周躍華,殷東風(fēng)
遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽110032
乳腺癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤。統(tǒng)計(jì)顯示[1],每8位婦女中就有1人會(huì)被診斷為乳腺癌,并且,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),以每年3%~4%的速度遞增,而且有年輕化趨勢(shì)。HER-2是一種原癌基因,HER-2過表達(dá)型乳腺癌普遍存在低分化、病情進(jìn)展迅速、高侵襲性等特點(diǎn)[2-3],成為判斷性乳腺癌預(yù)后危險(xiǎn)因子之一。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)信號(hào)通路是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑,在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤的多藥耐藥等方面起到至關(guān)重要的作用。MAPKs主要由ERKs、JNK/SAPK、p38MAPK、MK1/ERK5四個(gè)家族成員組成,其中ERKs(細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2,ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與乳腺癌的關(guān)系最為密切。乳腺癌為激素依賴型惡性腫瘤,研究表明將ER(+)的MCF-7乳腺癌細(xì)胞長(zhǎng)期置于雌激素匱乏的環(huán)境中,雌激素受體α(estrogen receptor,ERα)表達(dá)將明顯降低,ERα為MAPK信號(hào)通路的下游因子,MAPK通路活性增加可以促進(jìn)ERα的轉(zhuǎn)錄及翻譯。前期實(shí)驗(yàn)[4]發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方乳巖寧具有下調(diào)HER-2蛋白表達(dá)的作用,本研究進(jìn)一步觀察中藥復(fù)方聯(lián)合三苯氧胺(tamoxifen,TAM)對(duì)乳腺癌HER-2mRNA及ERK1/2、ERα蛋白表達(dá)變化的影響,為乳腺癌多靶點(diǎn)聯(lián)合治療以及中西醫(yī)結(jié)合治療提供理論依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C裸鼠40只,雌性,4~6周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2007-0005。飼養(yǎng)條件:動(dòng)物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心IVC籠具中,墊料、飼料均無菌處理。
1.2 實(shí)驗(yàn)材料人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心ATCC,ER陽性,中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所);兔抗ERK1/2抗體(Cell signaling公司,批號(hào):14);兔抗ERa抗體(北京博奧森生物,批號(hào):909086W);鼠抗β-actin抗體;DNA Marker、RT-PCR試劑盒(大連TaKaRa公司,批號(hào):RR066A);cDNA第一鏈合成試劑盒,Taq酶(北京康為世紀(jì)生物,批號(hào):CW2849);HER-2基因引物序列設(shè)計(jì)及合成(北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司);DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);MyCycler型梯度PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)BIO-RAD)。
1.3 試藥制備乳巖寧方藥物組成:柴胡10 g,太子參15 g,法半夏10 g,黃芩15 g,炙甘草10 g,生龍骨30 g,生牡蠣30 g,白花蛇舌草20 g,半枝蓮20 g,莪術(shù)15 g,浙貝母15 g。益氣消積方藥物組成:太子參15 g,白術(shù)15 g,麥冬15 g,生黃芪20 g,炙甘草10 g,沙參15 g,茯苓15 g,莪術(shù)15 g,浙貝母15 g,白花蛇舌草20 g,半枝蓮20 g。以上藥物一次性購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,按照常規(guī)水煎煮,濃縮至終濃度為3.3 g/mL,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩K鞣移〒P(yáng)子江藥業(yè),國(guó)藥準(zhǔn)字H32021472,規(guī)格:10mg/片),蒸餾水溶解,調(diào)節(jié)生藥濃度1.2 g/L備用。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 模型制備取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的濃度為1×107/mL的MCF-7細(xì)胞調(diào)節(jié)活細(xì)胞,無菌條件下接種于鼠右側(cè)胸壁第二乳墊下,0.2 mL/只,裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于層流罩中。接種后10~15天,在接種部位處出現(xiàn)質(zhì)硬結(jié)節(jié),并 逐漸增大,認(rèn)為成瘤,造模成 功[5]。
1.4.2 分組及給藥將40只造模成功的裸鼠隨機(jī)分為模型組、TAM組、乳結(jié)合組、益結(jié)合組,每組10只。根據(jù)人和鼠給藥劑量換算公式[6]計(jì)算各組給藥的劑量。模型組給予蒸餾水0.2 mL/只;TAM組給予TAM 3.6 μg/g(相當(dāng)于成人臨床用量的9倍);乳結(jié)合組給予乳巖寧33.3 g/kg(相當(dāng)于成人臨床用量的12倍)+TAM 3.6 μg/g;益結(jié)合組給予益氣消積方35.3 g/kg(相當(dāng)于成人臨床用量的12倍)+TAM 3.6 μg/g。各組每日灌胃1次,連續(xù)給藥21天。
1.5 觀察指標(biāo)
1.5.1 一般狀態(tài)觀察各組大鼠體質(zhì)量、活動(dòng)量、進(jìn)食等表現(xiàn)。
1.5.2 ERK1/2、ERα蛋白表達(dá)-20℃冰箱中取出樣本,取標(biāo)本100 mg,加入冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液500 μL,組織勻漿,采用酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,制備12%分離膠與4%濃縮膠,SDS-聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳,轉(zhuǎn)印,雜交,堿性磷酸酶法顯色,并以β-actin內(nèi)參蛋白作為對(duì)照,掃描照相,用Scion Image軟件對(duì)蛋白電泳帶的進(jìn)行灰度值檢測(cè),進(jìn)行定量分析。
1.5.3 HER-2mRNA的表達(dá)Trizol提取腫瘤組織總RNA,采用紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,HER-2基因引物序列引物參照文獻(xiàn)報(bào)道;β-actin引物設(shè)計(jì)參照Genebank的cDNA序列,按照PCR反 應(yīng) 條件進(jìn) 行PCR反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果采用Flour Chem V2.0凝膠成像分析軟件(America)分析,記錄每條HER-2和β-actin擴(kuò)增帶的灰度值,用β-actin做內(nèi)參照,將HER-2DNA擴(kuò)增片段的灰度值與相應(yīng)的內(nèi)參β-actin擴(kuò)增片段灰度值的比值作為HER-2mRNA的半定量指標(biāo)。引物序列見表1。
表1 引物序列
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以表示,采用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 一般狀態(tài)各組給藥一周后除模型組外,各用藥組荷瘤裸鼠體質(zhì)量均下降,形體消瘦,活動(dòng)量減少,進(jìn)食減少,喜蜷臥,以TAM組表現(xiàn)最明顯,在給藥的第19天,TAM組1只裸鼠因腫瘤消耗最終死亡,死亡時(shí)體質(zhì)量14 g,經(jīng)解剖檢查排除其他原因死亡。而兩個(gè)結(jié)合組裸鼠由于腫瘤消耗,體質(zhì)量也有不同程度下降,但狀態(tài)保持相對(duì)較好,直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束無死亡。
2.2 ERK1/2、ERα蛋白,HER-2 mRNA表達(dá)與模型組比較,TAM組、乳結(jié)合組及益結(jié)合組,ERK1/2、ERα蛋白、HER-2 mRNA表達(dá)均降低(P<0.01);乳結(jié)合組及益結(jié)合組較TAM組降低更明顯(P<0.01);乳結(jié)合組與益結(jié)合組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1—3。
表1 各組大鼠ERK1/2、ERα蛋白,HER-2 mRNA表達(dá)比較(
表1 各組大鼠ERK1/2、ERα蛋白,HER-2 mRNA表達(dá)比較(
注:☆表示與模型組比較,P<0.01;★表示與TAM組比較,P<0.01;◆表示與乳結(jié)合組比較,P>0.05
HER-2 mRNA 0.62±0.023 0.51±0.041☆0.42±0.004☆★0.41±0.008☆★◆組別模型組TAM組乳結(jié)合組益結(jié)合組鼠數(shù)10 9 10 10 ERK1/2 219.14±5.91 179.64±5.46☆161.34±5.03☆★159.54±4.16☆★◆ERα 224.33±7.59 187.33±4.97☆172.33±6.24☆★173.37±4.81☆★◆
圖1 各組大鼠瘤組織中ERK1/2、ERα蛋白表達(dá)
圖2 各組大鼠瘤組織中HER-2 mRNA的表達(dá)
圖3 各組大鼠瘤組織中β-actin mRNA的表達(dá)
HER-2基因又稱人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(epidermal growth factor receptor,EGF2),乳腺癌HER-2基因參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng),其基因擴(kuò)增或蛋白過度表達(dá)與腫瘤惡性生物學(xué)行為相關(guān);在治療方面,HER-2(+)較HER-2(-)的乳腺癌患者能從蒽環(huán)類新輔助化療中獲得更高的有效率[7]。
HER-2/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HER-2(+)乳腺癌患者中普遍處于活化狀態(tài),通路的高活性常提示癌細(xì)胞低分化、高增殖、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差。其機(jī)制可能與乳腺癌細(xì)胞中HER-2/neu基因的過表達(dá)能夠通過激活PI3K和ERK通路導(dǎo)致野生型P53蛋白含量減少有關(guān)[8]。本研究所采用的MCF-7細(xì)胞ER(+),為激素依賴型乳腺癌。研究表明,在雌激素匱乏的條件下,HER-2具有類雌激素樣的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用,主要通過激活ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中c-fos、ERα等,促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)[9]。乳腺癌的治療方式除了手術(shù)、放化療外,還有內(nèi)分泌治療,而TAM是最具代表性的內(nèi)分泌治療藥物,絕經(jīng)前及絕經(jīng)后患者均可以使用。本實(shí)驗(yàn)選用TAM作用于MCF-7乳腺癌動(dòng)物模型后,研究發(fā)現(xiàn)各處理組均可下調(diào)HER-2 mRNA的表達(dá),以兩個(gè)結(jié)合組最為明顯,HER-2 mRNA的表達(dá)水平下降,可以抑制MAPK信號(hào)通路的活性,故其下游激酶ERK1/2、ERα蛋白的表達(dá)水平也下降,說明中藥復(fù)方聯(lián)合TAM抑制乳腺癌生長(zhǎng)可能是通過下調(diào)HER-2 mRNA的表達(dá),抑制MAPK信號(hào)通路的活性,使ERK1/2、ERα蛋白表達(dá)減少來實(shí)現(xiàn)的,而且單純抑制HER-2 mRNA表達(dá)本身就可以抗腫瘤。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雌激素受體拮抗劑TAM可通過抑制MAPK信號(hào)通路來抗腫瘤,與文獻(xiàn)報(bào)道[10]相一致。馬云飛等[11]研究發(fā)現(xiàn)焦慮、抑郁、睡眠障礙與肝腎虧虛證、肝郁脾虛證、脾腎虧虛證、心腎不交證均有一定的相關(guān)性。而肝腎虧虛型康復(fù)期乳腺癌患者更易合并疲乏、焦慮、抑郁、睡眠障礙。劉勝[12]教授認(rèn)為正氣虧虛、肝腎不足、沖任失調(diào)、痰毒瘀結(jié)為乳腺癌發(fā)病的根本病因;正虛毒留、余毒旁竄是晚期乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素;治療應(yīng)以宣肺、補(bǔ)心、疏肝、健脾、溫腎等法進(jìn)行辨證論治。
乳巖寧方是遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科的協(xié)定方。殷東風(fēng)[13]教授認(rèn)為,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與氣機(jī)升降失常關(guān)系密切,氣機(jī)升降出入異常是導(dǎo)致患者出現(xiàn)各種變證的重要原因。乳巖寧方由《傷寒論》中的柴胡加龍骨牡蠣湯加減化裁而來,針對(duì)乳巖肝郁氣滯的病機(jī),以小柴胡湯為主方和解少陽,調(diào)暢肝臟之氣機(jī),調(diào)整氣機(jī)的升降紊亂以樞利全身氣機(jī),經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)證明小柴胡湯具有抗腫瘤之功效,加入生龍骨、生牡蠣以鎮(zhèn)定安神,軟堅(jiān)散結(jié),輔以山慈菇、莪術(shù)、浙貝母等。諸藥配伍共奏調(diào)暢氣機(jī)、扶正抗癌、軟堅(jiān)散結(jié)之功效。根據(jù)腫瘤病機(jī)“全身為虛,局部為實(shí)”,治療應(yīng)以扶正祛邪兼顧為主,以四君子湯及沙參麥冬湯為基礎(chǔ)方加減而成益氣消積方,尤其適用于中晚期的惡性腫瘤患者。關(guān)于乳巖寧方及益氣消積方我們進(jìn)行了大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究。研究表明,該藥安全可靠,對(duì)惡性腫瘤具有治療作用,在腫瘤各階段均可應(yīng)用,可改善患者生存質(zhì)量[14-15]。
本研究發(fā)現(xiàn),中藥復(fù)方乳巖寧方及益氣消積方聯(lián)合TAM可下調(diào)原癌基因HER-2 mRNA的表達(dá),通過MAPK信號(hào)通路下調(diào)ERK1/2的表達(dá),從而減少ERa蛋白的表達(dá),抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。此外,還發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方乳巖寧方及益氣消積方可加強(qiáng)TAM的療效。