)皆反映機(jī)體能量代謝，試驗(yàn)結(jié)果表明補(bǔ)中益氣丸可顯著提高機(jī)體耐力，但不明顯著改善機(jī)體能量代謝水平，可能是給藥劑量過(guò)小的原因。

綜上所述，補(bǔ)中益氣丸具有多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的作用特點(diǎn)，通過(guò)改善機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能及減輕免疫介導(dǎo)的炎癥和感染進(jìn)而緩解疲勞，但是在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝方面未有明顯的富集效果，這與藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果相符，推測(cè)補(bǔ)中益氣丸在緩解病理性疲勞方面效果更加顯著。

參考文獻(xiàn)

[1]Louati K，Berenbaum F.Fatigue in chronic inflammation-a link to pain pathways[J].Arthritis Res Ther，2015，17：254.

[2]Matura LA，Malone S，Jaime-Lara R，et al.A Systematic Review of Biological Mechanisms of Fatigue in Chronic Illness[J].Biol Res Nurs，2018，20（4）：410-421.

[3]Agarwal S，Garg R，Minhas V，et al.To assess the Prevalence and Predictors of Cancer-related Fatigue and its Impact on Quality of Life in Advanced Cancer Patients Receiving Palliative Care in a Tertiary Care Hospital：A Cross-sectional Descriptive Study[J].Indian J Palliat Care，2020，26（4）：523-527.

[4]Kim SJ，Jang JY，Kim EJ，et al.Ginsenoside Rg3 restores hepatitis C virus-induced aberrant mitochondrial dynamics and inhibits virus propagation[J].Hepatology，2017，66（3）：758-771.

[5]Distel DF，Amodeo M，Joshi S，et al.Cognitive Dysfunction in Persons with Chronic Spinal Cord Injuries[J].Phys Med Rehabil Clin N Am，2020，31（3）：345-368.

[6]王嬌，蓋海云.腦卒中后疲勞評(píng)估工具研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合護(hù)理（中英文），2019，5（11）：132-136.

[7]馬樂(lè)樂(lè)，林俊芝，劉海燕，等.抗疲勞高頻藥物保健作用的精準(zhǔn)定位與分析[J].中國(guó)中藥雜志，2020，45（15）：3608-3616.

[8]葉蓉，唐春鳳，劉道光，等.金匱腎氣丸與補(bǔ)中益氣丸聯(lián)用對(duì)自然衰老C57小鼠運(yùn)動(dòng)及代謝的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2021，41（3）：600-603.

[9]Ju WJ，Zhao ZK，Chen SL，et al.Buzhongyiqi Decoction Protects Against Loperamide-Induced Constipation by Regulating the Arachidonic Acid Pathway in Rats[J].Front Pharmacol，2020，11：423.

[10]Jin SE，Ha H，Shin HK.Effects of Herbal Formulas Bojungikgi-tang and Palmijihwang-hwan on Inflammation in RAW 264.7 Cells and the Activities of Drug-Metabolizing Enzymes in Human Hepatic Microsomes[J].J Med Food，2018，21（11）：1173-1187.

[11]張文杰，潘華新，巫燕莉，等.補(bǔ)中益氣丸對(duì)IEC-6細(xì)胞損傷模型NLRP3炎性體及相關(guān)細(xì)胞因子的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（12）：114-118.

[12]胡芳.補(bǔ)中益氣丸譜—效相關(guān)性研究、主成分含量測(cè)定及抗腫瘤作用研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2015.

[13]陳義萍.補(bǔ)中益氣丸對(duì)骨髓抑制小鼠造血調(diào)控的影響及機(jī)制研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[14]李軍，楊海燕.補(bǔ)中益氣丸治療乳腺癌腫瘤相關(guān)性疲勞的臨床觀察[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，36（3）：12-14.

[15]任劍書(shū).補(bǔ)中益氣丸治療脾氣虛型癌癥相關(guān)性疲勞的臨床研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[16]王蕾，李爽，李燕舞.補(bǔ)中益氣丸對(duì)急性運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合體及ATP酶活性的影響[J].中藥藥理與臨床，2013，29（4）：13-16.

[17]郝紅梅，田文婧.補(bǔ)中益氣湯對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠血清SOD、MDA、GSH-XP含量的影響[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，15（3）：27-28.

[18]楊可文，譙建華.補(bǔ)中益氣湯對(duì)緩解運(yùn)動(dòng)疲勞的效果分析[J].內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)漢文版，2017，46（3）：414-416.

[19]Chen G，Huang C，Liu Y，et al.A Network Pharmacology Approach to Uncover the Potential Mechanism of Yinchensini Decoction[J].Evid Based Complement Alternat Med，2018，2018：2178610.

[20]高寒，徐偉，張宇航，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的刺五加總苷抗疲勞作用機(jī)制研究[J].中草藥，2021，52（2）：413-421.

[21]Huang WC，Hsu YJ，Wei L，et al.Association of physical performance and biochemical profile of mice with intrinsic endurance swimming[J].Int J Med Sci，2016，13（12）：892-901.

[22]Tung YT，Wu MF，Lee MC，et al.Antifatigue Activity and Exercise Performance of Phenolic-Rich Extracts from Calendula officinalis，Ribes nigrum，and Vaccinium myrtillus[J].Nutrients，2019，11（8）：1715.

[23]Zhang W，Chen Y，Jiang H，et al.Integrated strategy for accurately screening biomarkers based on metabolomics coupled with network pharmacology[J].Talanta，2020，211：120710.

[24]Chen Z，Liu L，Gao C，et al.Astragali Radix（Huangqi）：A promising edible immunomodulatory herbal medicine[J].J Ethnopharmacol，2020，258：112895.

[25]劉威良，黃艾祥.黃酮類化合物抗疲勞作用研究進(jìn)展[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，39（2）：81-90.

[26]Lv H，Xiao Q，Zhou J，et al.Licochalcone A Upregulates Nrf2 Antioxidant Pathway and Thereby Alleviates Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity[J].Front Pharmacol，2018，9：147.

[27]Zubcic K，Radovanovic V，Vlainic J，et al.PI3K/Akt and ERK1/2 Signalling Are Involved in Quercetin-Mediated Neuroprotection against Copper-Induced Injury[J].Oxid Med Cell Longev，2020，2020：9834742.

[28]Jana N，Bretislav G，Pavel S，et al.Potential of the Flavonoid Quercetin to Prevent and Treat Cancer-Current Status of Research[J].Klin Onkol，2018，31（3）：184-190.

[29]Hu S，Wu Y，Zhao B，et al.Panax notoginseng Saponins Protect Cerebral Microvascular Endothelial Cells against Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion-Induced Barrier Dysfunction via Activation of PI3K/Akt/Nrf2 Antioxidant Signaling Pathway[J].Molecules，2018，23（11）：2781.

[30]Thorpe LM，Yuzugullu H，Zhao JJ.PI3K in cancer：divergent roles of isoforms，modes of activation and therapeutic targeting[J].Nat Rev Cancer，2015，15（1）：7-24.

[31]Hemmings B A，Restuccia D F.The PI3K-PKB/Akt pathway[J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2015，7（4）：a026609.

[32]崔笑梅，曹建民，周海濤，等.黑果枸杞子對(duì)過(guò)度訓(xùn)練大鼠骨骼肌MAPK信號(hào)通道蛋白表達(dá)及抗氧化應(yīng)激損傷能力的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（3）：122-127.

[33]Boyer JG，Prasad V，Song T，et al.ERK1/2 signaling induces skeletal muscle slow fiber-type switching and reduces muscular dystrophy disease severity[J].JCI Insight，2019，5（10）：e127356.

[34]謝海納，潘志強(qiáng).癌因性疲勞學(xué)術(shù)問(wèn)題及其動(dòng)物模型研究述要[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，33（6）：1-7.

[35]Ramanathan RK，Von Hoff DD，Eskens F，et al.Phase Ib Trial of the PI3K Inhibitor Copanlisib Combined with the Allosteric MEK Inhibitor Refametinib in Patients with Advanced Cancer[J].Target Oncol，2020，15（2）：163-174.

[36]王佟，曹余光，劉瑩.桂枝茯苓丸聯(lián)合補(bǔ)中益氣丸對(duì)去勢(shì)大鼠前列腺增生作用機(jī)制的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（17）：154-157.

[37]Chen HI，Hu WS，Hung MY，et al.Protective effects of luteolin against oxidative stress and mitochondrial dysfunction in endothelial cells[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2020，30（6）：1032-1043.

[38]Wu CP，Lusvarghi S，Hsiao SH，et al.Licochalcone A Selectively Resensitizes ABCG2-Overexpressing Multidrug-Resistant Cancer Cells to Chemotherapeutic Drugs[J].J Nat Prod，2020，83（5）：1461-1472.

[39]Zhang Y，Gao M，Chen L，et al.Licochalcone A restrains microphthalmia-associated transcription factor expression and growth by activating autophagy in melanoma cells via miR-142-3p/Rheb/mTOR pathway[J].Phytother Res，2020，34（2）：349-358.

[40]Granato M，Rizzello C，Gilardini M M，et al.Quercetin induces apoptosis and autophagy in primary effusion lymphoma cells by inhibiting PI3K/AKT/mTOR and STAT3 signaling pathways[J].J Nutr Biochem，2017，41：124-136.

[41]Maurya A K，Vinayak M.PI-103 and Quercetin Attenuate PI3K-AKT Signaling Pathway in T-Cell Lymphoma Exposed to Hydrogen Peroxide[J].PLoS One，2016，11（8）：e160686.

[42]譚英，李奎，楊俊生.白細(xì)胞介素1與疲勞的關(guān)系研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)藥，2020，42（9）：1408-1413.

[43]傅增輝，姜巖，劉晶，等.白樺脂醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用[J].免疫學(xué)雜志，2021，37（2）：128-133.

[44]邵紫君，李志滿，于鵬程，等.氨基酸轉(zhuǎn)化三七花中稀有人參皂苷及提取液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活性的影響[J].中草藥，2021，52（3）：702-710.

[45]Scotece M，Conde J，Abella V，et al.Oleocanthal Inhibits Catabolic and Inflammatory Mediators in LPS-Activated Human Primary Osteoarthritis（OA） Chondrocytes Through MAPKs/NF-kappaB Pathways[J].Cell Physiol Biochem，2018，49（6）：2414-2426.

[46]Yao H，Sun J，Wei J，et al.Kaempferol Protects Blood Vessels From Damage Induced by Oxidative Stress and Inflammation in Association With the Nrf2/HO-1 Signaling Pathway[J].Front Pharmacol，2020，11：1118.

[47]Sukumaran A，Choi K，Dasgupta B.Insight on Transcriptional Regulation of the Energy Sensing AMPK and Biosynthetic mTOR Pathway Genes[J].Front Cell Dev Biol，2020，8：671.

[48]Kwak SY，Seo IH，Chung I，et al.Effect of chitinase-3-like protein 1 on glucose metabolism：In vitro skeletal muscle and human genetic association study[J].FASEB J，2020，34（10）：13445-13460.

（2020-01-20收稿 責(zé)任編輯：魏慶雙）