十堰地區(qū)何首烏不同生長期主要活性成分的分布及含量變化

周燦，姚淼，司海倩，周明，王學(xué)奎

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070； 2.十堰市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，十堰 442000

何首烏為蓼科(Polygonaceae)何首烏屬(Fallopia)多年生纏繞藤本植物，植株整株均可入藥，收錄于《中國藥典》[1]中的分別系其干燥塊根和藤莖，前者名為何首烏(RadixPolygonimultiflori)，后者名為首烏藤(PolygonimultifloriCaulis)，二者的主要有效成分為二苯乙烯苷(2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-glucoside，THSG)和蒽醌類(大黃素、大黃素甲醚)等化合物。何首烏具有抗衰老[2]、抗腫瘤[3]、防治血栓[4]、提高記憶力[5]、保肝[6]等功效。作為藥材的何首烏塊根和首烏藤中的活性成分二苯乙烯苷含量分別不得低于1.0%和0.2%，且何首烏塊根中的結(jié)合蒽醌含量不得低于0.1%[1]。

何首烏植株中活性成分的分布及含量受種植地區(qū)和采收時間的影響較大[7-9]，十堰市轄區(qū)具有豐富的中藥材資源，其中何首烏也隨著“武當(dāng)?shù)澜提t(yī)藥”而聲名遠播，但當(dāng)?shù)厥圪u的“何首烏”藥材多達6種，正品1種，其他為偽品(4種)和混淆品(1種)[10]。本研究以武當(dāng)山周邊采集并鑒定為“正品”的何首烏(PolygonunmultiflorumThunb．)為材料，在人工栽培條件下，通過測定不同采收期何首烏不同部位主要活性成分的含量，探索十堰地區(qū)何首烏主要活性成分動態(tài)累積的規(guī)律，結(jié)合其地下部分生長情況為何首烏人工栽培中采收期的選擇提供依據(jù)，并為十堰地區(qū)何首烏的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

何首烏采自十堰市神農(nóng)武當(dāng)醫(yī)藥科技園有限公司的種植基地，本研究所用試驗材料經(jīng)湖北中醫(yī)藥研究院王克勤研究員鑒定為蓼科何首烏屬，與《中國藥典》記載的品種特征一致。通過扦插育苗，選取健壯、無病、大小一致的扦插苗進行大田試驗。

1.2 預(yù)處理方法

從移栽當(dāng)年開始取樣分析，每年9月、12月取樣2次，連續(xù)取樣3 a，按生長年限(1年生至3年生)和取樣月份(9月、12月)分別將樣品標記為：1-9、1-12，2-9、2-12，3-9、3-12。每次取樣按3次重復(fù)進行，每次重復(fù)的取樣植株數(shù)為5株，樣品采集后將根部和莖(首烏藤)分開，根部按塊根(根部膨大部分)和未膨大根(根部未膨大的細條狀部分)分成2部分進行相關(guān)指標的測定。

新鮮的根、莖用自來水清洗表面泥土、瀝干水分后，將莖切成1～2 cm左右小段，根切成厚度約5 mm的片狀，分別將樣品混勻后，分裝于牛皮紙袋中，編號，于55 ℃下烘干。進行理化指標測定時，分別用磨樣機將樣品粉碎，過4號篩(篩孔內(nèi)徑0.25 mm)，待測。

1.3 測定指標

根部樣品測定其干質(zhì)量、二苯乙烯苷和蒽醌類物質(zhì)含量，首烏藤(莖)用于測定二苯乙烯苷和蒽醌類物質(zhì)含量。

1.4 二苯乙烯苷含量測定

參照《中國藥典》，采用HPLC法測定二苯乙烯苷含量[1]。

1)樣品制備。分別稱取何首烏的塊根、未膨大根、莖的干燥、過篩粉末0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精確加入50%乙醇25 mL，稱取總質(zhì)量，70 ℃加熱回流30 min，放冷，用50%乙醇補至原質(zhì)量，搖勻后靜置，上清液粗濾后再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后即得HPLC分析樣液。

2)HPLC色譜條件。采用Agilent 1260高效液相色譜儀，色譜柱為Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，φ 5 μm)，流動相及組成是乙腈和水(體積比25∶ 75)，檢測波長320 nm，流速1 mL/min，進樣量10 μL。

1.5 蒽醌類物質(zhì)含量的測定

參照《中國藥典》，采用HPLC法測定蒽醌類物質(zhì)含量[1]。

1)樣品制備。分別稱取首烏塊根、未膨大根、莖的干燥、過篩粉末各1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精確加入50 mL 75%甲醇，稱定質(zhì)量，60 ℃水浴中回流1 h，冷卻至室溫，用75%甲醇補至原質(zhì)量，搖勻后靜置，上清液過濾后，再經(jīng)0.45 μm濾膜超濾后，即得游離蒽醌HPLC待測樣液。精密吸取上述濾液10 mL置于具塞錐形瓶中，精確加入1.5 mL濃鹽酸和13.5 mL 75%甲醇，稱質(zhì)量，75 ℃水浴回流2 h，冷卻，用75%甲醇補至原質(zhì)量，混勻、超濾后即得總蒽醌待測樣液。

2)HPLC色譜條件。采用Agilent 1260高效液相色譜儀，色譜柱為Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，φ 5 μm)，流動相為甲醇和0.1%磷酸溶液(體積比80∶20)，檢測波長254 nm，流速1 mL/min，進樣量10 μL。

上述二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚3種標準品溶液在HLPC分析過程中峰面積的RSD分別為0.27%、0.28%和0.74%(n=6)，標樣溶液存放48 h內(nèi)峰面積的RSD分別為1.53%、1.97%和1.53%(n=6)；供試樣品中二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚重復(fù)測定的峰面積的RSD分別為1.48%、1.36%和2.14%(n=6)；標準品的加樣回收率分別為95.75%、95.00%和94.14%，對應(yīng)的RSD分別為1.42%、1.41%和1.35%，滿足定性、定量分析的要求。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

不同樣品均為3次重復(fù)測定，采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理，試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示；采用SPSS 21軟件進行數(shù)據(jù)方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 何首烏地下部干物質(zhì)隨生長年限的變化

圖1為何首烏未膨大根、塊根干質(zhì)量及地下干物質(zhì)總質(zhì)量在第1年到第3年間隨時間變化的趨勢圖。由圖1可知，何首烏的膨大塊根是地下根部干物質(zhì)量的主要來源，在根的干物質(zhì)總量中占比達86.1%；其次，何首烏在移栽后前2年，即取樣時期從“1-9”至“2-12”期間，地下干物質(zhì)累積較快，不同取樣時期測得的塊根干質(zhì)量之間均達到顯著差異，說明何首烏移栽后的2年內(nèi)塊根的膨大生長迅速，第2年何首烏塊根干質(zhì)量(2-12)是第1年(1-12)的2倍以上；與第2年同時期取樣的相比，進入第3年何首烏的地下干物質(zhì)量仍顯著增加，但增加的速度明顯降低，不僅“3-9”與“3-12”之間的差異不顯著，與“2-12”的相比，“3-12”的塊根干物質(zhì)量相對增加率僅為21.6%；未膨大根在根干質(zhì)量中的平均占比較小，約14%，且在塊根快速生長的前2年其生長緩慢，如第1、第2年末的干質(zhì)量分別為16.34 g/株(1-12)、17.96 g/株(2-12)，年際間的相對增率僅為9.9%，至第3年末時未膨大根的干質(zhì)量達到37.74 g/株(3-12)，與第2年同時期(2-12)的相比相對增加了110.0%。說明何首烏塊根生長速度減慢時，未膨大根的相對生長會加快。

同一曲線上的小寫字母代表不同時期取樣測定的結(jié)果在α=0.05水平上的顯著性差異，下圖同。The lowercase letters on the same curve represent the significant difference of the tested results sampled in different periods at α=0.05 level,the same as below.

2.2 何首烏不同器官中二苯乙烯苷含量隨生長年限的變化

從圖2不同時期取樣測定的何首烏根、莖中二苯乙烯苷含量的變化可以發(fā)現(xiàn)，二苯乙烯苷主要累積在根部，莖(首烏藤)中的二苯乙烯苷含量較低且隨不同生長年限的變化幅度也很小，3年內(nèi)連續(xù)測定的最小值為21.57 mg/g(3-12)、最大值為27.34 mg/g(3-9)；根部二苯乙烯苷含量數(shù)倍于莖的(圖3中的曲線2、曲線3)，其中未膨大根的二苯乙烯苷含量平均高出塊根約50%，且在第1年、第2年內(nèi)其二苯乙烯苷含量呈現(xiàn)“直線式”增加趨勢，至第3年根中的二苯乙烯苷含量與第2年的幾乎相同、沒有顯著差異，說明何首烏根中的二苯乙烯苷在第2年內(nèi)累積最快并達到最高水平(未膨大根約182 mg/g、塊根約118 mg/g)；未膨大根和塊根中的二苯乙烯苷含量隨生長年限的變化特征基本一致(圖3中的曲線1)，在同一年度內(nèi)，9月份取樣測定的結(jié)果均低于12月份的。何首烏葉片中的二苯乙烯苷含量極低，試驗中未達到儀器檢測限(結(jié)果未列出)。

圖2 不同取樣期何首烏二苯乙烯苷含量的變化Fig.2 Changes of content of THSG in P. multiflorum at different sampling periods

圖3 不同取樣期何首烏不同器官二苯乙烯苷含量相對比值的變化Fig.3 Changes of relative ratio of THSG content in different organs of P. multiflorum at different sampling periods

2.3 何首烏不同器官中蒽醌類物質(zhì)含量隨生長年限的變化

從何首烏不同器官(未膨大根、塊根、莖)中結(jié)合態(tài)蒽醌類物質(zhì)(大黃素和大黃素甲醚)含量不同取樣時期的變化趨勢圖(圖4、5、6)可以看出，在不同取樣時期，何首烏根中結(jié)合態(tài)蒽醌含量的變化趨勢基本一致，即移栽后的前2年內(nèi)結(jié)合態(tài)蒽醌總量呈直線增加趨勢，到第2年12月份其未膨大根、塊根中的結(jié)合態(tài)蒽醌總量分別為0.27%和0.16%，在第3年其總量不再明顯增加；根中的主要結(jié)合態(tài)蒽醌組分為結(jié)合態(tài)大黃素，如未膨大根中結(jié)合態(tài)大黃素的平均含量是結(jié)合態(tài)大黃素甲醚的4.3倍，而塊根中其平均含量的差異倍數(shù)也達到2.4倍；未膨大根的結(jié)合態(tài)蒽醌總量高于塊根，平均高出50%以上。

圖4 不同取樣期何首烏未膨大根中結(jié)合態(tài)蒽醌含量的變化Fig.4 Changes of content of binding anthraquinone in unexpanded root of P. multiflorum at different sampling periods

不同取樣時期的分析結(jié)果(圖6)顯示，莖中結(jié)合態(tài)蒽醌總量明顯低于根的，在0.03%～0.05%內(nèi)波動，分別只有未膨大根的1/4、塊根的1/3；其次莖中的結(jié)合態(tài)蒽醌也以結(jié)合態(tài)大黃素為主，但只比結(jié)合態(tài)大黃素甲醚平均含量高出約30%。

圖6 不同取樣期何首烏莖中結(jié)合態(tài)蒽醌含量的變化Fig.6 Changes of content of binding anthraquinone in stemof P. multiflorum at different sampling periods

在不同生長年限以及同一生長年度內(nèi)的不同月份，何首烏根、莖中結(jié)合態(tài)大黃素甲醚含量的相對波動幅度均小于結(jié)合態(tài)大黃素，而結(jié)合態(tài)大黃素含量在同一年度內(nèi)則呈現(xiàn)季節(jié)性波動趨勢(9月份的低、12月份的高)。

圖5 不同取樣期何首烏塊根中結(jié)合態(tài)蒽醌含量的變化Fig.5 Changes of content of binding anthraquinone in roottuber of P. multiflorum at different sampling periods

何首烏不同器官中游離態(tài)、結(jié)合態(tài)蒽醌含量隨不同生長年限的動態(tài)變化如圖7所示，可以看出未膨大根、塊根中游離態(tài)、結(jié)合態(tài)蒽醌含量隨不同生長年限的動態(tài)變化趨勢大致相似(圖7、圖8)，即在移栽后的2年內(nèi)游離態(tài)和結(jié)合態(tài)蒽醌含量持續(xù)、快速增加，在第2年的12月均達到最大值，未膨大根和塊根中含量分別為1.63、2.71 mg/g和1.28、1.56 mg/g，第3年時這2種形態(tài)的蒽醌含量增速明顯減慢，并略低于第2年12月份的(2-12)，因此，根中的總蒽醌含量與游離態(tài)、結(jié)合態(tài)2種形態(tài)的蒽醌含量的變化趨勢一致；其次，根中的結(jié)合態(tài)蒽醌含量高于游離態(tài)的，未膨大根、塊根中的結(jié)合態(tài)蒽醌的平均含量分別比游離態(tài)的高出43.9%和17.6%，同一年度內(nèi)2種形態(tài)的蒽醌含量均以12月份的相對最高。

圖7 不同取樣期何首烏未膨大根中總蒽醌含量的變化Fig.7 Changes of content of total anthraquinone in unexpandedroot of P. multiflorum at different sampling periods

圖8 不同取樣期何首烏塊根中總蒽醌含量的變化Fig.8 Changes of content of total anthraquinone in roottuber of P. multiflorum at different sampling periods

何首烏莖中的游離態(tài)、結(jié)合態(tài)蒽醌含量隨不同生長年份的動態(tài)變化特點與根中的存在較大差別，在移栽后的第1年到第3年，莖中的游離態(tài)蒽醌含量的變化幅度較小，而結(jié)合態(tài)蒽醌含量在不同年份間呈現(xiàn)規(guī)律性的波動，即9月份的低、12月份的高，因此，莖中的總蒽醌含量的變化趨勢與結(jié)合態(tài)蒽醌含量的變化相一致。

與根器官相比，莖中的總蒽醌含量很低(圖9)，平均只有塊根的約1/4、未膨大根的1/5以下。

圖9 不同取樣期何首烏莖中總蒽醌含量的變化Fig.9 Changes of content of total anthraquinone in stem of P. multiflorum at different sampling periods

2.4 何首烏塊根以及不同器官中主要成分的相關(guān)性分析

塊根是何首烏整株中最重要且經(jīng)濟價值最高的藥用部位，本試驗連續(xù)3 a共6批塊根中的主要成分的相關(guān)分析結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)，塊根中二苯乙烯苷與結(jié)合態(tài)大黃素、結(jié)合態(tài)蒽醌和總蒽醌含量之間均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性，與結(jié)合態(tài)大黃素甲醚含量之間呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)性，與游離態(tài)蒽醌無顯著相關(guān)性。塊根蒽醌類物質(zhì)之間，結(jié)合態(tài)大黃素與結(jié)合態(tài)蒽醌、游離態(tài)蒽醌和總蒽醌之間均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性，與結(jié)合態(tài)大黃素甲醚呈極顯著負相關(guān)性；此外，結(jié)合態(tài)大黃素甲醚與其他蒽醌類物質(zhì)之間全部呈現(xiàn)為顯著負相關(guān)性。結(jié)合態(tài)蒽醌、游離態(tài)蒽醌和總蒽醌含量兩兩之間均為極顯著正相關(guān)性。

表1 何首烏塊根主要成分含量之間相關(guān)性分析 Table 1 Correlation analysis between main components’ contents in root tuber of P. multiflorum

對塊根、未膨大根和莖3種不同器官(或組織)中的二苯乙烯苷含量進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，僅塊根與未膨大根之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性，其他并未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性；不同部位中結(jié)合態(tài)蒽醌的相關(guān)性規(guī)律亦是如此，說明何首烏的地下根是其主要活性物質(zhì)累積的場所。

3 討 論

3.1 不同生長年限對何首烏地下干物質(zhì)的影響

何首烏的地下干物質(zhì)(根)量隨著生長期的增長而逐漸增加，幼苗移栽后的第1年和第2年其根的干物質(zhì)量幾乎呈“直線式”增加，第3年其根的干物質(zhì)增長速度明顯低于前2年，如第2年12月份(2-12)根的干物質(zhì)量與第1年的相比相對增加了102.78%，而第3年12月份(3-12)與第2年的相比其根干物質(zhì)量相對增加率只有28.98%。僅從產(chǎn)量因素考慮，何首烏人工種植年限至少應(yīng)超過2 a。

3.2 不同生長年限對何首烏二苯乙烯苷含量的影響

何首烏的二苯乙烯苷主要累積在根部，其中未膨大根中的二苯乙烯苷含量顯著高于塊根，并且其根中的二苯乙烯苷含量在移栽后的2年內(nèi)持續(xù)快速增長，第1年末(1-12)未膨大根、塊根中的二苯乙烯苷含量分別為83.67、38.42 mg/g，第2年末(2-12)則分別為182.16、118.40 mg/g，均增加了2～3倍，而第3年末(3-12)分別為181.49、122.76 mg/g，與第2年的相比沒有顯著差異。因此，何首烏在移栽后的第2年，根中的二苯乙烯苷累積速度最快，其含量在地上部葉片完全枯萎的12月份達到最大值(約1.2%)，并達到《中國藥典》要求的二苯乙烯苷含量≥1.0%的要求[1]，這與李帥鋒等[11]以不同產(chǎn)地何首烏為材料測定的二苯乙烯苷的變化趨勢相一致。

本試驗中測得的何首烏莖中的二苯乙烯苷含量明顯低于根部，在移栽后3年生長期內(nèi)呈現(xiàn)相似的變化趨勢，不同時期取樣測定的結(jié)果均呈現(xiàn)“9月份高、12月份低”的“波動”特點，第1年至第3年其含量波動幅度依次為13.4%、22.3%和26.7%。第2年后其莖(首烏藤)的二苯乙烯苷含量均達到《中國藥典》的要求[1]。

3.3 不同生長年限對何首烏蒽醌類物質(zhì)含量的影響

何首烏根部的2種結(jié)合態(tài)蒽醌——結(jié)合態(tài)大黃素和結(jié)合態(tài)大黃素甲醚是《中國藥典》中必檢的質(zhì)量指標之一，其總量不得低于0.1%[1]。在何首烏根中，未膨大根的結(jié)合態(tài)蒽醌含量顯著高于塊根，結(jié)合態(tài)蒽醌中以結(jié)合態(tài)大黃素為主，本研究測得的塊根中的結(jié)合態(tài)大黃素平均含量是結(jié)合態(tài)大黃素甲醚的2.4倍，而未膨大根中這種差異達到4.3倍。

從結(jié)合態(tài)蒽醌含量隨種植年限的變化過程來看，未膨大根、塊根中的2種結(jié)合態(tài)蒽醌含量的動態(tài)變化趨勢整體相似，相對含量低的結(jié)合態(tài)大黃素甲醚在不同生長年份間的變化幅度也相對較小，而結(jié)合態(tài)大黃素的變化幅度大，移栽之后的2年內(nèi)幾乎呈“直線式”增加，到了第3年其含量不再明顯增加，與第2年同時期的測定結(jié)果相比不存在顯著差異。

有關(guān)不同產(chǎn)地何首烏塊根中的蒽醌類成分的含量測定較多[9，11-13]，反映不同產(chǎn)地何首烏中蒽醌類成分的含量差異很大，甚至還存在未檢出的情況。有關(guān)不同種植年限對何首烏有效成分影響的研究較少報道。王芳等[8]以貴州省施秉縣3年生何首烏為材料分析得出結(jié)合態(tài)大黃素含量在不同月份間同樣呈現(xiàn)波動性變化，10月、12月根中的含量高，本研究結(jié)果與此結(jié)果大體吻合，但結(jié)合態(tài)大黃素的含量與重慶、貴州兩地的相比要高出1倍。李欣等[12]研究發(fā)現(xiàn)湖北武當(dāng)山何首烏的蒽醌類和二苯乙烯苷含量高于其他地區(qū)，認為可能與武當(dāng)山的高海拔、大溫差有關(guān)，低溫有利于結(jié)合蒽醌成分的積累。

本研究發(fā)現(xiàn)何首烏根部的蒽醌類物質(zhì)含量比莖中的高至少2倍以上，這與王芳等[8]的研究結(jié)果不同。莖中的蒽醌類物質(zhì)含量在3年內(nèi)出現(xiàn)規(guī)律性的波動，以每年12月份葉片枯落后的含量最高，除了第1年的含量略低以外，其他年份同時期的含量比較接近。

3.4 何首烏不同器官主要活性成分之間的相關(guān)性

何首烏主要藥用部位塊根中的有效成分二苯乙烯苷和結(jié)合蒽醌類物質(zhì)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。塊根中蒽醌類物質(zhì)之間，結(jié)合蒽醌、游離蒽醌和總蒽醌兩兩之間均存在極顯著正相關(guān)；結(jié)合蒽醌與結(jié)合大黃素之間呈極顯著正相關(guān)，與結(jié)合大黃素甲醚呈顯著負相關(guān)。因此，塊根中結(jié)合態(tài)蒽醌總量與結(jié)合態(tài)大黃素含量密切相關(guān)。

根部與莖部的活性成分之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性，表明何首烏不同器官中主要活性成分的代謝存在顯著差異。

綜上所述，何首烏扦插苗在十堰地區(qū)移栽后的第2年內(nèi)生長最快，產(chǎn)量增加幅度最大，其有效成分二苯乙烯苷和結(jié)合態(tài)蒽醌類也達到相對最高水平，塊根和首烏藤的有效成分含量均達到《中國藥典》規(guī)定的指標要求[1]，至第3年時產(chǎn)量增幅遠低于第2年，有效成分與第2年的相比無顯著差異。因此，從人工種植的比較效益考慮，可在種植2 a后的12月份采挖，可比大多數(shù)何首烏產(chǎn)區(qū)的采挖時間提前至少1 a。

本研究在相對可控條件下，較系統(tǒng)地研究了武當(dāng)山何首烏不同器官主要活性成分含量在不同年份、不同月份間的動態(tài)變化以及累積特點，首次明確了何首烏主要藥用部位——塊根中的兩大類活性成分二苯乙烯苷和結(jié)合態(tài)蒽醌類(《中國藥典》規(guī)定的何首烏藥材的質(zhì)量控制指標)、結(jié)合態(tài)蒽醌類與游離態(tài)蒽醌類之間存在極顯著正相關(guān)性，對于提高何首烏藥材品質(zhì)具有現(xiàn)實指導(dǎo)意義；其次，本研究結(jié)果表明，作為“廢棄物”的何首烏未膨大根，其主要活性成分二苯乙烯苷和結(jié)合蒽醌類的含量約為塊根的1.5倍，作為植物源提取物或復(fù)方顆粒的原料，既可提高何首烏資源利用程度，又可提高其種植綜合效益。