LC-MS-MS法測定人血漿中阿托伐他汀、鄰位阿托伐他汀和對位阿托伐他汀的濃度

易志恒，李筱旻，申秋瑩，潘琳，王珊，向圓圓，李岱，戴伊歆，徐素梅*（1.中南大學(xué)，長沙 41008；. 湖南迪諾制藥股份有限公司，長沙 4101；. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究中心，長沙 410008；4. 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（湘雅），長沙 410008）

阿托伐他汀（atorvastatin，AT）是一種選擇性3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，其主要作用機(jī)制是通過抑制HMGCoA 還原酶，減少膽固醇和脂蛋白的前體物質(zhì)甲羥戊酸的形成，從而顯著降低膽固醇、低密度脂蛋白及三酰甘油水平[1]。同時(shí)，阿托伐他汀還具有降低血小板活化和聚集的作用，臨床常用于高脂血癥的治療和心腦血管疾病的防治[2-4]。

阿托伐他汀有明顯的首過效應(yīng)，主要由肝臟的CYP3A4 酶代謝成鄰位羥基代謝物（orthohydroxy atorvastatin，o-AT）和對位羥基代謝物（para-hydroxy atorvastatin，p-AT），兩者的藥理活性與阿托伐他汀相當(dāng)[5]。而阿托伐他汀、o-AT、p-AT 又可動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的非活性內(nèi)酯衍生物[6]。因此，阿托伐他汀及其活性代謝產(chǎn)物o-AT和p-AT 的血漿濃度低，對其藥代動(dòng)力學(xué)研究提出了挑戰(zhàn)[7]。目前已報(bào)道多種分析方法可用于單獨(dú)測定阿托伐他汀，或同時(shí)測定阿托伐他汀及其活性代謝物，如GC-MS、LC-MS/MS[8-14]，但有前處理繁瑣、靈敏度較低或分析時(shí)間長等缺陷。

本研究旨在建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、操作簡便的HPLC-MS/MS 法，同時(shí)測定阿托伐他汀、o-AT、p-AT，以滿足藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要。

1 材料

1.1 儀器

低溫離心機(jī)（TDL5M，鹽城凱特）；HPLC系統(tǒng)（ExionLC）；串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（AB Sciex Triple Quad5500）；數(shù)據(jù)采集和處理硬件（Analyst 1.6.3，AB Sciex）。

1.2 試藥

阿托伐他汀（批號(hào)：8-SCC-42-1，含量：96.0%）、鄰位阿托伐他?。ㄅ?hào)：13-AUG-16-37，含量：94.8%）、對位阿托伐他?。ㄅ?hào)：13-AUG-16-36，含量：96.1%）；阿托伐他汀-d5（批號(hào)：2-OMK-4-1，含量：96.0%）、鄰位阿托伐他汀-d5（批號(hào)：39-GHZ-67-1，含量：94.0%）、對位阿托伐他汀-d5（批號(hào)：39-GHZ-67-1，含量：95.0%）（對照品，Quality Control Chemicals Inc）。

甲酸（HPLC 級(jí)，ROE）；甲醇、乙酸乙酯、乙腈（HPLC 級(jí)，Burdick & Jackson）； 甲基叔丁基醚（HPLC 級(jí)，J.T. Baker）；水（HPLC 級(jí)，DUKSAN）；乙酸銨（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm，Agilent）； 流動(dòng)相A：5 mmol·L－1的乙酸銨（含0.1%甲酸的水溶液），流動(dòng)相B：5 mmol·L－1的乙酸銨（含0.1%甲酸的甲醇溶液）；柱溫：40℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：5℃；進(jìn)樣體積：30.0 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI＋方式進(jìn)行離子監(jiān)測；源噴射電壓：5500.00 V；源溫度：550℃；離子源氣體1：35 psi；離子源氣體2：35 psi；碰撞氣：4.0 psi；氣簾氣：20 psi；阿托伐他汀、鄰位阿托伐他汀、對位阿托伐他汀、阿托伐他汀-d5、鄰位阿托伐他汀-d5、對位阿托伐他汀-d5在ESI＋源電離方式下主要生成[M ＋H]＋峰分別為m/z559.5、575.20、575.40、564.50、580.3 和580.2，以此離子作為母離子，對母離子進(jìn)行碰撞碎裂，碎裂后子離子分別為m/z440.3、440.4、440.30、445.40、445.40 和445.60。阿托伐他汀、鄰位阿托伐他汀、對位阿托伐他汀、阿托伐他汀-d5、鄰位阿托伐他汀-d5、對位阿托伐他汀-d5的碰撞能量均為34 eV，去簇電壓分別為103 eV、100 eV、100 eV、121 eV、100 eV、112 eV。

2.3 對照品溶液的配制

稱量約1.00 mg 阿托伐他汀鈣、鄰位阿托伐他汀、對位阿托伐他汀（對位阿托伐他汀按校正系數(shù)來計(jì)算實(shí)際質(zhì)量，不同來源對照品的校正系數(shù)可能不同），轉(zhuǎn)移至20 mL 聚丙烯閃爍瓶中，以適量50%甲醇溶解，得到質(zhì)量濃度為100 μg·mL－1的阿托伐他汀鈣，鄰位阿托伐他汀，對位阿托伐他汀溶液（約10.0 mL）。置于－80℃冰箱保存。

以50%甲醇稀釋配制以下質(zhì)量濃度的阿托伐他汀、鄰位阿托伐他汀、對位阿托伐他汀標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（1.00、2.00、5.00、20.00、40.00、100.00、200.00、300.00 和400.00 ng·mL－1）。

2.4 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

分別稱量約1.00 mg 阿托伐他汀-d5、鄰位阿托伐他汀-d5、對位阿托伐他汀-d5，經(jīng)校正后計(jì)算實(shí)際質(zhì)量（不同來源標(biāo)準(zhǔn)品的校正系數(shù)可能不同）。轉(zhuǎn)移至20 mL 聚丙烯閃爍瓶，以適量50%甲醇溶解，得到質(zhì)量濃度為100 μg·mL－1的阿托伐他汀-d5、鄰位阿托伐他汀-d5、對位阿托伐他汀-d5儲(chǔ)備液（約10.0 mL）。放置于－80℃冰箱保存。

取100 μL 儲(chǔ)備液，用50%甲醇配得1.00 μg/mL 的中間工作溶液。放置于－80℃冰箱保存。

用加樣器轉(zhuǎn)移1.00 mL 1.00 μg·mL－1的中間工作溶液至裝有9.00 mL 50%甲醇稀釋液的20 mL 聚丙烯閃爍瓶，混勻后得到100 ng·mL－1的工作溶液。放置于－80℃冰箱保存。

2.5 樣品制備方法

取血漿樣品200 μL 至玻璃小管內(nèi)，加入10 μL 100 ng·mL－1內(nèi)標(biāo)工作溶液，加入200 μL 6 mol·L－1的乙酸銨水溶液，10.0 μL 50%甲醇，再加入1.00 mL 甲基叔丁基醚和1.00 mL 乙酸乙酯，機(jī)械震蕩5 min，離心（4000 r·min－1）3 min 后，放于－80℃冰箱冷凍水層，將上層有機(jī)層液體倒入標(biāo)記的玻璃管中，用氮吹儀在40℃（氮?dú)鈮毫?0 ～15 psi）吹干，再加入200 μL 6 mol·L－1的乙酸銨水溶液重新溶解樣品，渦旋混勻，將樣品轉(zhuǎn)至2.0 mL 聚丙烯小管中，高速離心2 min，轉(zhuǎn)移上層澄清樣品溶液至進(jìn)樣小瓶，30 μL 進(jìn)樣，LC-MS-MS 法進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性

分別制備空白血漿、空白血漿加阿托伐他汀、鄰位阿托伐他汀、對位阿托伐他汀和內(nèi)標(biāo)的血漿樣品，進(jìn)行LC-MS-MS 分析，獲得色譜圖（見圖1）。在本實(shí)驗(yàn)條件下，所有空白樣品均未見干擾峰，各成分均有效分離。

圖1 血漿中阿托伐他汀、鄰位阿托伐他汀、對位阿托伐他汀及其內(nèi)標(biāo)的色譜圖Fig 1 Chromatogram of atorvastatin，ortho-hydroxy atorvastatin and para-hydroxy atorvastatin and its internal standard in human plasma

3.2 線性范圍及定量下限（LLOQ）

取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μL，加入空白血漿190 μL，配制系列濃度血漿樣品，按“2.7”項(xiàng)下操作，配制質(zhì)量濃度為0.050、0.100、0.250、1.00、2.00、5.00、10.0、15.0 和20.0 ng·mL－1的阿托伐他汀、鄰位阿托伐他汀、對位阿托伐他汀系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度進(jìn)行3 樣本處理分析，以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)。采用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重因子1/χ2）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果阿托伐他汀、鄰位阿托伐他汀、對位阿托伐他汀的回歸方程分別為Y＝1.230X＋7.35×10－5（r＝0.996），Y＝0.604X＋4.12×10－4（r＝0.997），Y＝1.400X＋4.92×10－4（r＝0.997），線性范圍均為0.05～20.0 ng·mL－1。三者的LLOQ 均為0.05 ng·mL－1。

3.3 準(zhǔn)確度和精密度

配制定量下限、低、中、高4 種濃度質(zhì)控樣品（阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀，對位阿托伐他汀血漿濃度分別為0.050、0.150、1.50 和16.0 ng·mL－1）各6 份，測定日內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度；另配制阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀，對位阿托伐他汀血漿濃度分別為0.050、0.150、1.50 和16.0 ng·mL－1的質(zhì)控樣品，每一濃度進(jìn)行6 樣本分析，連續(xù)測定3 個(gè)分析批，分別計(jì)算阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀，對位阿托伐他汀的日間準(zhǔn)確度及精密度，準(zhǔn)確度均在80%～120%，RSD均小于15%。

3.4 提取回收率

取空白血漿，制備血漿質(zhì)量濃度分別為0.150、1.50 和16.0 ng·mL－1的阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀，對位阿托伐他汀質(zhì)控樣品，按“2.5”項(xiàng)下操作，每一濃度進(jìn)行6 樣本分析，獲得相應(yīng)的峰面積；空白基質(zhì)提取后用質(zhì)量濃度為0.150、1.50 和16.0 ng·mL－1的阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀，對位阿托伐他汀的純?nèi)芤簭?fù)溶樣品，測定峰面積。分析批中質(zhì)控樣品的峰面積除以相應(yīng)濃度的空白樣品提取液加入純?nèi)芤悍迕娣e用來計(jì)算各質(zhì)控樣品的回收率。阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀和對位阿托伐他汀的提取回收率分別為64.3%～67.0%（RSD為3.94%～13.20%），78.3%～100.0%（RSD為8.9% ～19.80%），64.3% ～71.4%（RSD為4.30%～6.0%）。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)

取血漿樣品200 μL 至玻璃小管內(nèi)，處理后進(jìn)樣分析，每一濃度進(jìn)行6 樣本分析；另取相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL 和內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，渦旋混勻，氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL 流動(dòng)相溶解，渦旋震蕩3 min，13 000 r·min－1離心5 min，30 μL 進(jìn)樣分析。

對于每批基質(zhì)，通過計(jì)算基質(zhì)存在下的峰面積與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積比值，計(jì)算阿托伐他汀、鄰位阿托伐他汀、對位阿托伐他汀和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子（MF）和內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子（ISnormalised MF），結(jié)果見表1。

表1 LC-MS/MS 法測定人血漿中阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀及對位阿托伐他汀的基質(zhì)效應(yīng)(n ＝6)Tab 1 Matrix effects of LC-MS-MS method for determination of atorvastatin，ortho-hydroxy atorvastatin，para-hydroxy atorvastatin in human plasma (n ＝6)

3.6 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制質(zhì)量濃度為0.150、16.0 ng·mL－1的阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀，對位阿托伐他汀質(zhì)控樣品，分別考察待測物在下述條件下的穩(wěn)定性：① 凍融穩(wěn)定性；② 生物樣品前處理過程中的穩(wěn)定性（室溫儲(chǔ)存25 h）；③ 生物基質(zhì)中待測物的長期穩(wěn)定性（－80℃冷凍儲(chǔ)存288 d）；④重新進(jìn)樣穩(wěn)定性。結(jié)果見表2。

表2 LC-MS/MS 法測定血漿中阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀及對位阿托伐他汀樣品穩(wěn)定性(x±CV，%)Tab 2 Stability of LC-MS-MS method for determination of atorvastatin，ortho-hydroxy atorvastatin，para-hydroxy atorvastatin in human plasma (x ±CV，%)

3.7 臨床應(yīng)用

本文所建立的阿托伐他汀及代謝物血藥濃度測試方法已成功應(yīng)用于阿托伐他汀鈣片在中國健康受試者中的生物等效性研究。本研究分為兩部分：空腹服藥試驗(yàn)和餐后服藥試驗(yàn)，各納入32 例受試者。每部分均采用隨機(jī)、開放、兩制劑、四周期、全重復(fù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。于每周期給藥前10 ～40 min 和給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72 h 采集受試者上肢靜脈血，每次采血約4 mL 至含有肝素鈉負(fù)壓真空采血管中，4℃以3500 r·min－1離心10 min，分離血漿，測定阿托伐他汀、鄰位阿托伐他汀和對位阿托伐他汀的濃度。空腹和餐后口服單劑量藥物后阿托伐他汀及代謝物的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別見表3 和表4。

表3 空腹口服受試制劑或參比制劑后阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀及對位阿托伐他汀的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)( ±s)Tab 3 Mean pharmacokinetics parameters of atorvaststin，ortho-hydroxy atorvaststin and para-hydroxy atorvaststin after the administration reference and test products under fasting condition ( ±s)

表3 空腹口服受試制劑或參比制劑后阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀及對位阿托伐他汀的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)( ±s)Tab 3 Mean pharmacokinetics parameters of atorvaststin，ortho-hydroxy atorvaststin and para-hydroxy atorvaststin after the administration reference and test products under fasting condition ( ±s)

參數(shù)阿托伐他汀鄰位阿托伐他汀對位阿托伐他汀受試制劑參比制劑受試制劑參比制劑受試制劑參比制劑tmax/h0.50（0.25，3.00）0.50（0.25，4.00） 0.75（0.50，8.00）1.00（0.50，6.00） 1.50（0.25，24.00）2.00（0.25，24.00）Cmax/（ng·mL－1）16.09±7.5913.81±6.9914.26±6.1012.82±5.84 0.41±0.19 0.40±0.22 AUC0 ～t/（ng·h·mL－1） 63.03±32.12 65.08±31.58120.81±39.94125.04±41.3910.04±6.2110.70±6.54 AUC0 ～∞/（ng·h·mL－1） 64.60±32.09 66.41±31.68123.44±38.61126.70±41.3713.73±6.4114.98±7.73 t1/2/h 9.44±2.98 9.62±2.8410.91±2.6110.65±2.43 30.67±16.69 33.24±34.72

表4 餐后口服受試制劑或參比制劑后阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀及對位阿托伐他汀的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)( ±s)Tab 4 Mean pharmacokinetics parameters of atorvaststin，ortho-hydroxy atorvaststin and para-hydroxy atorvaststin after the administration reference and test products under fed condition ( ±s)

表4 餐后口服受試制劑或參比制劑后阿托伐他汀，鄰位阿托伐他汀及對位阿托伐他汀的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)( ±s)Tab 4 Mean pharmacokinetics parameters of atorvaststin，ortho-hydroxy atorvaststin and para-hydroxy atorvaststin after the administration reference and test products under fed condition ( ±s)

注（Note）：tmax 以中位數(shù)（最小值，最大值）表示[tmax is expressed with median（minimum， maximum）]。

參數(shù)阿托伐他汀鄰位阿托伐他汀對位阿托伐他汀受試制劑參比制劑受試制劑參比制劑受試制劑參比制劑tmax/h2.00（0.50，6.00）1.50（0.50，6.00） 6.00（0.50，12.00）6.00（0.75，12.00） 8.00（4.00，24.00）8.00（3.00，12.00）Cmax/（ng·mL－1） 7.81±3.30 8.28±5.00 94.56±27.32 98.12±41.39 8.95±3.42 9.05±4.45 AUC0 ～t/（ng·h·mL－1） 61.90±17.23 61.90±17.23 96.55±27.45 100.03±41.7413.03±4.2213.11±5.41 AUC0 ～∞/（ng·h·mL－1） 63.34±17.27 65.57±27.36 6.38±2.23 6.49±2.67 0.34±0.12 0.34±0.15 t1/2/h10.22±3.8310.284±4.1413.217±3.5112.928±3.41 30.55±12.40 28.37±10.92

4 討論

本研究采用同位素氘標(biāo)作為內(nèi)標(biāo)，與待測化合物性質(zhì)相近，可校正其他因素對待測物測定結(jié)果的影響，提高檢測的精密度和準(zhǔn)確性，這也是近年來開展藥代動(dòng)力學(xué)研究或藥物一致性評(píng)價(jià)的原形藥物或其代謝產(chǎn)物研究采用較多的方法[15-16]。同時(shí)，本研究使用甲基叔丁基醚進(jìn)行液液萃取，運(yùn)用梯度洗脫的方法，建立了快速、靈敏、準(zhǔn)確、操作簡便的HPLC-MS/MS 法，為阿托伐他汀及其主要代謝物人體藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了依據(jù)。