信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3 抑制劑研究進(jìn)展

劉 航，趙慶杰，徐 偉 （. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 35000；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 00433）

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是一種信號(hào)轉(zhuǎn)錄蛋白[1]。該蛋白在結(jié)構(gòu)上主要有N 末端、卷曲螺旋、DNA 接合、連結(jié)、SH2 和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域6 個(gè)位置域[2]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，STAT3 抑制劑可靶向作用于STAT3 蛋白的不同結(jié)構(gòu)區(qū)域，抑制其在細(xì)胞中的表達(dá)，為抗炎、抗癌治療提供思路[3-4]。

1 STAT3 作用機(jī)制

近年來(lái)研究者對(duì)STAT3 蛋白的探索不斷加深，對(duì)其在體內(nèi)的活化機(jī)制也有清晰的發(fā)現(xiàn)[5]。STAT3 在細(xì)胞質(zhì)中分析信號(hào)、轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄激活[6]。STAT3 蛋白在細(xì)胞中扮演著重要角色，可影響細(xì)胞的生長(zhǎng)凋亡機(jī)制，研究者們觀察到失控的STAT3 在異常激活中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，對(duì)腫瘤細(xì)胞的形成和發(fā)展具有重要影響[7]。

STAT3 的激活可通過(guò)各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素與細(xì)胞表面的受體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。在Janus 激酶（JAK）-STAT3 信號(hào)途徑中，細(xì)胞因子與細(xì)胞膜上的蛋白受體結(jié)合，成為二聚體。二聚體在細(xì)胞質(zhì)中募集并激活JAK 激酶蛋白，激活的JAK蛋白磷酸化受體酪氨酸殘基。隨后，STAT3 的Tyr705 殘基被JAKs 磷酸化，STAT3 蛋白被活化再形成二聚體后，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與特異性DNA 反應(yīng)元件結(jié)合，最終調(diào)節(jié)STAT3 靶基因的表達(dá)[8]。

STAT3 的每個(gè)結(jié)構(gòu)域各有其獨(dú)特的生物作用。STAT3 的N 末端結(jié)構(gòu)域?qū)TAT3 二聚體核易位以及DNA 結(jié)合具有重要作用；卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)TAT3 與各種蛋白質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)具有一定影響。DNA 結(jié)構(gòu)域可匹配特殊的DNA 序列，然后形成STAT3-DNA 復(fù)合物。連接區(qū)域參加與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的相互作用。SH2 結(jié)構(gòu)域?qū)τ赟TAT3 二聚化也至關(guān)重要。因?yàn)樵谀[瘤細(xì)胞中的過(guò)度激活現(xiàn)象，以及抗STAT3 的抑制劑對(duì)于抗炎免疫具有良好效果，STAT3 已成為近年來(lái)藥物研發(fā)的一個(gè)熱門方向，研究人員紛紛投入巨大熱情，不斷挖掘STAT3 的醫(yī)藥價(jià)值[9-10]。

2 STAT3 抑制劑分類

STAT3 抑制劑可靶向作用于STAT3 蛋白，抑制其在癌細(xì)胞中的磷酸化、二聚化以及核易位，使其轉(zhuǎn)錄功能喪失，有可能為疾病治療提供新方向[11]。

2.1 靶向N 端區(qū)域

Turkson 等[12]研究了STAT3 的結(jié)合肽PY*LKTK（Y*代表磷酸酪氨酸）在體外破壞STAT3 活性的能力。核提取物中PY*LKTK 的存在會(huì)導(dǎo)致STAT3 的DNA 結(jié)合活性水平顯著降低，因此破壞了核易位。作為肽直接抑制STAT3 的功能重要性的證據(jù)，發(fā)現(xiàn)PY*LKTK-mts（mts，膜移位序列）可在體內(nèi)選擇性抑制組成型和配體誘導(dǎo)的STAT3 激活。此外，PY*LKTK-mts 可抑制Src 癌蛋白的轉(zhuǎn)化。Turkson 通過(guò)確定了抑制STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最小肽，為使用該肽作為新型擬肽藥物進(jìn)行臨床治療STAT3 異常激活的疾病提供了概念基礎(chǔ)。

Timofeeva 等[13]在表征STAT3-N 末端域的選擇性抑制劑ST3-H2A2 的作用中，觀察到該化合物使凋亡基因強(qiáng)烈激活，在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)DNA-chip 技術(shù)和平鋪人類啟動(dòng)子陣列技術(shù)，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)ST3-H2A2 的基因在表達(dá)激活的同時(shí)會(huì)伴隨著STAT3 染色質(zhì)結(jié)合而改變。此外，將siRNA 敲低可證實(shí)ST3-HA2A 對(duì)基因表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)合的影響是STAT3 依賴性的，而C/EBP 同源蛋白（CHOP）啟動(dòng)子的STAT3 結(jié)合區(qū)位于癌細(xì)胞中染色質(zhì)的DNase I 超敏位點(diǎn)中，而不是未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，這表明STAT3 結(jié)合和抑制作用極有可能與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此我們猜想，STAT3-N 末端選擇性抑制劑可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡，為癌癥治療提供新方案。

2.2 靶向卷曲-螺旋區(qū)域

Huang 等[14]使用計(jì)算機(jī)虛擬篩選（AlloFinder）的途徑對(duì)STAT3 的C 端卷曲螺旋區(qū)域（CCD）進(jìn)行匹配，通過(guò)對(duì)分?jǐn)?shù)排名前15 的化合物進(jìn)行生物測(cè)定，篩得理論最佳化合物K116（圖1）。在此化合物的作用下，熒光偏振顯示STAT3 的IC50值為7.99 μmol/L。在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，STAT3 的Y705磷酸化被抑制，而上游的激酶Src 及其磷酸化無(wú)影響。同時(shí)，在腫瘤細(xì)胞株MDAMB-468 及DU145中，K116 表 現(xiàn) 出 對(duì)STAT3 很 強(qiáng) 的 抑 制，IC50為4.46 和23.85 μmol/L，表明K116 具有良好的特異性抑制STAT3 的作用。從K116 的研究歷程來(lái)看，未來(lái)進(jìn)行虛擬篩選的計(jì)算化學(xué)方法將逐步成為藥物研發(fā)的一種趨勢(shì)，在此趨勢(shì)發(fā)展的初期，我們還需要不斷改進(jìn)底層算法并完善數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容。

2.3 靶向DNA 結(jié)合域

圖1 化合物K116 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Huang 等[15]通過(guò)使用改進(jìn)的虛擬篩選策略靶向STAT3 的DNA 結(jié)合域（DBD），得到了靶向STAT3-DBD 的小分子化合物inS3-54（圖2）。采用[32P]標(biāo)記的DNA 雙鏈探針及電泳遷移率變動(dòng)分析表明，inS3-54 選擇性抑制STAT3 與DNA 的結(jié)合，而對(duì)STAT1 無(wú)影響。與非癌細(xì)胞相比，inS3-54 優(yōu)先抑制癌癥細(xì)胞的增殖，抑制STAT3 下游靶基因的表達(dá)和STAT3 原位結(jié)合染色質(zhì)。因?yàn)閕nS3-54 不與SH2 結(jié)構(gòu)域相連接，不抑制STAT3 二聚化，但可以抑制STAT3 與基因組DNA 的結(jié)合。inS3-54 代表了一種新型探針，對(duì)于開發(fā)靶向STAT3的DBD 域特異性抑制劑具有積極意義。

圖2 化合物inS3-54 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Buettner 等[16]為了證明化合物C48（圖3）可作為STAT3 的選擇性抑制劑，使用定點(diǎn)誘變和多種生化技術(shù)，探明C48 將STAT3 中的Cys468 烷基化的過(guò)程。進(jìn)一步研究證明，C48 會(huì)在STAT3 過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系中阻止STAT3 核易位，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明，STAT3 中的Cys468 代表了一個(gè)新的治療干預(yù)位點(diǎn)，并推測(cè)烷基化有望成為STAT3 相關(guān)類型癌癥的潛在治療方法。

圖3 化合物C48 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.4 靶向SH2 結(jié)構(gòu)域

Cheng 等[17]研究化合物6-OAP(圖4)與肺癌細(xì)胞的作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該化合物在H1975 和A549 細(xì)胞中以劑量和時(shí)間依賴性的方式抑制了STAT3 的轉(zhuǎn)錄(抑制位點(diǎn)Tyr705)，進(jìn)而抑制由IL-6 等細(xì)胞因子誘導(dǎo)的STAT3 的活化、磷酸化與二聚體的形成。6-OAP 在STAT3 的SH2 結(jié)構(gòu)域與Ser611/Ser613/Arg609 形成氫鍵，阻礙IL-6 誘導(dǎo)的STAT3 磷酸化，對(duì)肺癌細(xì)胞和對(duì)S 期激酶相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄有抑制作用。藥理實(shí)驗(yàn)表明，6-OAP 抑制靜脈注射肺癌細(xì)胞的SCID 小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。6-OAP 的效果優(yōu)異，毒副作用較小，有望進(jìn)一步挖掘其藥用價(jià)值。

圖4 化合物6-OAP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Schust 等[18]從化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)模擬篩選得到化合物Stattic（圖5）。Stattic 能有效抑制STAT3的SH2 結(jié)構(gòu)域，對(duì)STAT3 的激活、二聚化和核易位等關(guān)鍵步驟有阻滯作用。將MDA-MB-231 和MDA-MB-435S 細(xì)胞在指定濃度下用Stattic 處理2 h，對(duì)STAT3、p-STAT3 和其他信號(hào)分子(JAK1/JAK2 等)的全細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，證明了Stattic 對(duì)STAT3 的磷酸化有顯著的抑制效應(yīng)，且其特異選擇性較高，有潛力成為高效的STAT3 抑制劑。

圖5 化合物Stattic 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Chen 等[19]通過(guò)傳統(tǒng)的有機(jī)合成方法得到了化合物HJC0152（圖6），發(fā)現(xiàn)其對(duì)人乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞顯示出比氯硝柳胺相似或更高的效力。經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾后（將苯環(huán)上的烷氧基改為氨基）的HJC0152 顯示出優(yōu)異的水溶性，與氯硝柳胺相比提高了約3 300 倍。在光學(xué)顯微鏡的觀察下，將MDAMB-231 乳腺癌細(xì)胞用化合物HJC0152 處理48 h，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期進(jìn)程被抑制，細(xì)胞凋亡變得更加常見。在帶有乳腺腫瘤異種移植物的裸鼠中，HJC0152 顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。從這些結(jié)果中推測(cè)，具有更好水溶性的化合物HJC0152 有望被開發(fā)成用于癌癥治療的口服生物利用劑。

圖6 化合物HJC0152 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Shin 等[20]首次報(bào)道了隱丹參酮（圖7）抗癌活性是通過(guò)抑制STAT3 實(shí)現(xiàn)的。隱丹參酮可快速抑制DU145 人前列腺癌細(xì)胞中的STAT3 的Tyr705磷酸化，降低STAT3 下游靶蛋白的表達(dá)。隱丹參酮抑制STAT3 磷酸化是由獨(dú)立于JAK2 的機(jī)制引起的，且不影響上游酪氨酸激酶。隱丹參酮可直接與STAT3 分子結(jié)合（STAT3 的SH2 結(jié)構(gòu)域），抑制其二聚化，并下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1、Bcl-xL 和survivin 的表達(dá)，使G0-G1 期的細(xì)胞蓄積，降低STAT3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。這些結(jié)果表明，隱丹參酮是良好的STAT3 靶向抑制劑。

圖7 隱丹參酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Iwamoto 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，苯達(dá)莫司汀（BENDA，圖8）作為一種烷化劑，對(duì)多種癌癥具有臨床活性，包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和多發(fā)性骨髓瘤等。BENDA 可以選擇性結(jié)合細(xì)胞中的STAT3 并抑制其活性，BENDA 在體外選擇性地拮抗STAT3-SH2 結(jié)構(gòu)域（IC50=7.4 μmol/L），而不是其他含有SH2 的蛋白質(zhì)（拮抗STAT1-SH2 的IC50為60 μmol/L）。BENDA 結(jié)合到STAT3 中的半胱氨酸殘基Cys550 和Cys712 位置上，從而抑制SH2 與相應(yīng)的p-Tyr 肽的結(jié)合。

圖8 苯達(dá)莫司汀的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Chang 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 抑制劑BBI608（圖9）是降低EGFR 陽(yáng)性肺癌細(xì)胞系細(xì)胞活力的潛在藥物。BBI608 可降低組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a 介導(dǎo)的表皮生長(zhǎng)因子受體3 表達(dá)，抑制EGFR陽(yáng)性肺癌（包括EGFR E746-A750 HCC827、WTA549 和T790 M H1975）的細(xì)胞活力。在與阿法替尼的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，BBI608 更為明顯地降低了A549和H1975 細(xì)胞的生存能力，并降低了A549 的細(xì)胞遷移。因此，BBI608 極有潛力成為EGFR 陽(yáng)性肺癌的治療藥物。

研究表明，STAT3 在各種類型的癌癥中被組成性激活，并且直接參與癌細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)。Shastri 等[23]對(duì)骨髓增生異常綜合征（MDS）和急性髓性白血?。ˋML）患者的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)STAT3 存在異常激活現(xiàn)象，而敲除STAT3 后，體內(nèi)白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)也受到了抑制，各類癌基因在惡性細(xì)胞中的表達(dá)也隨之下降。

3 結(jié)語(yǔ)

STAT3 在多種實(shí)體瘤和血液性腫瘤中會(huì)過(guò)度激活，對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著重要影響。因此，STAT3 作為治療腫瘤的新靶點(diǎn)已被研究人員所認(rèn)同；同時(shí)，STAT3 抑制劑對(duì)抗炎免疫有重要作用，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病研究中頗有成效。21 世紀(jì)以來(lái)，STAT3 抑制劑的臨床前研究不斷深入，但進(jìn)入臨床使用的藥物卻很少。因此，研發(fā)高效、低毒的STAT3 抑制劑仍將是一種挑戰(zhàn)。近年來(lái)，研究人員將多種天然產(chǎn)物（如雷公藤紅素等）作為先導(dǎo)化合物，合成了更有效的小分子化合物，通過(guò)不斷篩選、評(píng)價(jià)和選擇活性大、特異性強(qiáng)的STAT3抑制劑，將中西醫(yī)藥物治療與放療、化療結(jié)合，這可能是今后的STAT3 研究方向之一，為抗腫瘤以及抗炎免疫研究提供新方向。